KR102235439B1 - 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종내 및 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자 마커는 엽록체 게놈 완전 해독 염기서열에서 MTPT(Mitochondrial plastid DNA) 서열과의 유사성이 없는 지역에서 제작되어 백수오 종내의 변이를 탐색할 수 있으며, 종래의 분자 마커보다 정확한 종 판별이 가능한 장점이 있다.

Description

백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도{Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum, primer set for discrimination of Cynanchum species and uses thereof}

본 발명은 백수오(큰조롱, Cynanchum wilfordii)과 이엽우피소(넓은잎큰조롱, Cynanchum auriculatum)의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

분자 마커(molecular marker)는 DNA의 일부 서열을 증폭시켜 식물의 변이를 탐지할 수 있는 표지자로, 식물 육종 및 바코딩(barcoding) 영역에서 광범위하게 사용되고 있다. 생물 바코딩에 주로 사용되는 엽록체 DNA는 하나의 세포질 내에 수백 카피가 존재할 뿐 아니라, 복잡한 가공과정을 거쳐도 가장 안정된 형태로 남아있어 다양한 시료에서 증폭이 가능한 특징이 있다. 또한 엽록체 게놈의 변이지역은 종내변이는 적은 반면, 종간변이는 많은 특성이 있어 종간 명확한 식별을 위한 정보를 제공할 수 있다. 하지만, 동일 종내에서도 다양한 소재의 엽록체 완전장(complete sequencing)을 비교함으로써 종내 수집종간 다양성 정보를 발굴할 수 있으며 유전자원의 다양성과 분류 체계 확립에 사용되고 있다.

백미꽃속(Cynanchum)에 속하는 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소( C. auriculatum)는 한국과 중국에서 약용작물로 사용되어 왔다. 한국에서는 백수오가 식품 원료로 등록되어 있지만 이엽우피소는 그렇지 않아 식품원료로 사용할 수 없다. 이들은 근연종으로 유사한 형태적 특징을 가지고 있어 두 종을 식별함에 혼동이 있을 수 있으며, 백수오의 경우 분말, 절편, 가공식품등 다양한 형태로 시장에 유통되기 때문에 두 종의 혼입 여부를 육안으로 판단하는 것 또한 불가능하다. 이를 위해 DNA 수준에서 두 종을 식별할 수 있는 유전자 검사법이 요구되는 실정이다.

기존의 식물 DNA 바코딩 마커의 경우 엽록체 게놈 내의 보편적인 바코딩 영역(universal barcoding region)으로 알려진 trnH-GUG, rbcL, matK, psbA 등의 유전자 지역과 일부 유전자간 부위(intergenic region)를 대상으로 개발되었다. 마찬가지로 기존에 개발된 백수오와 이엽우피소 판별 마커들의 대부분은 보편적인 바코딩 영역을 대상으로 제작이 되어 있는 실정이다. 그러나 이들 지역은 종 간의 염기서열 다형성이 존재하지 않을 수 있으며, 식물에 따라서는 동일 종 내에서도 변이가 발견되는 경우가 있어 동일종을 다른 종으로 구분할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 뿐만 아니라 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈과 미토콘드리아 게놈 서열을 분석한 결과, 두 종 모두 엽록체 게놈 서열 중 일부가 미토콘드리아로 전이된 것이 확인되었다. 해당 지역들은 MTPT(Mitochondrial plastid DNA)라고 불리며 전이된 서열들은 백수오와 이엽우피소 간에 매우 높은 유사성을 보였다. 따라서, 상기 MTPT 지역에서 종 판별 마커를 개발할 경우 엽록체와 미토콘드리아 게놈이 동시에 증폭되어 혼동되는 결과가 나타날 수 있기 때문에, 이를 배제하고 마커를 개발할 필요가 있다. 현재 이용되고 있는 식약처 규정의 유전자검사명령제에 따른 유전자검사법의 경우 이런 오류를 가지고 있음을 확인하였다.

백수오는 한반도에 자생하는 고유종으로 국내 유전자원내에 큰 다양성을 내포하고 있음에도 불구하고 이들의 분류와 식별 등을 위한 종내 다양성 연구가 이루어지지 않았다. 따라서 앞서 개발된 마커들을 적용하였을 때, 백수오임에도 불구하고 종내 유전 다양성으로 인하여 이엽우피소로 잘못 판별되는 가능성이 있고, MTPT로 인해 발생할 수 있는 식물종 오·식별에 대한 고려도 수행되지 않았다. 이에 본 발명에서는 엽록체 게놈의 바코딩 영역만이 아닌 엽록체와 미토콘드리아의 완전장 게놈 서열을 완성하여 백수오 유전자원의 엽록체 게놈 전반에 존재하는 종내 다양성을 발굴하고 이를 통해 유전자원을 분류하고 효율적으로 관리 할 수 있으며 육종시스템의 기반으로 사용될 수 있는 종내변이 특이 마커를 개발하였다. 또한 백수오와 이엽우피소간의 다형성이 높으면서도 보다 신뢰할 수 있는 변이 지역을 탐색하고, 2종을 보다 정확하고 효과적으로 구분할 수 있는 분자 마커를 개발하였다.

한편, 한국공개특허 제2017-0024388호에는 '하수오, 백수오 및 이엽우피소의 판별 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1866163호에는 '백수오와 이엽우피소 감별용 InDel 마커 및 이를 이용한 판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 서열의 완전 해독 기반 종간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 완전 해독 염기서열에 기반하여, 백수오 종내 변이가 있으며, 동시에 종간 변이가 있고, MTPT(Mitochondrial plastid DNA) 서열과의 유사성이 없는 지역에서 5개의 InDel 마커를 개발하였으며, 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 완전 해독 염기서열에서 종간 변이가 있으며, 종내 변이는 없고, MTPT 서열과의 유사성이 없는 지역에서 4개의 InDel 및 12개의 종 판별 마커를 개발하였다. 특히, 본 발명자들은 종래 알려진 백수오와 이엽우피소 판별 분자 마커보다 본 발명의 분자 마커가 높은 정확도로 백수오와 이엽우피소를 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 40, 41 및 42; 서열번호 43, 44 및 45; 및 서열번호 46, 47 및 48;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 백수오 종내 변이 판별 및 백수오와 이엽우피소를 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 40, 41 및 42; 서열번호 43, 44 및 45; 및 서열번호 46, 47 및 48;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 백수오와 이엽우피소를 구별하기 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 백수오와 이엽우피소를 구별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 백수오와 이엽우피소를 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명에서 개발한 엽록체 게놈 유래 종내 판별 분자 마커는 백수오 엽록체 게놈의 다양성을 식별할 수 있어, 유전자원의 분류, 관리, 보존 및 육종 시스템의 기반으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 백수오와 이엽우피소의 종간 판별 마커는 엽록체 게놈과 미토콘드리아 게놈간 유전체 전이가 발생한 지역(Mitochondrial plastid DNA)과 종내 변이가 존재하는 지역을 제외하고 제작되었기 때문에, 보편적인 바코딩 영역(universal barcoding region)을 기반으로 제작된 종래의 분자 마커보다 정확한 종 판별이 가능한 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 분자 마커는 백수오와 이엽우피소의 다양한 형태의 혼용 또는 혼재된 가공품들을 손쉽게 파악 및 감별하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 백미꽃속 2종(백수오, 이엽우피소)의 엽록체 서열(좌) 및 백수오의 종내 변이 지역을 보여주는 엽록체 게놈 지도(우)이다.
도 2는 백수오의 엽록체 게놈 다양성을 보여주는 것으로, 종내 변이 검증 마커(cw_isv1~5)를 이용하여 백수오(C. wilfordii)와 이엽우피소(C. auriculatum) 집단의 유전형을 분석한 결과이다. 파란색 화살표는 유전자 지역을, 빨간색 화살표는 돌연변이의 위치를, 녹색 삼각형은 반복 단위를 의미한다.
도 3은 백수오(C. wilfordii)의 엽록체 게놈과 이엽우피소(C. auriculatum)의 미토콘드리아 게놈 사이의 MTPT(Mitochondrial plastid DNA) 분석 결과이다. 녹색선은 백수오의 엽록체 서열을, 파란선은 이엽우피소의 미토콘드리아 서열을, 밝은 파란선은 두 게놈간의 신터니(synteny)를 의미한다.
도 4는 MTPT(Mitochondrial plastid DNA) 지역을 기반으로 제작된 분자 마커(식약처의 식품진위판별법에서 사용되는 이엽우피소 특이 우성종판별 마커)를 이용한 백수오 및 이엽우피소 판별 결과이다.
도 5는 기존에 보고된 분자마커의 백수오 및 이엽우피소 판별 결과이다.
도 6은 본 발명의 분자 마커 개발 과정의 모식도이다.
도 7은 본 발명에서 개발한 공우성 마커(cw_i_2~4)를 이용한 백수오 및 이엽우피소 집단의 판별 결과이다.
도 8은 본 발명에서 개발한 백수오 또는 이엽우피소 특이 우성 마커를 이용한 백수오 및 이엽우피소 집단의 판별 결과이다.
도 9는 백수오와 이엽우피소가 혼합된 DNA 시료를 이용하여 백수오 또는 이엽우피소 특이 우성 마커의 검출 한계를 확인한 결과이다.
도 10은 백수오 및 이엽우피소 판별을 위해 본 발명에서 개발한 SNP 기반 종간 구별 마커(Cw_s_2~7)를 이용한 HRM(A) 및 KASP(B) 분석 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 40, 41 및 42; 서열번호 43, 44 및 45; 및 서열번호 46, 47 및 48;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 백수오(C. wilfordii) 종내 변이 판별 및 백수오와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 40, 41 및 42; 서열번호 43, 44 및 45; 및 서열번호 46, 47 및 48;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 백수오(C. wilfordii)와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 따른 백수오와 이엽우피소를 구별하기 위한 프라이머 세트는, 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 완전 해독 염기서열에 기반하여, 종간 변이가 있는 영역을 선발하고, 상기 영역 중에서 종내 변이가 없으며(서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 제외), MTPT(Mitochondrial plastid DNA) 서열과의 유사성이 없는 지역을 선별하여 제작된 분자 마커이다.

본 발명에 있어서, 상기 "MTPT(Mitochondrial plastid DNA)"는 엽록체 게놈의 서열 중 미토콘드리아 게놈으로 전이된 서열을 의미한다. 본 발명자는 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈과 미토콘드리아 게놈 서열을 분석한 결과, 백수오와 이엽우피소 모두 엽록체 게놈 서열의 35%가 미토콘드리아로 전이된 것(MTPT)을 확인할 수 있었고, 상기 MTPT 서열들이 백수오와 이엽우피소에서 매우 높은 유사성을 보임을 확인하였다. MTPT 지역에서 백수오와 이엽우피소의 종 판별 마커를 개발할 경우 엽록체와 미토콘드리아 게놈이 동시에 증폭될 가능성이 있으므로 잘못된 종 판별 결과를 초래할 수 있어, 본 발명자는 엽록체 게놈 완전 해독 염기서열에서 종간 변이가 있으면서 종내 변이는 없고, MTPT 서열과의 유사성이 없는 조건으로 백수오와 이엽우피소의 종 판별 마커를 개발하였다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 백수오와 이엽우피소의 종간 구별이 가능하며, 동시에 백수오 종내 변이를 구별할 수 있는 InDel 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트이고, 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 및 서열번호 17 및 18;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 백수오와 이엽우피소의 종간 판별 InDel 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트이고, 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 및 서열번호 29 및 서열번호 30;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 백수오와 이엽우피소의 종간 판별 SNP 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트이고, 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 40, 41 및 42; 서열번호 43, 44 및 45; 및 서열번호 46, 47 및 48;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 백수오와 이엽우피소의 종간 판별 SNP 마커를 증폭하기 위한 KASP용 프라이머 세트이다.

본 발명에 있어서, 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.

본 발명의 상기 KASP용 프라이머 세트는 백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈 완전 해독 염기서열에 기반하여, 종간 변이가 있는 영역을 선발하고, 선발된 영역 중에서 종내 변이를 보이지 않고, MTPT 서열과의 유사성이 없는 지역을 선별한 후 백수오와 이엽우피소에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)에 따라 백수오와 이엽우피소의 염기 타입을 검출하는 프라이머 세트이다.

본 발명의 상기 KASP용 프라이머 세트는 공통의 역방향 프라이머와 백수오(CW) 또는 이엽우피소(CA)의 특이적 SNP 염기서열을 3'-말단에 포함하는 정방향 프라이머 2개로 이루어져 있다(표 3 참고). 상기 2개의 정방향 프라이머는 서로 다른 형광시료로 표지될 수 있으며, 상기 형광시료는 FAM 또는 HEX 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 40, 41 및 42; 서열번호 43, 44 및 45; 및 서열번호 46, 47 및 48;의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 29 및 30; 서열번호 31, 32 및 33; 서열번호 34, 35 및 36; 서열번호 37, 38 및 39; 서열번호 40, 41 및 42; 서열번호 43, 44 및 45; 및 서열번호 46, 47 및 48;의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 백수오와 이엽우피소를 구별하기 위한 방법을 제공한다. 구체적으로는,

백수오 또는 이엽우피소 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 백수오(Cynanchum wilfordii)와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 백미꽃속 식물, 특히 백수오 또는 이엽우피소로 의심되는 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 페놀:클로로포름 추출에 후속한 에탄올 침전화 방법을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 DNA 중합효소를 첨가하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기에서, PCR(Polymerase Chain Reaction)이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있고, 바람직하게는, FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 또는 Cy5 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 상기 표지 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 HRM(high resolution melting) 분석, 형광 측정, 인광 측정, 겔 전기영동, DNA 칩 또는 방사성 측정을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

HRM 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선(melting curve)에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료(표지 물질)를 갖는 dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리한다. 또한, 증폭 산물을 검출하는 방법 중 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

백수오(큰조롱, Cynanchum wilfordii) 유전자원은 충청남도 금산군과 경상북도 안동시에서 종자를 수집해 이용하였으며, 이엽우피소(넓은잎큰조롱, C. auriculatum) 유전자원은 농촌진흥청으로부터 종자를 제공받았다. 수집된 두 종의 종자들을 경기도 수원시 서울대학교 농장에서 재배해 식물 재료로 사용하였다.

2. DNA 추출 및 Whole-genome shotgun sequencing

포장에서 재배된 백수오 중 상이한 표현형 형질을 가진 개체 4개를 선발하여 NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 수행하였다. DNA는 어린 잎 샘플을 액체질소로 급속 냉동하여 막자사발로 분쇄한 뒤 QuickGene DNA extraction kit (KURABO Industries Ltd., 일본)를 이용해 추출하였다. DNA의 농도 및 품질은 UV 분광광도계 (Nanodrop ND-1000, Thermo Scientific, 미국)와 아가로스 겔 전기영동 방법을 이용해 측정하였다. NGS 분석은 Paired-end 라이브러리를 제작해 Illumina Miseq genome analyzer를 이용해 수행하였다. 시퀀싱은 랩지노믹스사(성남, 한국)에서 수행하였다.

3. 엽록체 유전체 어셈블리

엽록체 유전체 어셈블리는 dnaLCW(de novo assembly of Low-Coverage Whole genome sequencing) 방법과 CLC genome assembler (ver. 4.06 beta, CLC Inc, 덴마크) 프로그램을 이용하여 수행되었다. 사용된 조건값으로, Raw paired-end reads는 offset value 33, 150 bp에서 500 bp 범위의 overlap distance를 사용해 가공하였으며, Window size는 32로 설정하였다. Contig 추출은 MUMmer 프로그램(http://mummer.sourceforge.net/)을 이용하였으며 어셈블된 read들을 참조(reference) 엽록체 유전체에 mapping 하는 방식을 이용하였다. 추출된 contig들을 참조 서열과 비교하여 하나의 엽록체 서열을 완성하였다. 완성된 엽록체 유전체 서열은 read mapping을 통한 manual curation 과정을 거쳐 검수되었다.

4. 엽록체 유전체 구조와 유전자 예측

엽록체 유전자는 GeSeq 프로그램 (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de)을 이용하여 예측하였으며, BLAST 조사 방법을 이용하여 확인 작업을 거쳤다. 엽록체 유전체 지도는 OGDRAW 프로그램 (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)을 이용하여 작성하였다.

5. 유전체 비교분석과 반복서열 분석

백수오와 이엽우피소의 종내(intraspecies) 및 종간(interspecific) 변이 비교분석은 5개의 백수오 서열과 2개의 이엽우피소 서열을 MAFFT 프로그램 (www.mafft.cbrc.jp)으로 다중 정렬하여 수행하였다. 엽록체 유전체 내의 반복서열 분석은 Tandem Repeats Finder (https://tandem.bu.edu)를 이용하였다.

6. 분자마커의 개발과 검증

백수오와 이엽우피소의 종내, 종간 변이를 탐지하기 위한 마커들은 종내 종간의 다형성을 대상으로 Primer blast 프로그램을 이용해 제작되었다. PCR 증폭실험은 95℃에서 7분간 pre-denaturation, 95℃에서 15~30초간 denaturation, 56~60℃에서 15~30초간 annealing, 72℃에서 20~30초간 extension을 35회 반복한 후, 72℃에서 7분간 final extension을 진행하였다. PCR 산물을 아가로스 겔에 전기영동하여 종내 또는 종간 다형성을 확인하였다. KASP(kompetitive allele specific PCR) 마커는 제조사(LGC biosearch Technologies, 영국)의 표준 프로토콜에 따라 실험했다.

실시예 1. 백미꽃속 자원의 종내 및 종간 변이 지역 발굴 및 분자마커 개발

백수오 5개 개체와 이엽우피소 2개 개체에 대하여 dnaLCW 방법을 토대로 엽록체 게놈 완전장을 완성하고 상호 비교분석을 진행한 결과, 백수오와 이엽우피소 간에는 약 250여개의 InDel(Insertion/Deletion)과 900여개의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)가 발견되었으며, 백수오내 종내 변이도 1~7개의 InDel과 1~5개의 SNP가 확인되었다(표 1). 2개의 이엽우피소 엽록체 게놈간에는 10개의 SNP와 13개의 InDel이 발견되었다.

백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈간의 염기 치환 및 InDels

	cw1	cw2	cw3	cw4	cw5	ca1	ca2
cw1	-	1	2	4	7	255	253
cw2	2	-	1	3	6	254	252
cw3	1	3	-	4	7	253	251
cw4	0	2	1	-	7	254	252
cw5	3	5	4	3	-	253	251
ca1	968	971	970	968	971	-	13
ca2	923	924	925	924	926	10	-
The lower triangle shows the total nucleotide substitutions. The upper triangle indicates the number of InDels. cw1~5: C.wilfordii, ca1: C.auriculatum (KT220734.1), ca2: C.auriculatum (KU900231.1)

상기의 변이지역들을 종합해 백수오에서 발견된 5개의 종내 변이 InDel 지역을 선정하여 총 5개의 종내 변이 특이 마커를 제작하였다(표 2). 대부분의 종내 변이는 반복염기서열 지역에서 발생한 것으로 작게는 13 bp부터 크게는 36 bp크기의 반복서열 개수에 의해 차이가 발생하였으며, 1개의 종내 변이 지역에서 2개에서 5개의 대립유전자(allele) 타입들이 발견되었다. 또한 340 bp의 큰 InDel이 존재하는 것을 발견했다. 종내 변이 특이마커 적용 결과를 종합했을 때, 27개의 백수오 집단은 14 그룹으로 식별할 수 있었고, 26개의 이엽우피소 집단은 거의 균일했지만 1개가 변이 특성을 보였다(도 2).

실시예 2. 백수오 및 이엽우피소 종간 판별 검증

백수오와 이엽우피소의 엽록체 게놈과 미토콘드리아 게놈 서열을 분석한 결과 백수오와 이엽우피소 모두 엽록체 게놈 서열의 35%가 미토콘드리아로 전이된 것이 확인되었다(도 3). 해당 지역들은 MTPT( Mitochondrial plastid DNA)라고 불리며 전이된 서열들은 백수오와 이엽우피소간에 매우 높은 유사성을 보인다. 따라서 이 지역에서 종 판별 마커를 개발할 경우 엽록체와 미토콘드리아 게놈이 동시에 증폭될 가능성이 있으며, 이는 잘못된 종 판별 결과를 초래할 수 있다. 실제 식약처의 식품진위판별법에서 사용되는 이엽우피소 특이 우성종판별 마커(Kim et al. 2017, Applied Biological Chemistry, 60(1): 79-86)는 MTPT 지역에서 개발되어 이엽우피소 뿐 아니라 백수오에서도 유전자가 증폭되어 많은 기관과 농민들이 혼란을 겪은바 있다. 식품진위판별법에 사용되는 마커는 식약처에서 유전자검사명령제로 시행되고 있는데 도 4와 같이 분석조건을 조금만 변경하여도 백수오가 이엽우피소로 잘못 해석되는 결과를 나타냈다. 또한 기존에 개발된 다른 백수오와 이엽우피소 종 판별 마커들에서도 잘못된 종 판별 결과가 나타났다.

또한, 김 등(2013, J. Med. Plants Res. 7(35): 2584-2589)의 저널에 게재된 백수오 종 특이 우성마커 사용시, 이엽우피소에서도 유전자가 증폭되었으며 이엽우피소 특이 우성마커 적용시에는 일부 백수오 개체들이 이엽우피소로 잘못 판명나는 사례가 발생하였다. 또한 대한민국약전외한약(생약) 규격집에서 제시한 종 판별 마커에서는 특정 이엽우피소 개체가 백수오로 잘못 판별되는 사례가 발견되었다(도 5). 이처럼 기존에 사용하는 유전자검사법들의 경우 백수오와 이엽우피소 집단을 확대하여 분석한다면 예측하지 못하는 결과가 초래될 수 있을 것이라 예상할 수 있다.

따라서, 더욱 명확하고 안정적으로 백수오와 이엽우피소 종을 식별하기 위한 특이 마커를 개발하기 위해 본 발명에서는 5종의 백수오와 2종의 이엽우피소 완전장(complete sequencing) 엽록체 서열을 대상으로 생물정보분석 도구를 이용한 마커 개발 후보 변이지역을 선발하였다. 먼저 선발된 변이지역 중 백수오와 이엽우피소의 종간 변이지역을 발굴하고, 이 중에서 종내 변이를 보이지 않고, MTPT 서열과의 유사성이 없는 지역을 선별하였다. 이렇게 선정된 변이 지역 중 먼저 4개의 InDel을 대상으로 종구분을 위한 공우성 마커를 디자인 하였으며(표 2), SNP의 경우 비교적 종내에 변이지역이 없이 안정적으로 유지되는 유전자 지역 내에 위치한 변이들을 대상으로 종 구분을 위한 분자 마커를 개발하였다. 4개의 공우성 마커를 백수오 집단 및 이엽우피소 개체에 적용하였을 때 종내변이 없이 명확하게 두 종이 구분되는 것을 확인할 수 있었다(도 7).

종 특이 마커 개발 파이프라인을 통해 선별된 지역 중 먼저 3개의 백수오 특이 우성 마커와 3개의 이엽우피소 특이 우성 마커를 개발하였으며(표 3), 이들 6종의 마커는 다양한 지역에서 수집된 백수오와 이엽우피소 집단에 적용하였을 때 종내 변이를 보이지 않고 안정적으로 각각의 종을 식별할 수 있었다(도 8). 또한, 백수오와 이엽우피소가 혼합된 DNA 시료에 상기 우성 마커를 적용하였을 때, 각 마커는 검출한계 1% 수준에서 백수오와 이엽우피소를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 9).

또한, 앞서 개발한 6종의 마커 외에도 별도의 6개 SNP 후보 지역(LSC 지역 3개, IR 지역 1개, SSC 지역 2개)을 대상으로 각각 두 종류의 다른 분석 플랫폼(High-resolution Melting curve analysis, HRM; Kompetetive Allele-Specific PCR, KASP)을 기반으로 하는 분자마커를 개발하였다(표 3). HRM과 KASP는 형광 신호를 이용하여 종 특이 SNP를 감별하는 마커로서 기존의 아가로스 겔 기반 마커와 비교하였을 때 분석 시간이 짧고 대용량의 시료들을 한번에 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이들 마커들 역시 다양한 지역에서 수집된 백수오 및 이엽우피소 집단에 적용하였을 때 각각의 종을 명확하게 식별할 수 있음을 알 수 있었다(도 10).

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Marker derived from complete sequencing of chloroplast genome of Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum, primer set for discrimination of Cynanchum species and uses thereof <130> PN20173 <160> 48 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccttggtgcc gcgttttaat 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgttattctt ctgacggtgg ga 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgatcgaatt gactagtttc ctttg 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggacctgtcg tgcttgtgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 taatggcgaa acggagggtt 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gaattaactc actatcttgc atc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 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<210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtctgagacg gcccagaaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cccgaaagaa ccggacatga 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ataaatcaat ggacagtctt att 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 caacattact gtaactagac c 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ttcagaagat attaatcgcg cg 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 atgattctag ccaaaaccta 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ttctgagtga actagaacgt 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cctattaata tgattattcc ga 22 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ttctgagtga actagaagaa 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cctattaata tgattattcc gc 22 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cgcctacata tttgataagt ctt 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 taaccggggg cattagagaa tt 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ttctgccaaa gagagcccta a 21 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 agtgagtata ggttattta 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ccatttctcc tacccgctgt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ccatttctcc tacccgctgg 20 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 aacaacccct tagaggaagg gcaa 24 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 aagcgatctt ttcgtagacg tttgc 25 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 caagcgatct tttcgtagac gtttgt 26 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tataatcaat ccgatcgccc gattgaat 28 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 aatgcaggga gtttattaaa accattg 27 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 actaatgcag ggagtttatt aaaaccatta 30 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 caggggctac tttaccatat tccgaa 26 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cgcaggagat ccggaccct 19 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gcaggagatc cggacccg 18 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gaatgcatct ttttctcgaa ggatcagaa 29 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 cttctaatcg ataattaggc caaagg 26 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 aaatcttcta atcgataatt aggccaaaga 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gagaaccatc ttaataaaga taagaatgaa 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 aaaacactca gatctcctat cagaaaaatt 30 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 acactcagat ctcctatcag aaaaatg 27 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 aactttatgt gagagttgaa gccccaaa 28

Claims (3)

1. 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 및 서열번호 9 및 10;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 백수오(Cynanchum wilfordii) 종내 변이 판별 및 백수오와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 프라이머 세트.
2. 제1항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 백수오(Cynanchum wilfordii) 종내 변이 판별 또는 백수오와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 키트.
3. 백수오 또는 이엽우피소 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 백수오(Cynanchum wilfordii) 종내 변이 판별 또는 백수오와 이엽우피소(C. auriculatum)를 구별하기 위한 방법.

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