KR101778877B1

KR101778877B1 - 황금배와 미니배의 품종 구별을 위한 분자마커

Info

Publication number: KR101778877B1
Application number: KR1020160020967A
Authority: KR
Inventors: 김대일; 오영재; 신현석; 김금선; 한현대; 오성일; 원정연; 오세원; 김설아
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-23
Filing date: 2016-02-23
Publication date: 2017-09-14
Also published as: KR20170099067A

Abstract

본 발명은 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별을 위한 분자마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 '황금배' 및 '미니배'의 NGS 염기서열 데이터를 통해 개발된 InDel 마커의 다형성을 분석하여 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 '황금배' 및 '미니배'의 차세대 염기서열분석법 기반 InDel 마커는 염기서열 기반의 마커로 '황금배' 및 '미니배' 품종에 대한 식별능이 우수하여 동양배 및 교잡종에서 다형성을 효과적으로 판별할 수 있으며, 배 DNA 프로파일 작성에 이용되어 추후 배 품종 판별 및 품종 보호, 유전자 지도 작성 등 여러 분야에 활용될 수 있다.

Description

황금배와 미니배의 품종 구별을 위한 분자마커{Markers for discrimination of Whangkeumbae and Minibae}

본 발명은 '황금배(Pyrus pyrifolia)'와 '미니배(P. hybrid)'의 품종 구별을 위한 분자마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 '황금배'와 '미니배'의 NGS 염기서열 데이터를 통해 개발된 InDel 마커의 다형성을 분석하여 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별 방법에 관한 것이다.

NGS(Next generation sequencing)는 DNA 유전정보를 읽어내는 자동화 기술로 2000년 후반에 등장하였으며, 기존 sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능하다. NGS는 전통적인 방법에 비해 빠르고 저렴한 비용으로 대용량의 단편 염기서열 데이터를 얻을 수 있어 유전자의 발현정도, 특이유전자 발견, 분자마커개발 등에 유용하기 때문에 R&D 및 바이오-의료분야에서 많이 이용되고 있다. NGS 기술을 이용한 유전체 염기서열 정보들은 수많은 구조적 변이를 가진다. DNA 염기서열 정보로부터 얻을 수 있는 가장 핵심적인 부분은, 개인차를 가장 잘 설명하는 집단 안에서의 변이이며, SNP, InDel(insertion/deletion), multi nucleotide polymorphism(MNP) 등이 있다. 이러한 변이 정보들을 관련된 데이터와 비교 분석함으로 마커들을 발굴하여 유전체 연구에 활용할 수 있다고 알려져있다.

그중 InDel 마커는 유전체 전반에 걸쳐 삽입(insertion)이나 결손(deletion)으로 그 길이의 차이에 의해 발생되는 DNA 다형성을 의미한다고 알려져있다. InDel 마커는 적당한 크기의 InDel 다형성과 규칙적으로 제작된 primer, 기본적인 PCR, 아가로스 겔 전기영동 시스템 등으로 유전자형을 확인할 수 있다.

현재까지 InDel 마커는 쌀에서 인디카(indica)와 자포니카(japonica) 아종 그리고 그들의 진화에 관한 관계조사에서 성공적으로 활용되었고, 밀, 쌀, 감귤류, 애기장대 등의 자연집단에서 성공적으로 활용되었으며, 유전자지도 작성과 품종 분류 등의 실험에도 사용되고 있다고 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 '황금배'와 '미니배'의 NGS 염기서열 데이터를 이용하여 '황금배'와 '미니배'의 품종을 구별하기 위한 InDel 마커를 5개를 선발하여 '황금배'와 '미니배'의 품종을 판별해본 결과, '황금배'와 '미니배' 품종 판별에 대한 식별력이 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 '황금배'와 '미니배'의 품종을 정확하고 우수하게 판별할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 '황금배'와 '미니배'의 품종을 구별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트를 포함하는, '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 프라이머 세트는 '황금배'와 '미니배'의 품종을 구별하기 위한 Indel 마커를 증폭할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 '황금배'와 '미니배'의 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 '황금배' 및 '미니배'의 차세대 염기서열분석법 기반 InDel 마커는 염기서열 기반의 마커로 '황금배' 및 '미니배' 품종에 대한 식별능이 우수하여 동양배 및 교잡종에서 다형성을 효과적으로 판별할 수 있으며, 배 DNA 프로파일 작성에 이용되어 추후 배 품종 판별 및 품종 보호, 유전자 지도 작성 등 여러 분야에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 CPID072의 프라이머쌍(서열번호 1 및 서열번호 2)을 이용하여 '황금배' 및 '미니배'의 DNA를 증폭한 PCR 산물의 캐필러리 전기영동을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 CPID073의 프라이머쌍(서열번호 3 및 서열번호 4)을 이용하여 '황금배' 및 '미니배'의 DNA를 증폭한 PCR 산물의 캐필러리 전기영동을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 CPID080의 프라이머쌍(서열번호 5 및 서열번호 6)을 이용하여 '황금배' 및 '미니배'의 DNA를 증폭한 PCR 산물의 캐필러리 전기영동을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 CPID087의 프라이머쌍(서열번호 7 및 서열번호 8)을 이용하여 '황금배' 및 '미니배'의 DNA를 증폭한 PCR 산물의 캐필러리 전기영동을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 CPID094의 프라이머쌍(서열번호 9 및 서열번호 10)을 이용하여 '황금배' 및 '미니배'의 DNA를 증폭한 PCR 산물의 캐필러리 전기영동을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 CPID072의 '황금배' 및 '미니배' 삽입/결실 부분의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 CPID073의 '황금배' 및 '미니배' 삽입/결실 부분의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 CPID0080의 '황금배' 및 '미니배' 삽입/결실 부분의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 CPID087의 '황금배' 및 '미니배' 삽입/결실 부분의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 CPID094의 '황금배' 및 '미니배' 삽입/결실 부분의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 11은 3% 아가로스겔 전기영동에 의한 CPID072 InDel 마커의 밴드 패턴을 나타낸 것이다.( W :‘황금배’; M:‘미니배' )
도 12는 3% 아가로스겔 전기영동에 의한 CPID073 InDel 마커의 밴드 패턴을 나타낸 것이다.( W :‘황금배’; M:‘미니배' )
도 13은 3% 아가로스겔 전기영동에 의한 CPID080 InDel 마커의 밴드 패턴을 나타낸 것이다.( W :‘황금배’; M:‘미니배' )
도 14는 3% 아가로스겔 전기영동에 의한 CPID087 InDel 마커의 밴드 패턴을 나타낸 것이다.( W :‘황금배’; M:‘미니배' )
도 15는 3% 아가로스겔 전기영동에 의한 CPID094 InDel 마커의 밴드 패턴을 나타낸 것이다.( W :‘황금배’; M:‘미니배' )

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트를 포함하는, '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 프라이머 세트를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 '황금배'(Pyrus pyrifolia)는 동양배이고, '미니배'(P. hybrid)는 교잡종이다.

본 발명에서 용어,‘프라이머'란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트를 사용하였다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트는 '황금배'와 '미니배'의 품종을 구별할 수 있다.

또 다른 양태로서, 상기 프라이머 세트를 포함하는 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 조성물을 제공한다.

또 다른 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 '황금배'와 '미니배'의 품종 구별용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 당귀 판별용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에서 '황금배'와 '미니배'의 품종 판별을 위하여 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은

'황금배'와 '미니배'의 시료에서 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, '황금배'와 '미니배'의 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

상기 시료는 '황금배'와 '미니배'의 잎으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명의 PCR 수행은, '황금배'와 '미니배'의 잎에서 얻어진 시료에서 분리한 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시된 프라이머 세트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 Indel 마커를 증폭할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 있어서, PCR 수행은 pre-denaturation 94℃에서 5분간 수행, 이후 94℃에서 30초, 60℃에서 annealing 45초, 72℃에서 30초간 35회 PCR을 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 extension 과정을 통해 이루어 질 수 있다.

상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCT 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 캐필러리 전기영동을 이용할 수 있다.

또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5′-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

DNA 추출

'황금배'와 '미니배'의 선단부에서 유엽을 채취하고 증류수로 세척한 후 품종별로 포장하여 -80℃에서 보관하였다. 신선한 배나무의 어린잎에서 cetyl trimethyl ammonium bromide(CTAB)를 통해 genomic DNA를 분리하였다. 배나무의 어린잎을 액체질소를 넣은 막자사발에 넣어 냉각시켜 마쇄한 시료를 샘플 튜브에 옮겼다. CTAB 버퍼 500μL를 첨가하고, 2-mercaptoethanol 2μL을 첨가한 이후 65°C 항온수조에 30분간 incubation하였다. 200μL 5M potassium acetate를 첨가 후 30분간 얼음에 incubation하였다. 600μL phenol:chloroform: isoamylalcohol(P:C:I=25:24:1)을 첨가하고 13,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 새로운 샘플튜브로 옮기고 600μL의 chloroform: isoamylalcohol(C:I=24:1)을 첨가 후 13,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 샘플튜브로 다시 옮기고 600μL의 차가운 isopropanol을 첨가하고 -20℃에서 30분간 incubation하였다. 13,000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리 하고 가라앉은 침전물을 확인하였다. Isopropanol을 버리고 침전물에 차가운 70% EtOH 500μL을 첨가한 후 13000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리 하였다. EtOH를 버린 후 건조한 후, TE 버퍼 30μL를 첨가하였다. 마지막으로 RNase A를 첨가 후 37℃에서 1시간 incubation하고, -80℃에 보관하였다.

<실시예 2>

NGS 분석

염기서열 해독을 위해 '황금배'와 '미니배'의 DNA를 대상으로 라이브러리를 제작하고 Illumina Hiseq2000 sequencer의 표준 프로토콜을 따라 '황금배'와 '미니배' 품종의 염기서열을 해독하였다. 이후 생성된 단편서열(read)들은 생물정보분석에 사용되었으며, 생물정보분석을 위해 중국배 'Suli'(Wu et al., 2013)의 whole genome sequence를 레퍼런스 게놈으로 사용하였다.

그 결과, CPID072 InDel 마커의‘황금배’염기서열(서열번호 11), CPID072 InDel 마커의‘미니배’에서 삽입 부분의 염기서열(서열번호 12)을 확인하였다(도 6 참조).

CPID073 InDel 마커의‘황금배’염기서열(서열번호 13), CPID073 InDel 마커의‘미니배’에서 삽입 부분의 염기서열(서열번호 14)을 확인하였다(도 7 참조).

CPID080 InDel 마커의‘황금배’염기서열(서열번호 15), CPID080 InDel 마커의‘미니배’에서 삽입 부분의 염기서열(서열번호 16)을 확인하였다(도 8 참조).

CPID087 InDel 마커의‘황금배'에서 삽입 부분의 염기서열(서열번호 17), CPID087 InDel 마커의‘미니배' 염기서열(서열번호 18)을 확인하였다(도 9 참조).

CPID094 InDel 마커의‘황금배'에서 삽입 부분의 염기서열(서열번호 19), CPID094 InDel 마커의‘미니배' 염기서열(서열번호 20)을 확인하였다(도 10 참조).

<실시예 3>

InDel 마커 선발 및 PCR을 이용한 DNA 증폭

'황금배'와 '미니배'의 NGS 염기서열 데이터에서 탐색된 Indel 중 재현성이 뛰어나고 마커로서 적합할 것이라고 예상되는 5개를 선발하였으며 '황금배'와 '미니배'의 품종을 구별하기 위해 제작된 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.

Marker	Sequence (5'-3')	Tm (℃)	Expected size	Observed ‘Whangkeumbae’ InDel size	Observed ‘Minibae’ InDel size
CPID072	F: TGTCACTAATAAAAATGAGCACGT(서열번호1)	60	214	210	210/215
	R: ACCCAAATCCACTCGTCAGAC(서열번호2)
CPID073	F: GGGCCTTAGCTCATTGTGGT(서열번호3)	60	185	182	171/182
	R: GTACGACAAAGGACGACCCA(서열번호4)
CPID080	F: GTGGCGAAAATACAAGGGGC(서열번호5)	60	307	305	313
	R: TGGTGTCGAATGTCGGAGTT(서열번호6)
CPID087	F: AAACCTGGTGTACGACGGAC(서열번호7)	60	213	220	215/220
	R: TGGAGATTGCATCAAGGGGT(서열번호8)
CPID094	F: AGGTAAATGCCGTGCAAACAC(서열번호9)	60	201	211	204/211
	R: AGATGTGTTGACGGAAGGGT(서열번호10)

상기 실시예 1에서 추출한 '황금배'와 '미니배'의 DNA에 2×Hot Taq polymerase(GeNetbio, Korea) 5μL, gDNA 2μL, 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 프라이머 세트 2μL(forward, reverse sequence 각 1μL), 증류수 1μL로 PCR 반응 혼합물을 만들었다.

PCR 과정은 pre-denaturation 94℃에서 5분간 수행, 이후 94℃에서 30초, 60℃에서 annealing 45초, 72℃에서 30초간 35회 PCR을 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 extension 하였다.

PCR 수행 후 Indel 마커가 증폭되었는지 확인하기 위하여 PCR 산물 3μL를 Dyne LoadingSTAR(DyneBio, Korea.) 1μL와 혼합하여 3% 아가로스 겔에 분주하고 20분간 전기영동 후 100bp DNA Ladder(Takara BIOINC., Japan)로 PCR 산물의 크기와 integrity를 판별하고 겔도큐먼테이션 시스템에서 밴드를 확인하였다(도 11 내지 도 15 참조).

<실시예 4>

캐필러리 전기영동

상기 실시예 3의 아가로스 전기영동에서 확인된 Indel 마커는 Fragment Analyzer(Advanced analytical, Inc., Ames, USA)를 사용하여 캐필러리 전기영동을 수행하였다. Fragment Analyzer 장비 분석을 위해 FA dsDNA 35-500bp 겔에 intercalating dye를 첨가해 겔을 만들어 준비했고, PCR 산물에 20μL의 TE 버퍼를 첨가하여 희석하였다. 그 후, Fragment Analyzer에서 캐필러리 전기영동을 수행하였다.

그 결과, '황금배' 및 '미니배'의 NGS 데이터를 통해 개발된 InDel 마커는 캐필러리 전기영동을 통해 정확한 유전자형을 확인할 수 있었으며, 각각의 Indel 마커의 다형성을 보이는 대립인자를 확인하였다(표 1 참조).

<실시예 5> InDel 마커 다형성 분석 및 마커 개발

상기 실시예 4에서 캐필러리 전기영동 후 PRO Size 2.0 프로그램을 이용해서 다형성을 분석하였다. '황금배' 및 '미니배'에서 나타나는 peak를 분석해 유전자형을 비교하고 '황금배' 및 '미니배'에서 각각 다형성을 가지는 마커를 최종 선발하였다.

그 결과, CPID072 마커에서 '황금배'는 210bp의 대립유전자를 확인하였고, '미니배'는 210/215bp의 대립유전자를 확인하였다(도 1 참조).

CPID073 마커에서 '황금배'는 185bp의 대립유전자를 확인하였고, '미니배'는 171/182bp의 대립유전자를 확인하였다(도 2 참조).

CPID080 마커에서 '황금배'는 305bp의 대립유전자를 확인하였고, '미니배'는 313bp의 대립유전자를 확인하였다(도 3 참조).

CPID087 마커에서 '황금배'는 220bp의 대립유전자를 확인하였고, '미니배'는 215/220bp의 대립유전자를 확인하였다(도 4 참조).

CPID094 마커에서 '황금배'는 211bp의 대립유전자를 확인하였고, '미니배'는 204/211bp의 대립유전자를 확인하였다(도 5 참조).

따라서 상기와 같은 결과를 통해, 본 발명 표 1에 개시된 5개의 황금배와 미니배의 품종 구별용 마커의 염기서열을 기반으로 황금배와 미니배의 품종을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인하였고, 황금배와 미니배 품종 구별에 적합한 프라이머를 실험을 통해 입증하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Markers for discrimination of Whangkeumbae and Minibae <130> PN1602-046 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID072 primer_F <400> 1 tgtcactaat aaaaatgagc acgt 24 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID072 primer_R <400> 2 acccaaatcc actcgtcaga c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID073 primer_F <400> 3 gggccttagc tcattgtggt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID073 primer_R <400> 4 gtacgacaaa ggacgaccca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID080 primer_F <400> 5 gtggcgaaaa tacaaggggc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID080 primer_R <400> 6 tggtgtcgaa tgtcggagtt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID087 primer_F <400> 7 aaacctggtg tacgacggac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID087 primer_R <400> 8 tggagattgc atcaaggggt 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID094 primer_F <400> 9 aggtaaatgc cgtgcaaaca c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID094 primer_R <400> 10 agatgtgttg acggaagggt 20 <210> 11 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID072 InDel markers of Whangkeumbae <400> 11 aatgcatctt cccatttaat ttcragggtg tcgaaagagt aatgctagag agactaaatt 60 tggagataaa attggtaaac taaataatgt gtcactaata aaaatgagca cgtttatcaa 120 cgtttaaata ataaatcaat cattaacttc catattattt agtttttaaa attttatctt 180 caaatttaat ctctttagca ttatccgtgt cgaaatgtaa tcgtatttgt acagttgaaa 240 aacaaccagc tgccccaacc acatcaagaa attttactac tagtctgacg agtggatttg 300 ggtagactgt ccacaatcca atcgaaaact ttgaagaggg ttggtgggtt ttcttgtctc 360 acgtagtagc gaaaagctct ggrcatgaca tagattttgt ccccaataga ccacaataag 420 gtttattatt ttaatagagt aagattttct tccctcctaa tctctttctc attccatccc 480 atactattta aacacttacg 500 <210> 12 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID072 InDel markers of Minibae <400> 12 aatgcatctt cccatttaat ttcaagggtg tcgaaagagt aatgctaaag agactaaatt 60 tggagataaa attggtaaac taaataatgt gtcactaata aaaatgagca cgtttatcaa 120 cgtttaaata ataaatcaat cattaacttc catattattt agtttttaaa attttatctt 180 caaatttaat ctctttagca ttatccgtgt cgaaatgtaa tcgtatttgt acagttgaaa 240 aacaaccagc ttgttgcccc aaccacatca agaaatttta ctactagtct gacgagtgga 300 tttgggtaga ctgtccacaa tccaatagaa aactttgaag agggttggtg ggttttcttg 360 tctcacgtag tagcgaaaag ctctggacat gacatagatt ttgtccccaa tagaccacaa 420 taaggtttat tattttaata gagtaagatt ttcttccctc ctaatctctt tctcattcca 480 tcccatacta tttaaacact tacg 504 <210> 13 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID073 InDel markers of Whangkeumbae <400> 13 gtcactggcc tttggttttt ggggatgtat agtgttgtac agaatgacgt aatatatatt 60 cttcattggg cttgcgtgga catcactgtt attttgggcc ttagctcatt gtggtcacat 120 aggtcttgtc aacttttgga ctttaatctt attcttttag cccatccaat gtaacggcaa 180 ctctaattta atacatctta gacatattag acatattaga catattagac atattagaca 240 tccgtttgag aaaagaaata tgggtcgtcc tttgtcgtac catatactgc taggcaaaca 300 aaccattttg ctgttgcctt cacttcccct gacacctgtc tgcaagttac caaataacct 360 tcagctagat aagaaaatta attgtgcatt tgatgctgtt gtttgaaaaa cggtgtttgc 420 tcctctcaca tgtgtcatgg aattgtaatt attcatttgg tttatgtagt agtttcatac 480 tgaatggagt tacttatcct 500 <210> 14 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID073 InDel markers of Minibae <400> 14 gtcactggcc ttyggttttt ggggatgtat agtgtkgtac agaatgacgt aatatatatt 60 cttcattggg cttgcgtgga catcactgtt attttgggcc ttagctcatt gtggtcacat 120 aggtcttgtc aacttttgga ctttaatctt attcttttag cccatccaat gtaacggcaa 180 ctctaattta atacatctta gacatattag acatattaga catattagac atattagaca 240 tccgtttgag aaaatggaaa aagaaatatg ggtcgtcctt tgtcgtacca tatactgctw 300 ggcaaacaaa ccattttgct gttgccttca cytcccctga cacctgtctg caagttacca 360 mataaccttc agctagataa gaaaattaat tgtgcatttg atgctgttgt ttgaaaaacg 420 gtgtttgctc ctytcacatg tgtcatggaa ttgtaattat tcatttggtt tatgtagtag 480 tttcatactg aatggagtta cttatcct 508 <210> 15 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID080 InDel markers of Whangkeumbae <400> 15 ataaatcgca aaaaactttt aactagttcc catatacaaa gataaaaaga aagaagaaaa 60 ataatgcaag tttgtgtagg gattttatat ttaattacca agtttgtcgc ctacatagaa 120 ctgttttcct tgtgcccaag tttggtaatc aaaattaata gtccaacctt tgttagtcac 180 caacaacaaa atccgtggcg aaaatacaag gggcaacaat tgctagagtg acaaagataa 240 atagatggga cattgcaaca aaaaatttgt gagttagctt tattgttaga gtgaaaaatt 300 tagtgtgttg gctttatcgt catttacatt tttaaaaccc tccaaaccct aatcaatagt 360 gtttattgtt agagagcaaa attaataaaa attcctcata ataatgtaga agtgtgaaaa 420 tgtaaaaaga atatatacaa tcacttgtaa tgacaagctt tacaactttt atgaaggggt 480 aaactccgac attcgacacc 500 <210> 16 <211> 506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID080 InDel markers of Minibae <400> 16 ataaatcgca aaaaactttt aactagttcc catatacaaa gataaaaaga aagaagaaaa 60 ataatgcaag tttgtgtagg gattttatat ttaattacca agtttgtcgc ctacatagaa 120 ctattttcct tgtgcccaag tttggtaatc aaaattaata gtccaacctt tgttagtcac 180 caacaacaaa atccgtggcg aaaatacaag gggcaacaat tgctagagtg acaaagataa 240 atagatggga agacgccatt gcaacaaaaa atttgtgagt tagctttatt gttagagtga 300 aaaatttagt gtgttggctt tatcgtcatt tacattttta aaaccctcca aaccctaatc 360 aatagtgttt attgttagag agcaaaatta ataaaaattc ctcataataa tgtagaagtg 420 tgaaaatgta aaaagaatat atacaatcac ttgtaatgac aagctttaca acttttatga 480 aggggtaaac tccgacattc gacacc 506 <210> 17 <211> 506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID087 InDel markers of Whangkeumbae <400> 17 ttgatatggt ggtcgcgcat ttttcaccat aactaggttt ataacaaaca aaaaaaatgt 60 aataaaaaag tgattttatg ttcgttgtat gttataaatt tggattcata cgcttgcaat 120 ggggtgtaaa acatgaaaaa acctggtgta cgacggacag agcatgtgtc tgtgctgcca 180 taaagaaaaa ataaagacct atcctctgtg agagtttttt gtgggcgtat cagagcatcg 240 ttttgtgagc aaatgaatga aactactgtg agccttgctc taacagtatt gtctgggaga 300 ataaatgttg cacgttactc aaatagttta atttaaaacc ccttgatgca atctccaccg 360 ttcatgtcaa gacaacaaat atatcttata gtagtgatga taatgtattt agtggaacat 420 tcaacatcta tctattatat atatatatat atatatctat cttatagtag tgatgataat 480 gtattcagtg gaacattcaa catcta 506 <210> 18 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID087 InDel markers of Minibae <400> 18 ttgatatggt ggtcgcgcat ttttcaccat aactaggttt ataacaaaca aaaaaaatgt 60 aataaaaaag tgattttatg ttcgttgtat gttataaatt tggattcata cgcttgcaat 120 ggggtgtaaa acatgaaaaa acctggtgta cgacggacag agcatgtgtc tgtgctgcca 180 taaagaaaaa ataaagacct atcctctgtg agagtttttt gtgggcgtat cagagcatcg 240 ttttgtgagc atgaaactac tgtgagcctt gctctaacag tattgtctgg gagaataaat 300 gttgcacgtt actcaaatag tttaatttaa aaccccttga tgcaatctcc accgttcatg 360 tcaagacaac aaatatatct tatagtagtg atgataatgt atttagtgga acattcaaca 420 tctatctatt atatatatat atatatattt ctatcttata gtagtgatga taatgtattc 480 agtggaacat tcaacatcta 500 <210> 19 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID094 InDel markers of Whangkeumbae <400> 19 caaataagat taattcattc ccataaaagg ataaagttca gaatttttgt tggaactaaa 60 gaggccgaga ctgtatgaag atgaagtctt ggctaaaatg gaattaaaga gataagggga 120 gaatatttag gtaaatgccg tgcaaacaca gtctcattag gactctacct tggcaaagtt 180 gtttatcttg gaaaccattg tataaatata agagattctg caacatgaaa agtccttcaa 240 ctcaaacgct ctacgcgaaa acccttgctc tacgtgaaac ccttttcaca cctctaagaa 300 aaatactaac taacctaacc cttccgtcaa cacatcttca gtttagataa gtaaccaaca 360 ctatgttgat aactgatgac atcttcaatt tggatacgta aacatcactg ggaccgtaga 420 ttcaaatgat tcagcaacac attcaatttg gacaagtaaa caatattgct tctggtcagt 480 tggttatcta tctaagtctt ggtagttg 508 <210> 20 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPID094 InDel markers of Minibae <400> 20 catataagat taattcattc ccataaaagg ataaagttca gaatttttgt tagaactaaa 60 gaggccgaga ctgtatgaag atgaagtctt ggctaaaatg gaattaaaga gataagggga 120 gaatatttag gtaaatgccg tgcaaacaca gtctcattag gactctacct tggcaaagtt 180 gtttatcttg gaaaccattg tataaatata agagattctg caacatgaaa agtccttcaa 240 ctcaaacgct aaacccttgc tctacgtgaa acccttttca cacctctaag aaaaatacta 300 actaacctaa cccttccgtc aacacatctt cagtttagat aagtaaccaa cactatgttg 360 ataactgatg acatcttcaa tttggatacg taaacatcac tgggaccgta gattcaaatg 420 attcagcaac acattcaatt tggacaagta aacaatattg cttctggtca gttggttatc 480 tatctaagtc ttggtagttg 500

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시된 프라이머 세트를 포함하는, 황금배(Pyrus pyrifolia)와 미니배(P. hybrid)의 품종 구별용 프라이머 세트.
제 1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 황금배와 미니배의 품종 구별용 조성물.
제 2항의 조성물을 포함하는 황금배와 미니배의 품종 구별용 키트.
황금배와 미니배의 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시된 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 황금배와 미니배의 품종을 구별하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 시료는 황금배와 미니배의 잎으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 황금배와 미니배의 품종을 구별하는 방법.