CN114262748B

CN114262748B - 一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用

Info

Publication number: CN114262748B
Application number: CN202111681576.5A
Authority: CN
Inventors: 王振江; 唐翠明; 林森; 罗国庆; 钟建武; 陈莲
Original assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: CN114262748A

Abstract

本发明公开了一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用。本发明利用荧光SSR技术，通过对桑树基因组序列设计开发出的300对SSR引物进行筛选，确认标记M20541和M22794的核心引物能够分别对果桑新品种‘粤椹143’扩增出三条特异性条带，可以分别从果桑品系中鉴别出果桑新品种‘粤椹143’，可用于果桑新品种‘粤椹143’的快速鉴定和检测。本发明通过直接检测‘粤椹143’的M20541标记和/或M22794标记对其进行鉴定，克服了外部形态特征对其鉴定的不确定性，操作简单，检测效率高，结果可靠直观，为果桑新品种‘粤椹143’的保护提供了科学的技术保障，本发明有利于该品种的推广利用和保护。

Description

一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及到品种资源的鉴定和种质创新技术领域，具体涉及一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用。

背景技术

桑果是一种特色优异的水果资源，是第三代水果的代表，目前已被国家卫生部列为“既是食品又是药品”的名单,近年来来随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，桑果的营养健康价值日益为社会所关注，桑果作为一种新兴的水果品种因其具有的独特口味，丰富的营养和较高的活性物质而日益受到人们的喜爱，已经逐渐走进普通百姓的家庭里，被市民所接受喜爱。除鲜食外，桑果被加工开发成桑果汁、桑果酒、桑果酱、桑果红色素、桑果醋等多种产品，桑果产业初具规模，并呈现出良好的多元化发展势头。

‘粤椹143’是由广东桑种(Morus atropurpurea Roxb.)资源‘塘10’为母本，‘航诱18’为父本，杂交选育而成的果桑新品种，2018年1月通过农业农村部品种保护办公室审查登记，授予植物新品种权(CNA20160061.4)。其特征在于：幼叶花色苷显色弱，顶端叶着生姿态斜上，叶柄着生姿态上举；植株叶片形状全叶，心脏形，深绿色，叶尖长尾状，叶缘粗圆齿，叶基深心形；叶面平展，光滑，光泽性强，叶柄细长；枝条皮色灰褐，节间直；叶序为絮乱叶序；皮孔较密，小，圆形；冬芽形状为卵圆形，颜色棕褐色，芽着生状态腹离，副芽大而多。‘粤椹143’经多地引种生产实践证明，该品种果形端正整齐，商品果率高，果较大，成熟后不易落果，盛产期亩产果量1600kg以上，同时亩产叶量1800kg左右，适宜鲜食开发，具有极高的推广应用价值。

‘粤椹143’是近年来新育成并获得国家植物新品种授权的果桑新品种，因其具有的产量高、品质优的特点，近年来各地不断涌现出其他品种假冒该品种，但因苗期外部形态特征难以区分辨别品种的真实性，难以有效的监督和仲裁，给该品种的开发利用带来了较大的影响。因此需找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分该品种的简单、快速和有效的鉴别技术非常急需。

传统的果桑新品种鉴定主要是以表型性状为基础，受环境影响较大、稳定性差、测试周期长，严重影响了新品种鉴定的有效性和权威性。分子标记技术因其具有多态性高、测试周期短、不受环境影响等特性，成为品种鉴定和保护的未来发展方向。其中简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)具有共显性、重复性好、易检测、操作简单等优点，因此，SSR分子标记在果桑品种特异性评价与保护中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种果桑新品种‘粤椹143’的SSR分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用，其操作简单，可用于果桑新品种‘粤椹143’真实性的鉴定，当出现品种假冒或有争议时可以有效的监督和仲裁。

本发明的第一个目的是提供一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的SSR分子标记，包括SSR分子标记M20541和/或M22794；所述的SSR分子标记M20541的重复基序为(CT)n，其中n≥6，其右侧序列如SEQ ID NO.6所示，其左侧序列如SEQ ID NO.5所示；所述的SSR分子标记M22794的重复基序为(AG)n，其中n≥9，其右侧序列如SEQ ID NO.8所示，其左侧序列如SEQID NO.7所示。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的SSR分子标记的核心引物组，包括针对SSR分子标记M20541的引物和/或针对SSR分子标记M22794的引物：

所述的针对SSR分子标记M20541的引物：

M20541-F：5’-CACTGAATCTTCATCTTCCTCAAA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

M20541-R：5’-GGCATATGGGTATGTTTCATTTT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

所述的针对SSR分子标记M22794的引物：

所述的引物M20541-F的5’端标记有荧光报告基团；

所述的针对SSR分子标记M22794的引物：

M22794-F：5’-ACAATTACGTGGAGAGCAAGAAA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

M22794-R：5’-GTCCCAAGAACCCAGATAATTG-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

所述的引物M22794-F的5’端标记有荧光报告基团。

优选，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX。

本发明的第三个目的是提供一种果桑品种‘粤椹143’的快速检测试剂盒，包括上述的SSR分子标记的核心引物组。

优选，所述的快速检测试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和ddH₂O。

本发明的第四个目的是提供一种利用SSR分子标记鉴定果桑品种‘粤椹143’的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测果桑样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用上述的引物对M20541-F/M20541-R和/或M22794-F/M22794-R进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)中的PCR扩增产物进行分型，对分型结果进行条带判别；若以引物对M20541-F/M20541-R为引物扩增得到的PCR扩增产物有131bp、133bp和135bp三条特异性条带，以引物对M22794-F/M22794-R为引物扩增得到的PCR扩增产物有156bp、162bp和164bp三条特异性条带，则表明待测果桑样品为‘粤椹143’，否则，则表明待测果桑样品为非‘粤椹143’。

优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系为20μL，包括：50ng/μLDNA模板0.5μL、10×PCRbuffer 2μL、25mM MgCl₂2μL、10mM dNTPs 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL和ddH₂O 13.8μL。

优选，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，每个循环降1℃，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min。

本发明的第五个目的是提供上述的SSR分子标记或SSR分子标记的核心引物组或快速检测试剂盒在鉴定果桑品种‘粤椹143’中的应用。

本发明利用荧光SSR技术，通过对桑树转录组序列设计开发出的300对SSR引物进行筛选，确认SSR分子标记M20541的核心引物M20541-F/M20541-R能够对果桑新品种‘粤椹143’扩增得到的PCR扩增产物有131bp、133bp和135bp三条特异性条带，以引物对M22794-F/M22794-R为引物扩增得到的PCR扩增产物有156bp、162bp和164bp三条特异性条带，则表明待测果桑样品为‘粤椹143’，否则，则表明待测果桑样品为非‘粤椹143’，可以分别从果桑品系(尤其是广东桑种)中鉴别出果桑新品种‘粤椹143’，可用于果桑新品种‘粤椹143’的快速鉴定和检测。本发明通过大量实验数据得到了扩增出‘粤椹143’特异性条带的特异性引物，通过直接检测‘粤椹143’的M20541标记和/或M22794标记对其进行鉴定，克服了外部形态特征对其鉴定的不确定性，操作简单，检测效率高，结果可靠直观，为果桑新品种‘粤椹143’的保护提供了科学的技术保障，本发明有利于该品种的推广利用和保护。

附图说明

图1为SSR分子标记M20541核心引物扩增‘粤椹143’及42个亲缘、表型相近的果桑品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤椹143、S2为塘10(母本)、S3为航诱18(父本)、S4为Kq10、S5为Kq12、S6为Lun40、S7为Lun12、S8为Lun6、S9为Lun5、S10为Wli2、S11为Wli3、S12为Wli5、S13为Wli7、S14为Wch1、S15为Wch2、S16为Wch5、S17为Gxi1、S18为Gxi2、S19为Wzhi1、S20为Wzhi2、S21为Wzhi3、S22为Cy1、S23为Cy3、S24为Cy4、S25为Wzhu1、S26为Wzhu2、S27为Wzhu3、S28为Zch1、S29为Zch2、S30为Zch5、S31为Zch7、S32为Gxuan04-132、S33为Gxuan04-136、S34为Gxuan04-138、S35为Gxuan04-140、S36为Ctan4、S37为Ctan7、S38为Ctan10、S39为Wsh3、S40为Wsh5、S41为Nxue3、S42为Nxue7、S43为Nxue9。

图2为SSR分子标记M22794核心引物扩增‘粤椹143’及42个亲缘、表型相近的果桑品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤椹143、S2为塘10(母本)、S3为航诱18(父本)、S4为Kq10、S5为Kq12、S6为Lun40、S7为Lun12、S8为Lun6、S9为Lun5、S10为Wli2、S11为Wli3、S12为Wli5、S13为Wli7、S14为Wch1、S15为Wch2、S16为Wch5、S17为Gxi1、S18为Gxi2、、S19为Wzhi1、S20为Wzhi2、S21为Wzhi3、S22为Cy1、S23为Cy3、S24为Cy4、S25为Wzhu1、S26为Wzhu2、S27为Wzhu3、S28为Zch1、S29为Zch2、S30为Zch5、S31为Zch7、S32为Gxuan04-132、S33为Gxuan04-136、S34为Gxuan04-138、S35为Gxuan04-140、S36为Ctan4、S37为Ctan7、S38为Ctan10、S39为Wsh3、S40为Wsh5、S41为Nxue3、S42为Nxue7、S43为Nxue9。.

图3为SSR分子标记M20541核心引物扩增20个育成的果桑新品种、生产推广应用新品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤椹143、S2为粤椹大10、S3为粤椹74、S4为粤椹123、S5为粤椹145、S6为粤椹28、S7为粤椹33、S8为粤椹201、S9为红果2号、S10为云桑1号、S11为云桑2号、S12为台湾长果桑、S13为46C019、S14为72C002、S15为白珍珠、S16为白玉王、S17为黑珍珠、S18为桂花蜜、S19为新疆白桑、S20为白椹2号。

图4为SSR分子标记M22794核心引物扩增20个育成的果桑新品种、生产推广应用新品系基因组DNA的SSR分型图；其中S1为粤椹143、S2为粤椹大10、S3为粤椹74、S4为粤椹123、S6为粤椹28、S7为粤椹33、S8为粤椹201、S9为红果2号、S10为云桑1号、S11为云桑2号、S12为台湾长果桑、S13为46C019、S14为72C002、S15为白珍珠、S16为白玉王、S17为黑珍珠、S18为桂花蜜、S19为新疆白桑、S20为白椹2号。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达到预定发明目的所采取的技术手段和功效，以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1果桑新品种‘粤椹143’特异性引物序列的筛选获得

1、SSR引物选择

利用MISA软件对桑树基因组数据库中的基因组序列进行检索，检索出基因组序列中SSR位点，检索的SSR基序重复单元长度为2～6个核苷酸，分别设置2个、3个、4个、5个、6个核苷酸的最少搜索重复次数为6、5、5、4、4次，且SSR位点侧翼序列的长度≥150bp，根据搜索到的SSR位点用Primer3v2.3.4(http://primer3.sourcego-rge.net)软件设计SSR引物，设计标准为：引物长度为18-25bp，退火温度为57-63℃，GC含量为40-70％，PCR产物的长度为100-300bp，随机选取能与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对的SSR位点合成出300对引物，每对引物由一个上游引物A和一个下游引物B组成。引物序列由深圳华大基因科技有限公司合成。

2、果桑品种DNA的提取

以果桑新品种‘粤椹143’、母本‘塘10’、父本‘航诱18’及42个亲缘、表型相近的广东桑种其他果桑优良品系，共43个(序号1-43，其中包括具有‘粤椹143’亲本血统的13个果桑品系，这13个果桑品系与‘粤椹143’亲缘关系较近；其余27个果桑品系与‘粤椹143’表型相近)进行初步筛选。初步筛选所用的果桑品系具体见表1(取自国家桑树种质资源圃-华南分圃)。

表1初步筛选所用的43个果桑品系

具体筛选步骤如下：

利用改良的CTAB法提取果桑新品种‘粤椹143’及同为广东桑种的其他42个果桑优良品系(见表1)的DNA，DNA提取具体步骤如下：

(1)配制CTAB提取液(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammoniumbromide)的配方为：2％CTAB，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，1.4M NaCl，TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)；

(2)将1g材料(尽量选取幼嫩材料)放入研钵中，液氮研磨至粉末；

(3)将研磨后的材料加入10mL离心管中，加入4mL CTAB提取液和80μLβ-巯基乙醇(已在65℃中预热)混匀后65℃水浴45min，中间混匀3～4次；

(4)加入1mL 5M KAc，冰浴20min；

(5)加入4mL氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀乳化10min；

(6)室温下12000rpm离心10min，离心后将上清液转移至一新的10mL离心管中；

(7)取上清液并加入1/10～1/5体积的3M NaAc(pH 5.2)翻转混匀，加入等体积的异丙醇，混匀至出现DNA沉淀；

(8)沉淀中加入1mL 75％乙醇漂洗3～4次，并用无水乙醇漂洗1次；DNA沉淀，晾干；

(9)加入100μL含10μg/ml RNaseA的TE缓冲液溶解沉淀，37℃水浴1h以降解RNA；

(10)用电泳法检测质量，用分光光度计法检测DNA浓度，调节DNA浓度为50ng/μL，保存于-20℃。

3、PCR扩增

以步骤2提取的桑树基因组DNA为模版，利用SSR荧光标记检测技术进行PCR扩增，引物包括一个5’端标记有荧光报告基团(FAM、HEX、TAMRA、或ROX，本发明中使用HEX荧光标记)的上游引物和一个下游引物，所述上游引物为在步骤1设计合成的上游引物，所述下游引物为步骤1设计合成的下游引物。5’端标记有荧光报告基团的上游引物引导的PCR扩增产生带有荧光的PCR产物。

PCR反应总体系为20μL，其中，50ng/μLDNA模板0.5μL，10×PCRbuffer 2.0μL，25mMMgCl₂2.0μL，10mM dNTPs 0.5μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，ddH₂O 13.8μL。

PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃(每个循环降1℃)退火30s，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min，得到扩增产物。

4、多态性引物的筛选

上述步骤3扩增产物取2.5μL，加入1.5μL Loading Buffer混匀上样，2％的琼脂糖凝胶电泳25min后进行条带检测，筛选有扩增条带的产物用于测序分型。将上述步骤筛选到的有扩增产物条带的产物稀释到0.5ng以内，取0.5μL至含有liz500的Hidi中，用3730XLDNA测序仪(ABI，USA)进行分型，分型结果用GeneMarker(soft Genetics LLC，USA)进行条带判别。

5、数据分析

筛选结果显示，上述步骤1合成的300对引物中共筛选出124对多态性引物；进一步选择重复性、稳定性好，能够对果桑新品种‘粤椹143’扩增出特异性等位位点的核心引物，最终得到引物对M20541-F/M20541-R(M20541-F：5’-CACTGAATCTTCATCTTCCTCAAA-3’，如SEQID NO.1所示，M20541-R：5’-GGCATATGGGTATGTTTCATTTT-3’，如SEQ ID NO.2所示)和引物对M22794-F/M22794-R(M22794-F：5’-ACAATTACGTGGAGAGCAAGAAA-3’，如SEQ ID NO.3所示，M22794-R：5’-GTCCCAAGAACCCAGATAATTG-3’-3’，如SEQ ID NO.4所示)可作为鉴定‘粤椹143’的特异性核心引物。核心引物M20541-F/M20541-R对应的SSR分子标记为M20541标记，其重复基序为(CT)n，n≥6，该M20541标记的右侧序列如SEQ ID NO.6所示，左侧序列如SEQID NO.5所示。核心引物M22794-F/M22794-R对应的SSR分子标记为M22794标记，其重复基序为(AG)n，n≥6，该M22794标记的右侧序列如SEQ ID NO.8所示，左侧序列如SEQ ID NO.7所示。

以SSR荧光标记引物M20541-F/M20541-R为引物，果桑新品种‘粤椹143’在M20541标记的扩增产物为131bp(如SEQ ID NO.9所示)、133bp(如SEQ ID NO.10所示)和135bp(如SEQ ID NO.11所示)三条特异性条带，以SSR荧光标记引物M22794-F/M22794-R为引物，果桑新品种‘粤椹143’在M22794标记的扩增产物为156bp(如SEQ ID NO.12所示)、162bp(如SEQID NO.13所示)和164bp(如SEQ ID NO.14所示)三条特异性条带，仅用SSR荧光标记引物M22794-F/M22794-R或M20541-F/M20541-R就可以从‘粤椹143’及其42个亲缘、表型相近的果桑品系中鉴别出果桑新品种‘粤椹143’(图1和2)，指纹数据见表2。

表2对引物分别对43个果桑品系毛细管电泳条带统计

6、引物的进一步验证

对筛选得到的2对鉴定‘粤椹143’的特异性核心引物M20541-F/M20541-R、M22794-F/M22794-R进行进一步地验证，选取19个目前全国育成的果桑新品种及在生产上具有一定面推广应用的果桑品系与‘粤椹143’同时进行扩增检测，DNA提取、扩增及检测方法同上，结果发现，这2对特异性核心引物均可以将‘粤椹143’与其他品种区分开(图3和4)，‘粤椹143’及其他品种的扩增特异性等位位点如表3所示。

表3验证所用育成的果桑新品种、生产推广应用新品系毛细管电泳条带统计

由上述表2和表3结果可以看出，SSR分子标记M20541和M22794均具有高度的多态性，均能够快速的从42个亲缘、表型相近的果桑品系和20个育成的果桑新品种、生产推广应用新品系中准确鉴定出‘粤椹143’。但考虑到未来可能会有更多新品种出现，所以为了鉴定的科学性，本发明建议采用以上2种SSR分子标记的核心引物同时进行检测，若2对SSR荧光标记引物扩增得到的结果与本发明一致，则可以鉴定该品种为桑果新品种‘粤椹143’。

在获取鉴定‘粤椹143’特异性分子标记的过程中，本发明首先重视了引物的获取，从桑树基因组数据库中随机设计获取了300对SSR引物，以便客观的评价品种特性。引物筛选时对果桑品系做了适当选取，首先用42个亲缘、表型相近的果桑品系进行初步筛选，这些品系与‘粤椹143’在表型性状上较相似，通过表型鉴定存在一定困难，因此在这些品系中筛选得到能够对果桑新品种‘粤椹143’扩增出特异性条带的特异性核心引物具有十分重要的意义。在初步筛选获得特异性核心引物的基础上，通过选取20个育成的果桑新品种、生产推广应用新品系进行验证，带型结果与前面表现一致，能够快速准确的从中鉴定出‘粤椹143’，表明这对引物其特异性和稳定性较好。

上述方法中采用特异性核心引物M20541-F/M20541-R和M22794-F/M22794-R为‘粤椹143’的快速、准确检测、鉴定提供了较好的保障。

上述特异性核心引物M20541-F/M20541-R和M22794-F/M22794-R也可直接作为快速检测试剂盒的一部分，用于快速鉴定桑果新品种‘粤椹143’。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

需要特别说明的是，以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

<120> 一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cactgaatct tcatcttcct caaa 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcatatggg tatgtttcat ttt 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaattacgt ggagagcaag aaa 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcccaagaa cccagataat tg 22

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 5

cactgaatct tcatcttcct caaaagtatt c 31

<210> 6

<211> 88

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 6

cacacatcct tctaaagtca gctataagct cactaatttc ttcccagatt cttgatagac 60

tcagaaaaat gaaacatacc catatgcc 88

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 7

acaattacgt ggagagcaag aaagagagaa ttttc 35

<210> 8

<211> 103

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 8

aatgggagat tagcaggccg ttgggtttct tggtgggact gccatttgcg ttggtggcag 60

tggttttgtc tgtcgtgggt gcaattatct gggttcttgg gac 103

<210> 9

<211> 131

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 9

cactgaatct tcatcttcct caaaagtatt cctctctctc tctcacacat ccttctaaag 60

tcagctataa gctcactaat ttcttcccag attcttgata gactcagaaa aatgaaacat 120

acccatatgc c 131

<210> 10

<211> 133

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 10

cactgaatct tcatcttcct caaaagtatt cctctctctc tctctcacac atccttctaa 60

agtcagctat aagctcacta atttcttccc agattcttga tagactcaga aaaatgaaac 120

atacccatat gcc 133

<210> 11

<211> 135

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 11

cactgaatct tcatcttcct caaaagtatt cctctctctc tctctctcac acatccttct 60

aaagtcagct ataagctcac taatttcttc ccagattctt gatagactca gaaaaatgaa 120

acatacccat atgcc 135

<210> 12

<211> 156

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 12

acaattacgt ggagagcaag aaagagagaa ttttcagaga gagagagaga gagaatggga 60

gattagcagg ccgttgggtt tcttggtggg actgccattt gcgttggtgg cagtggtttt 120

gtctgtcgtg ggtgcaatta tctgggttct tgggac 156

<210> 13

<211> 162

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 13

acaattacgt ggagagcaag aaagagagaa ttttcagaga gagagagaga gagagagaga 60

atgggagatt agcaggccgt tgggtttctt ggtgggactg ccatttgcgt tggtggcagt 120

ggttttgtct gtcgtgggtg caattatctg ggttcttggg ac 162

<210> 14

<211> 164

<212> DNA

<213> 桑(Morus atropurpurea)

<400> 14

acaattacgt ggagagcaag aaagagagaa ttttcagaga gagagagaga gagagagaga 60

gaatgggaga ttagcaggcc gttgggtttc ttggtgggac tgccatttgc gttggtggca 120

gtggttttgt ctgtcgtggg tgcaattatc tgggttcttg ggac 164

Claims

1.一种用于鉴定果桑品种‘粤椹143’的SSR分子标记，其特征在于，包括SSR分子标记M20541和/或M22794；所述的SSR分子标记M20541的重复基序为(CT)n，其中n≥6，其右侧序列如SEQ ID NO.6所示，其左侧序列如SEQ ID NO.5所示；所述的SSR分子标记M22794的重复基序为(AG)n，其中n≥9，其右侧序列如SEQ ID NO.8所示，其左侧序列如SEQ ID NO.7所示。

2.一种用于鉴定果桑品种‘粤椹143’的SSR分子标记的核心引物组，其特征在于，包括针对SSR分子标记M20541的引物和/或针对SSR分子标记M22794的引物：

所述的针对SSR分子标记M20541的引物：

M20541-F：5’-CACTGAATCTTCATCTTCCTCAAA-3’；

M20541-R：5’-GGCATATGGGTATGTTTCATTTT-3’；

所述的引物M20541-F的5’端标记有荧光报告基团；

所述的针对SSR分子标记M22794的引物：

M22794-F：5’-ACAATTACGTGGAGAGCAAGAAA-3’；

M22794-R：5’-GTCCCAAGAACCCAGATAATTG-3’；

所述的引物M22794-F的5’端标记有荧光报告基团。

3.根据权利要求2所述的用于鉴定果桑品种‘粤椹143’的SSR分子标记的核心引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TAMRA或ROX。

4.一种用于鉴定果桑品种‘粤椹143’的快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的SSR分子标记的核心引物组。

5.一种利用SSR分子标记鉴定果桑品种‘粤椹143’的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测果桑样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别利用权利要求2或3所述的引物对M20541-F/M20541-R和/或M22794-F/M22794-R进行PCR扩增；

6.根据权利要求5所述的利用SSR分子标记鉴定果桑品种‘粤椹143’的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增，其反应体系为20μL，包括：50ng/μL DNA模板0.5μL、10×PCRbuffer 2μL、25mM MgCl₂ 2μL、10mM dNTPs 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL和ddH₂O 13.8μL；步骤(2)所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，每个循环降1℃，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min。

7.权利要求2或3所述的核心引物组或权利要求4所述的快速检测试剂盒在鉴定果桑品种‘粤椹143’中的应用。