KR101987669B1 - 배 품종 식별용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 배 품종의 식별을 위해 이용할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 모계 자원에 따른 배 품종의 식별이 가능하여, 이를 통한 우수자원 육종이 크게 기여할 수 있다.

Description

배 품종 식별용 조성물{A composition for cultivar discrimination in pear}
본 발명은 배 품종의 식별을 위해 이용할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
배는 배나무의 열매로, 서양배와 중국배, 남방형 동양배로 나뉘는데 그 생김새와 맛이 각각 다르다. 한국에서는 남방형 동양배를 주로 재배하는데 삼한시대부터 재배한 기록이 있다. 또한, 배는 신수, 수진조생, 행수 등의 조생종과 신고, 장십랑, 풍수, 영산배, 황금배 등의 중생종, 감천배, 추황배, 금촌추, 만삼길, 화산 등의 만생종으로 구분할 수 있다. 배는 농림식품 수출품 중 단일 품목으로 인삼, 김치, 파프리카 다음으로 수출액이 많은 품목이다. 이러한 국내의 배 품종을 더욱 육성하고 보급하기 위해서는 품종의 관리 및 보호가 중요하다.
또한 국제식물신품종보호동맹(UPOV) 가입에 따라, 배가 품종보호 작물로 지정되면서, 육종된 배의 품종 보호조치가 필요하게 되었다. 따라서 배의 품종의 보호 위해서는 국내에서 육종되는 배의 품종에 대한 판별이 우선시 되어야 한다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
이에 본 발명자들은 배의 엽록체 게놈을 이용하여 우수한 특정 자원을 모계로 하는 품종을 식별할 수 있는 유전자 및 이를 식별할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다.
특허공개공보 제2012-0069446
본 발명의 목적은 배 품종 식별용 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 배 품종 식별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 배 품종 식별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 배 품종 식별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 배로부터 유래된 엽록체 게놈 DNA를 주형으로 하고, 청구항 제1항의 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 증폭하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 얻어진 증폭 산물의 크기를 분석하여 배 품종을 결정하는 단계;
를 포함하는, 배 품종 식별 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 배 품종 식별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하면 특정 배 품종 및 이를 모계로 육종된 품종을 정확히 구별할 수 있기 때문에, 유통 묘목의 우수한 품종 선별 및 배 품종의 보호권 강화에 기여할 수 있으며, 육성 품종의 수출시뿐만 아니라 국내 묘목의 유통 시 품종인증 기술로 활용 가능하다.
도 1은 신고배와 원황배 ndhA 유전자에서 AA→TC 등 2개 SNPs가 있는 영역을 증폭하는 프라이머를 설정하는 과정을 나타낸 것이다(노란색 표기).
도 2는 ndhA 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 증폭한 배 29종과 사과 1종에 대한 밴드 크기 분석결과이다.
도 3은 ndhA 프라이머 세트로 증폭한 배 29종과 사과 1종에 대한 염기서열에서 다형성을 DNASTAR 프로그램 팩키지에서 CluterW method로 시퀀스들을 비교 분석하여 MegAlingn을 나타낸 결과이다.
도 4는 ndhA 프라이머로 증폭한 염기서열에 의한 배 29종과 사과 1종간 유연관계도를 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 배 품종 식별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 이용되는 배는 Pyrus pyrifolia , Pyrus ussuriensis , Pyrus bretschnederi 및 Pyrus calleryana 중 하나 이상이 선택될 수 있고, 보다 구체적으로는 Pyrus pyrifolia일 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트에 의해 식별될 수 있는 배 품종은 신고배의 모계에 해당하는 품종, 신고배 또는 신고배를 모계로 하여 육성된 품종일 수 있다. 신고배의 육성시 사용된 모계에 해당하는 품종은 천노천일 수 있고, 상기 신고배를 모계로 하여 육성된 품종은 황금, 감로, 선황, 신화, 영산, 한아름일 수 있고 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2에 해당하는 프라이머 세트는 배 엽록체 게놈의 ndhA(putative NADH dehydogenease A) 유전자 부위를 증폭할 수 있다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 산물의 크기는 배 품종에 따라서 상이하며, 신고배의 모계에 해당하는 품종, 신고배 또는 신고배를 모본으로 하여 육성된 품종은 864bp일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용함으로써 상기 품종 이외에 모본을 확인할 수 없는 품종의 경우에도 상기 프라이머 세트를 통해 신고배를 모계로 육성된 품종임을 예측할 수 있다.
또한 본 발명은,
(a) 배로부터 유래된 엽록체 게놈 DNA를 주형으로 하고, 청구항 제1항의 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 증폭하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 얻어진 증폭 산물의 크기를 분석하여 배 품종을 결정하는 단계;
를 포함하는, 배 품종 식별 방법을 제공한다.
상기 a) 단계에서 배의 엽록체 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있다.
상기 b) 단계에서 프라이머 세트는, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 조성물이다. 상기 배 품종 식별용 프라이머 세트는 1세트 이상이 사용될 수 있고, 다수의 분자 마커가 동시에 사용되면 보다 정확하게 품종을 구별할 수 있다.
또한 상기 (a) 단계에서 엽록체 게놈 DNA의 증폭은 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해 수행될 수 있다. PCR은 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하거나 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 배에서 추출된 엽록체 게놈 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 TrisHCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에서 증폭된 DNA 산물의 분석은 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의한 것이면 가능하나, 예를 들면 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정의 방법에 의해 수행될 수 있다.
바람직하게는 증폭된 DNA 산물을 겔 전기영동을 사용하여 분석하는데, 구체적으로는 아가로오스 겔 또는 아크릴 아마이드 겔 상에서 증폭 산물을 전기영동하고, 에티디움 브로마이드(EtBr), 실버 염색(silver staining) 등에 의해 밴드를 확인할 수 있다.
본 발명의 따른 배 품종의 식별방법은 얻어진 증폭 산물을 배 품종의 증폭 산물의 크기를 비교하여 품종을 결정할 수 있다.
식별가능한 배 품종 및 엽록체 유전자에 대한 내용은 상술한 바와 중복되므로, 생략하며, 상기 기재된 바를 그대로 인용한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 배 품종 식별용 키트를 제공한다.
상기 키트는 상술한 본 발명에 따른 배 품종 식별용 프라이머 세트 외에 DNA 중합효소(DNA polymerase), dNTPs 및 PCR 반응용 완충용액을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 배 품종 식별용 키트는 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동에 필요한 성분들을 더 포함할 수 있다.
식별가능한 배 품종 및 엽록체 유전자에 대한 내용은 상술한 바와 중복되므로, 생략하며, 상기 기재된 바를 그대로 인용한다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 배 품종들의 엽록체 게놈 어셈블리
모계유전 양상을 분석할 수 있는 세포소기관 중 하나인 엽록체 게놈 어셈블리를 추진하였다.
배 29종과 사과 1종 시료의 어린잎에서 DNeasy Plant Mini kit(Qiagen, CA, USA)를 이용하여 제논 DNA를 추출하였다. 배 29종 중, 신고배, 원황배, 추황배 등 배 우수자원 8개에 대하여 단거리서열 기반 제놈 시퀀싱 하였다. 제놈 시퀀싱은 일루미나 제놈 분석기기인 In house(생명자원부 facilities) Next-seq과 용역 HiSeq 2500, 4000을 이용하였다. 350bp 삽입 크기를 갖는 제놈 라이브러리는 제조사가 권장하는 paired-end 표준 프로토콜을 따라 제조하였다. 각각의 샘플은 다른 색인으로 따로 태그를 붙였다. CLC-품질 트림 툴을 사용하여 Phred 점수 20 이하의 점수로 트리밍된 염기서열을 최소 200~600bp의 중첩 크기를 갖게하는 CLC 제놈 어셈블러 (ver. 4.06 beta, CLC Inc, Rarhus, Denmark)를 이용하여 조립하였다. 엽록체 제놈을 나타내는 주요한 contig는 NCBI에 등록된 Hosui 배 (Pyrus pyrifollia), NC_015996을 참조하여 reference-guided 엽록체 제놈 어셈블 파이프라인을 생명부에 탑재하였다(유전체과 정보실 지원). 본 발명에 사용된 배 품종은 아래 표 1과 같다.
본 발명에 사용된 배 품종
일련번호 품종명 영명 학명 교배조합 수번 주요 특성
1 신고 Niitaka P. pyrifolia 　 26-19516 주 재배품종
2 황금배 Whangkeumbae P. pyrifolia 신고x이십세기 원목 중생종, 녹색과피
3 청실리 Cheongshilli P. ussuriensis 　 26-19923 　
4 천노천 Amanogawa P. pyrifolia 　 　 　
5 감로 Gamro P. pyrifolia 신고 * 신수 　 　
6 선황 Sunwhang P. pyrifolia 신고 * 만삼길 　 　
7 신화 Shinhwa P. pyrifolia 신고 * 화산 　 　
8 영산배 Youngsanbae P. pyrifolia 신고 * 단배 　 　
9 한아름 Hanareum P. pyrifolia 신고x추황배 9-0064 조생종
10 원황 Wonwhang P. pyrifolia 조생적 * 만삼길 　 　
11 금촌추 Imamuraaki P. pyrifolia 　 　 　
12 금촌조생 Geumchonjosaeng P. pyrifolia 금촌추 * 단배 　 　
13 단배 Danbae P. pyrifoliax P.ussuriensis 장십랑x청실리 26-19755 　
14 추황배 Chuwhangbae P. pyrifolia 금촌추x이십세기 원목 만생종
15 만삼길 Okusankichi P. pyrifolia 　 　 　
16 설원 Seolwon P. pyrifolia 만풍배 * 추황배 　 　
17 슈퍼골드 Supergold P. pyrifolia 추황배 * 만풍배 　 　
18 장십랑 Chojuro P. pyrifolia 　 　 　
19 둥글레배 Doongkeulraebae P. ussuriensis 　 　 　
20 청당로리 Cheongdangrori P. ussuriensis 　 　 　
21 OPR125 OPR125 P. calleryana 　 　 　
22 OPR195 OPR195 P. calleryana 　 　 　
23 압리 Yali P. bretschnederi 　 26-19595 흑성병 감수성
24 탕산수리 Dangshansuli P. bretschnederi 　 26-19710 중국배 유전체 연구 소재
25 고당5-1 Godang 5-1 　 　 　 　
26 창계설리 Cangxixueli 　 　 　 　
27 행장 Kozo 　 　 　 　
28 Bartlett Bartlett P. communis 　 11-2 서양배 유전체 연구 소재
29 Max red bartlett Max red bartlett P. communis 　 26-20083 바틀렛 아조변이
30 후지 Fuji Malus 　 　 　
< 실시예 2> 배 품종 30종에 대한 엽록체 게놈 유래 catlytic subunits of the ndhA protease complex (ndhA) 유전자의 증폭, 염기서열 비교 분석
신고배와 원황배 엽록체 ndhA 서열비교시 2개 SNPs가 분석되는 영역에 대한 ndhA forward primer 5’- CAA TAA CCC GTT GGT TTA CA -3’(서열번호 1) 및 ndhA reverse primer 5’- CCT TGT TTT AGC GGA TCT CA -3’(서열번호 2) 양방향 20mer되는 프라이머 세트를 외주 제작하였다. PCR 생산물의 예측크기는 1,003bp이었다(도 1).
PCR 반응은 배 29종과 사과 1종 주형 DNA는 총 25ng으로(5㎕씩, 5ng/㎕) 양방향 프라이머는 10pmole (1㎕씩), qPCR 2X PreMix with SYBR Green(Enzynomics, RT500M) 13㎕와 멸균수를 총 26㎕되게 96well plate(Bio-Rad, BRHSP-9601)로 반응하였다. PCR 반응 기기는 Applied Biosystems PCR system 97000 장비를 활용하였다. PCR은 94℃, 5분 1회, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 연계반응을 25회, 최종으로 72℃ 10분 처리하여 PCR 생산물을 합성하였다. 상기 제작된 프라이머 세트를 이용하여 표 1에서 제시한 29종 배와 1종의 사과에 대한 ndhA 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)로 증폭하여 밴드 크기를 비교하였다(도 2). 전기영동은 2.5% 아가로즈젤에서 PCR 생산물 중 2㎕씩 주입하고, 100volt, 8시간 10분 전개하였다. PCR 생산물 크기를 확인하기 위하여 1Kb DNA ladder marker(Enzynomics, DM003)을 사용하였다.
그 결과, 신고배, 신고배의 모본인 천노천 및 신고배를 모본으로 육성된 품종인 황금, 감로, 선황, 신화, 영산배 및 한아름에서 886bp의 밴드 크기가 나타나 다른 품종과 구별되었다. 또한, 청실리, 단배, 설원, 청당로리 및 창계설리에서도 신고배와 동일한 864bp의 밴드 크기가 나타난 것으로 보아, 상기 품종의 모계가 신고배 또는 신고배의 모계 품종에서 유래하였을 것으로 예측할 수 있었다.
< 실시예 3> 29종의 배 품종 및 1종의 사과 품종의 엽록체 게놈 유래 catlytic subunits of the ndhA protease complex (ndhA) 유전자내 다형성 분석
다형성 분석 결과
No Variety 10..30 (14bp C→T;
16bp A→T; 18bp A→T) 		36..58 (38bp A→C;
54bp A→T; 56bp T→A)
1 Niitaka AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
2 Whangkeumbae AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
3 Cheongshilli AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
4 Amanogawa AATTCTATATTAATTAATGAA ACCCAAATTATATATCTATTAAT
5 Gamro AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
6 Sunwhang AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
7 Shinhwa AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
8 Youngsanbae AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTAAT
9 Hanareum AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
10 Wonwhang AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTAAT
11 Imamuraaki AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
12 Geumchonjosaeng AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
13 Danbae AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
14 Chuwhangbae AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
15 Okusankichi AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTAAT
16 Seolwon AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
17 Supergold AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTAAT
18 Chojuro AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
19 Doongkeulraebae AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
20 Cheongdangrori AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
21 OPR125 AATTCTATATTAATTAATGAA ACCCAAATTATATATCTATTTAT
22 OPR195 AATTCTATATTAATTAATGAA ACCCAAATTATATATCTATTTAT
23 Yali AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
24 Dangshansuli AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
25 Godang 5-1 AATTTTTTATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTTTTTAT
26 Cangxixueli AATTCTATATTAATTAATGAA ACACAAATTATATATCTATTTAT
27 Kozo AATTTTATATTAATTAATGAA ACCCAAATTATATATCTATTAAT
28 Bartlett AATTTTTTTTTAATTAATGAA ACCCAAATTATATATTTTTTTAT
29 Max red bartlett AATTTTTTTTTAATTAATGAA ACCCAAATTATATATTTTTTTAT
30 Fuji AATTTTTTTTTTTTTTTTGAA ACCCAAATTTTTTTTTTTTTTAA
No Variety 75..119(77bp A→T; 83bp A→T; 81bp A→C;
83 to 115bp Insertion 23bp 'TAAGGATTAAAGTAACAAAGGAT')
1 Niitaka ATTAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
2 Whangkeumbae ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
3 Cheongshilli ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
4 Amanogawa ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
5 Gamro ATTAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
6 Sunwhang ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
7 Shinhwa ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
8 Youngsanbae ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
9 Hanareum ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
10 Wonwhang ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
11 Imamuraaki ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
12 Geumchonjosaeng ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
13 Danbae ATTAAAGTAACAAAGGAT------------------------AAAT
14 Chuwhangbae ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
15 Okusankichi ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
16 Seolwon ATAAAAGTTACAAAGGAT------------------------AAAT
17 Supergold ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
18 Chojuro ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
19 Doongkeulraebae ATAAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
20 Cheongdangrori ATTAAAGTAACAAAGGAT------------------------AAAT
21 OPR125 ATAAAAGTAACAAAGGAT------------------------AAAT
22 OPR195 ATAAAAGTAACAAAGGAT------------------------AAAT
23 Yali ATTAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
24 Dangshansuli ATTAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
25 Godang 5-1 ATTAAAGTAACCAAGGAT------------------------AAAT
26 Cangxixueli ATTAAAGTAACAAAGGAT------------------------AAAT
27 Kozo ATTAAAGTAACAAAGGATTAAGGATTAAAGTAACAAAGGATAAAT
28 Bartlett ATTAAAGTTACCAAGGAT------------------------AAAT
29 Max red bartlett ATTAAAGTTACCAAGGAT------------------------AAAT
30 Fuji ATTAAAGTTACACATTTT--------------------AAAAAAAAG
No Variety 390..402 (396bp A→C)
1 Niitaka TCCTTTCCATATGT
2 Whangkeumbae TCCTTTCCATATGT
3 Cheongshilli TCCTTTCCATATGT
4 Amanogawa TCCTTTCCATATGT
5 Gamro TCCTTTCCATATGT
6 Sunwhang TCCTTTCCATATGT
7 Shinhwa TCCTTTCCATATGT
8 Youngsanbae TCCTTTCCATATGT
9 Hanareum TCCTTTCCATATGT
10 Wonwhang TCCTTTACATATGT
11 Imamuraaki TCCTTTACATATGT
12 Geumchonjosaeng TCCTTTACATATGT
13 Danbae TCCTTTCCATATGT
14 Chuwhangbae TCCTTTACATATGT
15 Okusankichi TCCTTTACATATGT
16 Seolwon TCCTTTCCATATGT
17 Supergold TCCTTTACATATGT
18 Chojuro TCCTTTACATATGT
19 Doongkeulraebae TCCTTTACATATGT
20 Cheongdangrori TCCTTTCCATATGT
21 OPR125 TCCTTTACATATGT
22 OPR195 TCCTTTACATATGT
23 Yali TCCTTTACATATGT
24 Dangshansuli TCCTTTACATATGT
25 Godang 5-1 TCCTTTACATATGT
26 Cangxixueli TCCTTTCCATATGT
27 Kozo TCCTTTACATATGT
28 Bartlett TCCTTTACATATGT
29 Max red bartlett TCCTTTACATATGT
ndhA 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)로 증폭한 배 29종과 사과 1종에 대한 염기서열에서 다형성을 DNASTAR 프로그램 팩키지에서 CluterW method로 서열들을 비교 분석하여 MegAlingn을 실시하였다. 그 결과를 상기 표 2 및 도 3에 나타내었다.
ndhA 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)로 증폭한 배29종과 사과1종에 대한 염기서열간의 다형성을 비교 분석한 결과 크게 4개 영역의 다형성 부위를 탐색하였다(표 2)
특히, 비교한 영역 중 75bp에서 119bp 비교 영역에서 83bp에서 115bp에서 23bp에 해당하는 염기서열의 삽입/결실 다형성이 있는데, 천노천, 신고배 및 신고배를 모계로 하여 육성된 품종에서 23bp의 결실이 나타나 다른 품종과 구별되었다. 또한 390bp에서 402bp 비교 영역 중 396bp에서는 A→’C‘ SNP 변이가 있었고, 이는 천노천, 신고배 및 신고배를 모계로 하여 육성된 품종에서 나타났다.
상기 SNPs 및 삽입/결실(Indel)마커를 이용하여 신고배, 신고배를 모본으로 육성한 품종 및 신고배 육성시 사용된 모본 품종을 다른 품종과 식별할 수 있음을 추가로 확인하였다.
그리고 추가적으로 10bp에서 30bp와 36bp에서 58bp 영역에서 A→T 또는 A→C SNP가 확인되었고. 이와 같은 SNP 마커들은 배 품종을 식별하는데 이용될 수 있을 것으로 판단할 수 있었다.
또한 이 들 다형성 서열를 기반으로 배 29종과 사과 1종에 대한 유연관계도를 분석하여 도 4에 나타내었다. 배 29종 및 사과가 가장 유연관계가 멀었으며, 서양배 2종인 바틀렛과 맥스레드바틀렛이 그 다음으로 유전거리관계가 떨어져 있었으며, 종분류가 안된 고당 5-1과 행장이 서양배와 동양배 사이의 근연관계를 가졌고, 특히 P. calleryana가 서양배와 동양배 사이에 위치하였다. P. ussuriensis종은 P. pyrifolia종 중 신고배와 신고배 모본계와 원황 및 금촌추와 금촌모본계로 나눠지는 유연관계도 내에 섞여있었고, 중국배인 P. bretschnederi종은 신고배계와 금촌추계 접점에 위치하였다.
<110> Republic of Korea <120> A composition for cultivar discrimination in pear <130> P17R12C1050 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ndhA forward primer <400> 1 caataacccg ttggtttaca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ndhA reverse primer <400> 2 ccttgtttta gcggatctca 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 배 품종 식별용 조성물로,
    상기 배 품종은 신고배의 모계에 해당하는 품종, 신고배 및 신고배를 모본으로 육성된 품종 중 하나 이상인 것인, 배 품종 식별용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 엽록체 게놈 내 ndhA (putative NADH dehydogenease A) 유전자를 증폭하는 것인, 배 품종 식별용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 프라이머 세트로 증폭된 산물의 크기는 864bp 인 것인, 배 품종 식별용 조성물.
  5. (a) 배로부터 유래된 엽록체 게놈 DNA를 주형으로 하고, 청구항 제1항의 프라이머 세트로 PCR을 수행하여 증폭하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 얻어진 증폭 산물의 크기를 분석하여 배 품종을 결정하는 단계;
    를 포함하는, 배 품종 식별 방법으로,
    상기 배 품종은 신고배의 모계에 해당하는 품종, 신고배 및 신고배를 모본으로 육성된 품종 중 하나 이상인 것인, 배 품종 식별 방법.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 배 품종을 결정하는 단계는 얻어진 증폭 산물의 크기가 864bp이면, 신고배의 모계에 해당하는 품종, 신고배 또는 신고배를 모본으로 육성된 품종으로 결정하는 것인, 배 품종 식별방법.
  8. 제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 배 품종 식별용 키트로,
    상기 배 품종은 신고배의 모계에 해당하는 품종, 신고배 및 신고배를 모본으로 육성된 품종 중 하나 이상인 것인, 배 품종 식별용 키트.
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