KR101258694B1 - 배 품종 식별용 ｓｃａｒ 마커 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 38의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트의 군으로부터 선택되는 8 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

배 품종 식별용 ＳＣＡＲ 마커 및 그 용도{SCAR marker for cultivar discrimination in pear and usage thereof}
본 발명은 배 품종의 식별을 위해 이용될 수 있는 분자 마커 및 그 용도에 관한 것이다.
배는 배나무의 열매로, 서양배와 중국배, 남방형 동양배로 나뉘는데 그 생김새와 맛이 각각 다르다. 한국에서는 남방형 동양배를 주로 재배하는데 삼한시대부터 재배한 기록이 있다. 또한, 배는 신수, 수진조생, 행수 등의 조생종과 신고, 장십랑, 풍수, 영산배, 황금배 등의 중생종, 감천배, 추황배, 금촌추, 만삼길, 화산 등의 만생종으로 구분할 수 있다. 배는 농림식품 수출품 중 단일 품목으로 인삼, 김치, 파프리카 다음으로 수출액이 많은 품목이다. 이러한 국내의 배 품종을 더욱 육성하고 보급하기 위해서는 품종의 관리 및 보호가 중요하다.
또한 국제식물신품종보호동맹(UPOV) 가입에 따라, 배가 품종보호 작물로 지정되면서, 육종된 배의 품종 보호조치가 필요하게 되었다. 따라서 배의 품종의 보호 위해서는 국내에서 육종되는 배의 품종에 대한 판별이 우선시 되어야 한다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
또한 과수 국내육성 품종들은 국내 내수용과 해외 수출용 모두 묘목상태로 공급되고 있어 형태적으로 품종 판별이 불가능하다. 그러므로 과수 묘목 선도업체 등에서 품종판별을 위한 분자마커 기술의 개발이 요구되고, 또한 계속되고 있다.
분자 마커들은 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 분자 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로, 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite)나 유전자 염기 서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.
RAPD(Random-Amplified Polymorphic DNA) 방법은 다양한 분석방법 중에 분석이 쉽고, 간편하기 때문에 가장 보편적으로 이용되고 있다. 그러나, 반응조건에 따라 결과가 달라질 수가 있어 재현성이 있는 실험 결과를 기대하기 어렵다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 RAPD 분석 결과에서 생성된 특이 DNA 밴드들을 클로닝(Cloning)과 시퀀싱(squencing) 과정을 거쳐 새로운 SCAR 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하는 방법을 이용한다. SCAR(Sequence Characterised Amplified Region)은 상기와 같은 과정을 통해 제작한 것으로, 보다 정확하고 세밀한 프라이머로 사용이 가능하다. 따라서 SCAR 마커는 다른 PCR 마커에 비하여 환경에 영향을 받지 않는 공용으로 이용될 수 있다.
이에 본 발명자들은 유통 묘목의 품종혼입 예방과 국내육성 품종의 보호권 강화를 위하여, 과수 묘목 선도업체 등에서 품종판별을 위한 분자마커 기술 개발의 요구가 증가함에 따라, 배의 품종 판별을 위해 효율적으로 이용될 수 있는 분자 마커를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간편하고 정확하고 재현성 있게 이용될 수 있는 배 품종 식별용 SCAR 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 SCAR 마커를 이용한 배 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 SCAR 마커를 포함하는 배 품종 식별용 키트를 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 38의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 SCAR 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SCAR 프라이머 세트 조성물을 이용한 배의 품종 식별 방법으로서,
a) 품종을 식별할 배로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 SCAR 프라이머 세트 조성물을 프라이머로 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 산물을 분석하는 단계를 포함하는 식별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SCAR 프라이머 세트 조성물, DNA 중합효소, dNTPs 및 PCR 반응용 완충용액을 포함하는 배 품종 식별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 SCAR 프라이머 세트 조성물을 이용하면 배 국내 육성 품종과 도입 품종을 정확히 구별할 수 있기 때문에, 유통 묘목의 품종혼입 예방 및 배 국내육성 품종의 보호권 강화에 기여할 수 있으며, 육성 품종의 수출 시 뿐만 아니라 국내 묘목의 유통 시 품종인증 기술로 활용 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 배 품종 식별용 SCAR 마커의 개발 과정을 보여준다.
도 2는 본 발명에 따른 배 품종 식별용 SCAR 마커를 이용한 PCR 결과를 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 결과를 보여준다. (M: 100bp DNA 래더(ladder), 1: 단배, 2: 금촌조생, 3: 황금배, 4: 조생황금, 5: 추황배, 6: 영산배, 7: 원황, 8: 화산, 9: 수황배, 10: 신일, 11: 만수, 12: 감로, 13: 선황, 14: 만풍, 15: 한아름, 16: 신천, 17: 미니배, 18: 진황, 19: 수영, 20: 녹수, 21: 만황, 22: 스위트스킨, 23: 슈퍼골드, 24: 창조, 25: 신화, 26: 국수, 27: 신흥, 28: 이십세기, 29: 천의천, 30: 신고, 31: 풍수, 32: 행수, 33: 신수, 34: 장십랑, 35: 만삼길, 36: 금촌추, 37: 군총조생, 38: 수진조생, 39: 조생적)
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명은 배의 품종을 구별하기 위해 이용될 수 있는 서열번호 1 내지 38의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 SCAR 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
보다 상세하게는, 본 발명에 따른 SCAR 마커는,
서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P123_279 프라이머 세트;
서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P561_331 프라이머 세트;
서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P561_372 프라이머 세트;
서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PH02_405 프라이머 세트;
서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK15_410 프라이머 세트;
서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PH15_452 프라이머 세트;
서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PT16_472 프라이머 세트;
서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PT06_509 프라이머 세트;
서열번호 17과 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PN11_516 프라이머 세트;
서열번호 19와 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK17_556 프라이머 세트;
서열번호 21과 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PN15_575 프라이머 세트;
서열번호 23과 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PT14_578 프라이머 세트;
서열번호 25와 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P270_593 프라이머 세트;
서열번호 27과 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PF07_594 프라이머 세트;
서열번호 29와 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PQ11_649 프라이머 세트;
서열번호 31과 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK15_672 프라이머 세트;
서열번호 33과 34의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK17_771 프라이머 세트;
서열번호 35와 36의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK10_514 프라이머 세트; 및
서열번호 37과 38의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK15_616 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배의 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물이다.
본 발명에서, “SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커”는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)나 AFLP(Amplification Fragment Length Polymorphism) 마커 밴드의 염기서열을 분석하여 제작한 것이며, ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 비해 증폭 환경에 비교적 둔감하고, 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종구별용 분자 마커로 인식되고 있다. 즉, 보다 정확하고 세밀한 프라이머로 사용이 가능하다.
또한 본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 따른 SCAR 마커에 의해 구별될 수 있는 배 품종은 국내 육성 품종 25종뿐만 아니라 도입 품종 14종을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 SCAR 마커는 배의 국내 육성 품종 식별을 위해 사용될 수 있다.
여기서, 상기 국내 육성 품종은 하기 표 1에 표시된 25종으로, 예를 들면 단배, 금촌조생, 황금배, 조생 황금, 추황배, 영산배, 원황, 화산, 수황배, 신일, 만수, 감로, 선황, 만풍, 한아름, 신천, 미니배, 진황, 수영, 녹수, 만황, 스위트스킨, 슈퍼골드, 창조 또는 신화이다.
또한, 상기 도입 품종은 하기 표 2에 표시된 14종으로, 예를 들면 국수, 신흥, 이십세기, 천의천, 신고, 풍수, 행수, 신수, 장십랑, 만삼길, 금촌추, 군총조생, 수진조생 또는 조생적이다.
번호 품종 번호 품종
1 단배 14 만풍
2 금촌조생 15 한아름
3 황금배 16 신천
4 조생황금 17 미니배
5 추황배 18 진황
6 영산배 19 수영
7 원황 20 녹수
8 화산 21 만황
9 수황배 22 스위트스킨
10 신일 23 슈퍼골드
11 만수 24 창조
12 감로 25 신화
13 선황
번호 품종 번호 품종
26 국수 33 신수
27 신흥 34 장십랑
28 이십세기 35 만삼길
29 천의천 36 금촌추
30 신고 37 군총조생
31 풍수 38 수진조생
32 행수 39 조생적
상기 배 39종 품종에 대하여 RAPD 분석을 통해 다형성 부위를 탐색하여 품종별로 비교하였으며, 이를 이용하여 품종을 간단하고 신속하게 판별하기 위한 마커를 개발하였다. 따라서 본 발명의 배 품종 식별용 SCAR 마커를 이용하면 DNA 레벨에서 유사 품종의 식별이 가능하다.
본 발명의 배 품종 식별용 SCAR 마커는, DNA 증폭을 위한 프라이머 세트로 이용되며, 바람직하게는 하기 표 3에 기재된 세트로 이용될 수 있다. 또한 하나 이상의 프라이머 세트를 조합하여 이용하면 보다 정확하게 배의 품종을 구별할 수 있다. 바람직하게는 4종 이상, 보다 바람직하게는 8종 이상의 프라이머 세트를 조합하여 이용하는 것이 좋다. 이 때, 하기 표 3에서 F는 포워드 프라이머(Forward primer), R은 리버스 프라이머(Reverse primer)를 나타낸다.
선발 RAPD 마커 SCAR 마커 서열번호 프라이머 염기서열(5'3') 증폭산물의 크기(bp)
UBC123_341 P123_279 1
2		 F: GTCTTTCAGGATCGAGTCACCAAG
R: TTCCTCTCAGCTACATCCTTTTGC		 279
UBC561_331 P561_331 3
4		 F: CATAACGACCCGATCCAGAAG
R: CATAACGACCATTCAAACATAAAA		 331
UBC561_372 P561_372 5
6		 F: CATAACGACCTTATAGTTTGGATT
R: CATAACGACCCCAGGACCAAA		 372
OPH02_509 PH02_405 7
8		 F: CATGAATAAGCTGTTTTCAAATGCCAC
R: CGTGAATATGGAAGTTCTAGCTCAGAA		 405
OPK15_410 PK15_410 9
10		 F: CTCCTGCCAATCCTAATCAACC
R: CTCCTGCCAACATTTGTGACGT		 410
OPH15_532 PH15_452 11
12		 F: TCCGCTTATTCCCATTACCATTTA
R: AATGGCGCAGCAAAATCACAGAAA		 452
OPT16_472 PT16_472 13
14		 F: GGTGAACGCTAAAAATACATTGGC
R: GGTGAACGCTTGTGATGATTTATT		 472
OPT06_764 PT06_509 15
16		 F: AGAGGGATACACAGACCAGGTACG
R: TTCAATTTCGTGTTTCAGTTTCCA		 509
OPN11_609 PN11_516 17
18		 F: CTGCATAACCATTTCCAACATTCA
R: CCTGGAGGTAAATGGATGAAGAAC		 516
OPK17_556 PK17_556 19
20		 F: CCCAGCTGTGGGAATCTCAAGTATCTA
R: CCCAGCTGTGCCCATGACCGATGACAG		 556
OPN15_598 PN15_575 21
22		 F: GAAGACAATTAGGCCAGCGGTTAC
R: CAGCGACTGTTAATGTGTATTTTG		 575
OPT14_629 PT14_578 23
24		 F: AATGCCGCAGATTAACCGTGAAAA
R: TCAAGACGTTAGATTGTTGGAGCA		 578
UBC270_593 P270_593 25
26		 F: TGCGCGCGGGCGAGCAATCAA
R: TGCGCGCGGGGTGGCGGG		 593
OPF07_820 PF07_594 27
28		 F: CCATAGTGATGCACGATTTCTTAC
R: GATATCCCCACCACTCAAGATAAC		 594
OPQ11_649 PQ11_649 29
30		 F: TCTCCGCAACTCATAAGAGATATT
R: TCTCCGCAACCTGGGGTAGGAGGG		 649
OPK15_672 PK15_672 31
32		 F: CTCCTGCCAAAAGAAAAAAAAGAA
R: CTCCTGCCAACAGAGAATTAGG		 672
OPK17_910 PK17_771 33
34		 F: CCCAGCTGTGCCCATATAAC
R: TGTCTTCATAAAGCAATGACTGG		 771
OPK10_753 PK10_514 35
36		 F: TCTTTTACGTGTGGGAGAGTGTTA
R: GTGCAACGTGTCATTATCTATTCAT		 514
OPK15_672 PK15_616 37
38		 F: CTTTCCAGCTTTCATTTCATCTTT
R: CTCCTGCCAACAGAGAATTAGG		 616
본 발명의 SCAR 마커가 배의 국내 육성 품종을 식별하는데 이용되는 경우, 상기 마커는 바람직하게는 P123_279 프라이머 세트; P561_331 프라이머 세트; P561_372 프라이머 세트; PH02_405 프라이머 세트; PK15_410 프라이머 세트; PH15_452 프라이머 세트; PT16_472 프라이머 세트; PT06_509 프라이머 세트; PN11_516 프라이머 세트; PK17_556 프라이머 세트; PT14_578 프라이머 세트; P270_593 프라이머 세트; PF07_594 프라이머 세트; PQ11_649 프라이머 세트; PK15_672 프라이머 세트; PK17_771 프라이머 세트; PK10_514 프라이머 세트; 및 PK15_616 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트, 보다 바람직하게는 8종 이상의 프라이머 세트를 조합하여 사용하는 것이 좋다.
한편 도 1은 본 발명에 따른 배 품종 식별용 SCAR 마커의 개발과정을 보여준다. 상세하게는, 본 발명의 분자마커는, 상기 배 39종 품종으로부터 게놈 DNA를 추출하여, RAPD 방법을 이용한 분석을 통해 다형성 부위를 탐색하여 품종별로 비교하여 유효한 DNA 특이 단편을 선발한 다음, 상기 선발된 DNA 특이 단편을 클로닝하여 염기서열을 분석(sequencing)하고, 그 표지에 특이적인 프라이머를 다시 합성함으로써 개발되었다. 이렇게 개발된 본 발명의 SCAR 마커는 간단하고, 신속하며, 재현성 및 신뢰도가 높은 분자 마커이다.
이 때, 상기 RAPD(Random-Amplified Polymorphic DNA) 방법은, 대개 9 내지 11 bp(base pair)의 짧은 임의의 프라이머(random primer)를 이용하여 2개의 염기서열에 의해 맞추어지는 유전체 부위만을 증폭시키게 된다. 이 방법은 PCR 산물들을 아가로오스 겔에 전기영동하여 단편들의 형태를 분석하기 때문에 매우 간단하나, 이를 이용하여 품종 육종의 선발 표지로 바로 이용하는 것은 효율성과 정확성 측면에서 어려움이 있으므로, 분석이 간편한 DNA 표지인 SCAR 마커로 전환하여 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 SCAR 프라이머 세트 조성물을 이용하여 배의 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명에 따른 배 품종의 식별 방법은,
a) 품종을 식별할 배로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
b) 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상술한 SCAR 프라이머 세트 조성물을 프라이머로 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 산물을 분석하는 단계를 포함한다.
상기 a) 단계에서 배의 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있다.
상기 b) 단계에서 SCAR 프라이머 세트 조성물은, 상기 표 1 및 표 2에 표시된 39개의 배 품종을 구별할 수 있는, 서열번호 1 내지 38의 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 SCAR 프라이머 세트 조성물이다. 상기 배 품종 식별용 SCAR 마커인 프라이머는 1세트 이상이 사용될 수 있고, 다수의 분자 마커가 동시에 사용되면 보다 정확하게 품종을 구별할 수 있다.
또한 상기 b) 단계에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해 수행될 수 있다. PCR은 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하거나 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 배에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에 따른 SCAR 마커, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 c) 단계에서 증폭된 DNA 산물의 분석은 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의한 것이면 가능하나, 예를 들면 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정의 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는 증폭된 DNA 산물을 겔 전기영동을 사용하여 분석하는데, 구체적으로는 아가로오스 겔 또는 아크릴아마이드 겔 상에서 증폭 산물을 전기영동하고, 에티디움 브로마이드(EtBr), 실버 염색(silver staining) 등에 의해 밴드를 확인할 수 있다.
본 발명의 따른 배 품종의 식별방법은 d) 분석된 증폭 산물을 배 품종 표준의 증폭 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 분자 마커에 의해 구별될 수 있는 39개의 배 품종은 각각 사용되는 SCAR 분자 마커에 의한 증폭 여부가 상이하고, 각 분자 마커에 의한 증폭 여부는 후술되는 표 5(국내 육성 품종) 및 표 6(도입 품종)에 표시된 바와 같다. 품종을 구별하고자 하는 배의 게놈 DNA로부터의 증폭 결과를 하기 표 5 및 6에 표시된 결과와 비교하여 품종을 구별할 수 있다.
본 발명은 또한, 상술한 본 발명에 따른 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물, DNA 중합효소(DNA polymerase), dNTPs 및 PCR 반응용 완충용액을 포함하는 배 품종 식별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에서, 상기 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물은 표 3에 기재된 서열번호 1 내지 38의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트일 수 있다.
또한 상기 PCR 반응용 완충용액은 당업계에서 통상적으로 공지된 조성을 가지며, 예를 들면 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 배 품종 식별용 키트는 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동에 필요한 성분들을 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 배 품종의 DNA 추출
상기 표 1에 기재된 국내 육성 품종 25종과, 표 2에 기재된 도입 품종 14종의 배로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 각 품종 배의 잎을 채취하여 깨끗이 씻고 물기를 제거한 다음 액체질소를 이용하여 곱게 마쇄하였다. 마쇄한 분말로부터 DNeasy plant mini kit(Qiagen)를 사용하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA는 0.8%의 아가로즈 겔(agarose gel) 상에 전기영동하여 확인하였고, DNA 양은 NanoDrop spectrophotometer(Thermo Scientific)로 정량한 후 10ngμL-1 의 농도로 희석하여 분석에 이용하였다.
실시예 2. RAPD 분석에 의한 품종별 특이 밴드의 검출
RAPD 마커 선발에는 오페론(Operon)과 University of British Columbia(UBC)에서 제조된 10개의 염기로 구성된 임의 프라이머를 이용하였다. PCR 반응은 40ng의 게놈 DNA, 1×PCR 버퍼(buffer), 5 pmol의 임의 프라이머(random primer), 200μM의 dNTP, 3mM MgCl2와 0.4 units Taq DNA 폴리머라제(Genetbio)를 첨가하여, 반응액을 12.5μL로 조정하여 사용하였다.
PCR 반응은 thermocycler(Bio-rad icycler PCR system)를 사용하여 다음과 같은 프로그램으로 수행하였다: 94℃에서 5분간 변성(denaturation), 94℃에서 45초 변성, 37℃에서 45초 어닐링(annealing); 그리고 72℃에서 2분간 연장(extension) 과정을 10회 반복 수행한 다음, 94℃에서 45초 변성, 42℃에서 45초 어닐링, 그리고 72℃에서 2분간 연장 과정을 30회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 최종 연장을 수행하였다.
증폭된 PCR 생성물은 1.4% 아가로스 겔에서 150V로 3시간 동안 전기영동하여 확인하였다.
실시예 3. 선발된 품종 특이 RAPD 마커의 클로닝과 염기서열 분석
선발된 품종 특이적인 RAPD 마커의 염기서열 분석을 위해 표지 선발에 사용되었던 프라이머로 PCR을 실시한 다음 전기영동하여 특이표지 DNA 밴드를 잘라내고 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 TOPO-TA cloning system(Invitrogen)을 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 넣어 E. coli TOP10에 형질전환시킨 후 DNA가 삽입된 균주를 선발하였다. 이 균주로부터 플라스미드 DNA를 분리하였고, 삽입된 DNA의 전 염기서열을 automated sequencer(CoreBioSystem)를 이용하여 분석하였다.
실시예 4. 품종 특이적 SCAR 마커 개발
선발된 RAPD 마커의 염기서열 분석 결과를 토대로 하여, 선발 프라이머의 10개의 염기를 포함하거나 포함하지 않는 21~27 염기 크기의 SCAR 프라이머를 작성하였다. 합성된 SCAR 프라이머를 각 품종에 적용하여 실용성을 검토하였다. PCR은 총 15μL 반응액에 40ng의 게놈 DNA(genomic DNA), 200μM dNTP, 5pmol SCAR 프라이머, 1× PCR 버퍼(buffer) 및 0.5 unit Hot-start Taq DNA polymerase(Genetbio)를 첨가하여 수행하였다. PCR 온도주기는 95℃에서 10분간 주형 DNA를 변성시킨 후 95℃에서 30초 변성, 58 ~ 67℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 1분간 연장 과정을 30회 반응시키고, 마지막 반응 후에는 72℃에서 5분간 처리한 후 반응을 종료하였다. 이 때, 각 SCAR 마커의 가장 바람직한 어닐링 온도를 표 4에 표시하였다.
상기 증폭된 DNA 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다. RAPD로부터 수득된 밴드에 기반하여 설계된 196개의 프라이머를 이용한 PCR 결과, 품종 구별이 가능한 SCR 마커는 서열번호 1 내지 38의 올리고뉴클레오티드로 구성된 19개 세트의 프라이머로 확인되었다. 본 발명의 SCAR 마커를 이용한 품종 판별 결과를 표 5 및 6에 나타내었다. 상기 19개 세트의 프라이머로부터 선택된 하나 이상의 세트를 조합하여 이용하면 보다 정확하게 배의 품종을 구별할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 배 품종 식별용 SCAR 마커를 이용한 PCR 결과를 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서, (a)는 배 국내육성 품종인 수황배, 선황, 한아름과, 도입품종인 천의천, 신고, 행수, 금촌추에서만 나타나는 279bp 크기의 P123_279 SCAR 마커를 보여준다. (b)는 배 국내육성 품종인 금촌조생, 조생황금, 추황배, 만수, 신천, 수영, 스위트스킨, 슈퍼골드와, 도입품종인 신흥, 천의천, 신고, 만삼길, 금촌추, 수진조생, 조생적에서만 나타나는 331bp 크기의 P561_331 SCAR 마커를 보여준다. (c)는 배 국내육성 품종인 금촌조생, 추황배, 원황, 선황, 만풍, 미니배, 진황, 녹수, 만황, 스위트스킨, 슈퍼골드와, 도입품종인 국수, 풍수, 행수, 신수, 금촌추, 수진조생에서만 나타나는 532bp 크기의 PH15_532 SCAR 마커를 보여준다. 그리고 (d)는 배 국내육성 품종인 단배, 금촌조생, 황금배, 영산배, 원황, 화산, 감로, 선황, 미니배, 수영, 신화와, 도입품종인 신고, 장십랑, 금촌추, 군총조생, 수진조생에서만 나타나는 472bp 크기의 PT16_472 SCAR 마커를 보여준다. (e)는 만수, 만풍, 신천, 진황, 만황, 스위트스킨, 천의천, 신수, 만삼길, 군총조생, 조생적에서만 나타나는 516bp 크기의 PN11_516 SCAR 마커를 보여준다.
SCAR 마커 Tm(℃) SCAR 마커 Tm(℃)
P123_279 63 PN15_575 64
P561_331 58 PT14_578 65
P561_372 63 P270_593 63
PH02_405 67 PF07_594 65
PK15_410 63 PQ11_649 65
PH15_452 63 PK15_672 63
PT16_472 65 PK17_771 60
PT06_509 65 PK10_514 63
PN11_516 63 PK15_616 63
PK17_556 63 　 　
Figure 112010084125511-pat00001
Figure 112010084125511-pat00002
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SCAR marker for cultivar discrimination in pear and usage thereof <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P123_279 forward primer <400> 1 gtctttcagg atcgagtcac caag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P123_279 reverse primer <400> 2 ttcctctcag ctacatcctt ttgc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P561_331 forward primer <400> 3 cataacgacc cgatccagaa g 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P561_331 reverse primer <400> 4 cataacgacc attcaaacat aaaa 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P561_372 forward primer <400> 5 cataacgacc ttatagtttg gatt 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P561_372 reverse primer <400> 6 cataacgacc ccaggaccaa a 21 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PH02_405 forward primer <400> 7 catgaataag ctgttttcaa atgccac 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PH02_405 reverse primer <400> 8 cgtgaatatg gaagttctag ctcagaa 27 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK15_410 forward primer <400> 9 ctcctgccaa tcctaatcaa cc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK15_410 reverse marker <400> 10 ctcctgccaa catttgtgac gt 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PH15_452 forward primer <400> 11 tccgcttatt cccattacca ttta 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PH15_452 reverse primer <400> 12 aatggcgcag caaaatcaca gaaa 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PT16_472 forward primer <400> 13 ggtgaacgct aaaaatacat tggc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PT16_472 reverse primer <400> 14 ggtgaacgct tgtgatgatt tatt 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PT06_509 forward primer <400> 15 agagggatac acagaccagg tacg 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PT06_509 reverse primer <400> 16 ttcaatttcg tgtttcagtt tcca 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PN11_516 forward primer <400> 17 ctgcataacc atttccaaca ttca 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PN11_516 reverse primer <400> 18 cctggaggta aatggatgaa gaac 24 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK17_556 forward primer <400> 19 cccagctgtg ggaatctcaa gtatcta 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK17_556 reverse primer <400> 20 cccagctgtg cccatgaccg atgacag 27 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PN15_575 forward primer <400> 21 gaagacaatt aggccagcgg ttac 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PN15_575 reverse primer <400> 22 cagcgactgt taatgtgtat tttg 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PT14_578 forward primer <400> 23 aatgccgcag attaaccgtg aaaa 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PT14_578 reverse primer <400> 24 tcaagacgtt agattgttgg agca 24 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P270_593 forward primer <400> 25 tgcgcgcggg cgagcaatca a 21 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker P270_593 reverse primer <400> 26 tgcgcgcggg gtggcggg 18 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PF07_594 forward primer <400> 27 ccatagtgat gcacgatttc ttac 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PF07_594 reverse primer <400> 28 gatatcccca ccactcaaga taac 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PQ11_649 forward primer <400> 29 tctccgcaac tcataagaga tatt 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PQ11_649 reverse primer <400> 30 tctccgcaac ctggggtagg aggg 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK15_672 forward primer <400> 31 ctcctgccaa aagaaaaaaa agaa 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK15_672 reverse primer <400> 32 ctcctgccaa cagagaatta gg 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK17_771 forward primer <400> 33 cccagctgtg cccatataac 20 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK17_771 reverse primer <400> 34 tgtcttcata aagcaatgac tgg 23 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK10_514 forward primer <400> 35 tcttttacgt gtgggagagt gtta 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK10_514 reverse primer <400> 36 gtgcaacgtg tcattatcta ttcat 25 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK15_616 forward primer <400> 37 ctttccagct ttcatttcat cttt 24 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR marker PK15_616 reverse primer <400> 38 ctcctgccaa cagagaatta gg 22

Claims (8)

  1. 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P123_279 프라이머 세트를 포함하는 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물로서,
    상기 SCAR 프라이머 세트 조성물은,
    서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P561_331 프라이머 세트;
    서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P561_372 프라이머 세트;
    서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PH02_405 프라이머 세트;
    서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK15_410 프라이머 세트;
    서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PH15_452 프라이머 세트;
    서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PT16_472 프라이머 세트;
    서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PT06_509 프라이머 세트;
    서열번호 17과 18의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PN11_516 프라이머 세트;
    서열번호 19와 20의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK17_556 프라이머 세트;
    서열번호 21과 22의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PN15_575 프라이머 세트;
    서열번호 23과 24의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PT14_578 프라이머 세트;
    서열번호 25와 26의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 P270_593 프라이머 세트;
    서열번호 27과 28의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PF07_594 프라이머 세트;
    서열번호 29와 30의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PQ11_649 프라이머 세트;
    서열번호 31과 32의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK15_672 프라이머 세트;
    서열번호 33과 34의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK17_771 프라이머 세트;
    서열번호 35와 36의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK10_514 프라이머 세트; 및 서열번호 37과 38의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PK15_616 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 7 이상의 프라이머 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 SCAR 프라이머 세트 조성물은 배의 국내 육성 품종 또는 도입 품종 식별용인 것을 특징으로 하는 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 국내 육성 품종은 단배, 금촌조생, 황금배, 조생 황금, 추황배, 영산배, 원황, 화산, 수황배, 신일, 만수, 감로, 선황, 만풍, 한아름, 신천, 미니배, 진황, 수영, 녹수, 만황, 스위트스킨, 슈퍼골드, 창조 및 신화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 도입 품종은 국수, 신흥, 이십세기, 천의천, 신고, 풍수, 행수, 신수, 장십랑, 만삼길, 금촌추, 군총조생, 수진조생 및 조생적으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 배 품종 식별용 SCAR 프라이머 세트 조성물.
  5. 품종을 식별할 배로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 청구항 1 기재의 SCAR 프라이머 세트 조성물을 프라이머로 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 산물을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배의 품종 식별 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 배의 품종 식별 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 품종 식별 방법은, 분석된 증폭된 산물을 배 품종 표준의 증폭된 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배의 품종 식별 방법.
  8. 청구항 1 기재의 SCAR 프라이머 세트 조성물, DNA 중합효소, dNTPs 및 PCR 반응용 완충용액을 포함하는 배 품종 식별용 키트.
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