KR102384539B1 - 마약성과 비마약성 대마의 식별을 위한 칸나비노이드 생합성 유전자 유래 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마약성과 비마약성 대마의 식별을 위한 칸나비노이드 생합성 유전자 유래 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 THCAS (THCA synthase) 및 CBDAS (CBDA synthase) 유전자에서 마약성 대마와 비마약성 대마를 구분할 수 있는 SNP (single nucleotide polymorphism) 변이 기반 분자마커에 관한 것이다.

Description

마약성과 비마약성 대마의 식별을 위한 칸나비노이드 생합성 유전자 유래 분자마커 및 이의 용도{Molecular markers derived from cannabinoid biosynthesis genes for discriminating drug and fiber type Cannabis sativa and uses thereof}

본 발명은 마약성과 비마약성 대마의 식별을 위한 칸나비노이드 생합성 유전자 유래 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마약성 및 비마약성 대마의 전장 유전체 정보에서 칸나비노이드 생합성에 관여하는 유전자 3종(THCAS, CBDAS, CBCAS) 및 위유전자(pseudogene)들의 염기서열을 비교하여 개발된 각 유전자 특이적 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 기반의 마약성과 비마약성 대마를 판별할 수 있는 분자마커에 관한 것이다

삼과에 속하는 일년생 식물인 대마(Cannabis sativa)는 섬유원료 및 유료(oil crops) 작물로 전세계에서 널리 재배되고 있다. 또한 향정신성 효과를 나타내는 이차 대사산물을 생산하기 때문에 전통적으로 의료용이나 종교적인 목적으로 이용되어 왔으며, 국내에서는 대표적인 마약류 식물 중 하나로 분류되어 관리되고 있다.

대마는 다양한 이차대사산물을 만들어 내는데 특히, 대마 특이 테르펜 계열의 대사산물의 총칭인 칸나비노이드(cannabinoids)에는 약 113종 이상의 다양한 물질이 포함되어 있다. 대표적인 칸나비노이드에는 Δ9-tetrahydrocannabinolic acid (THCA)와 칸나비디올산(cannabidiolic acid, CBDA)가 있으며 이들은 열에 의해 활성 형태인 테트라하이드로칸나비놀(tetrahydrocannabinol, THC)과 칸나비디올(cannabidiol, CBD)로 자연분해되는 특징을 가지고 있다. 대마 품종들은 THCA와 CBDA의 상대적 함량에 따라 크게 세 가지로 나눌 수 있는데, 첫 번째는 THCA의 함량이 매우 높은 마약성 계열(마리화나, drug type), 두 번째는 CBDA의 함량이 매우 높은 비마약성(혹은 저마약성) 계열(삼, fiber type), 마지막으로 이 둘의 중간형 계열이다.

분자 마커를 이용하여 마약성 대마와 비마약성 대마를 구분하려는 연구는 포렌식 분야를 중심으로 활발히 수행되어 왔다. 일반적으로 식물의 종 판별을 위한 DNA barcoding에는 엽록체 유전체의 일부 서열이나 핵내 45S 리보솜 유전자 서열 변이가 주로 사용된다. 이 지역들은 종내 다양성이 비교적 낮고 종간 다양성이 높기 때문에 비교적 안정적으로 종을 판별할 수 있다. 이러한 연구 내용을 바탕으로 대마의 전장 엽록체 서열이 2015년에 발표되었으며(Oh, H., et al., (2016) Mitochondrial DNA Part A 27:2835-2837; Vergara, D., et al., (2016) Mitochondrial DNA Part A 27: 3793-3794), 엽록체 유전자 지역의 변이에 관한 몇몇 연구들도 수행되었다, 그러나 마약성 대마와 비마약성 대마 모두 분류학상으로는 같은 종이고, indica와 sativa로 나뉘는 아종이 존재하지만 분류 기준이 모호하다는 연구결과가 있어 일반적인 엽록체 DNA barcoding 구간의 서열상 차이만으로 마약성과 비마약성을 식별하는 데에는 한계점이 존재한다.

이러한 이유로 엽록체 유전체가 아니라 핵 유전체에서 마약성 성분의 생합성에 관여하는 THCAS (THCA synthase)와 CBDAS (CBDA synthase)를 대상으로 해당 유전자의 서열 변이를 찾고 이를 기반으로 분자 마커를 개발하기 위한 연구들이 꾸준히 수행되어 왔다. 이전의 보고에 따르면 마약성과 비마약성 대마 품종 간의 유전체를 서로 비교하였을 때, THCAS와 CBDAS는 원시 유전자에서 분화된 이후 서로 다른 염색체에 배타적으로 존재하며, 마약성 대마는 완전한 THCAS와 위유전자(pseudogene) 형태의 CBDAS를 가지고 있는 반면, 비마약성 대마는 완전한 CBDAS와 위유전자 형태의 THCAS를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, THCAS 및 CBDAS의 유전 양식에 대해 이해가 부족했을 뿐 아니라, 대마 유전체 내에 존재하는 위(pseudo)유전자 형태의 THCAS 및 CBDAS, 그리고 CBCAS (cannabichromenic acid synthase) 등으로 인하여 마커 검정 결과를 해석하기 어렵다는 문제점 역시 여전히 남아있다.

한편, 한국공개특허 제2011-0115742호에는 막전이 수송단백질, 인산-N-아세틸뮤라모일-펜타펩타이드 전이효소, 펩타이딜-프롤릴 시스-트랜스 아이소머레이즈, 엽록체 인산글리세르산 카이네이즈 및 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소 중 선택된 1종 이상의 마커 단백질 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 '대마 종자 구분용 마커 단백질 및 이를 이용한 대마 종자 구분용 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '마약성과 비마약성 대마의 식별을 위한 칸나비노이드 생합성 유전자 유래 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 기존에 개발되었던 대마 식별 마커들의 한계점을 극복하기 위하여 염색체 수준으로 해독된 마약성, 비마약성 대마의 전장 유전체 서열을 기반으로 마약성 성분 생합성에 관여하는 주요 유전자들의 염기서열을 비교 분석하고, THCAS (THCA synthase)와 CBDAS (CBDA synthase) 유전자에서 마약성 대마와 비마약성 대마를 구분할 수 있는 SNP (single nucleotide polymorphism) 변이 기반 분자마커를 개발하였고, 이를 다양한 시료에 적용한 결과, 본 발명에서 개발한 분자마커가 마약성과 비마약성 대마를 효과적으로 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 대마 식물의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 마약성과 비마약성 대마의 판별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 법생물 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 법생물 내 마약성 또는 비마약성 대마의 혼입 여부 판별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 9의 염기서열 중 285번째 또는 612번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 1; 서열번호 9의 염기서열 중 1,272번째 또는 1,404번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 2; 서열번호 10의 염기서열 중 503번째 또는 588번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 3; 및 서열번호 10의 염기서열 중 688번째 또는 1,020번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 4;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP 마커 조성물을 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 분자마커는 마약성 대마 또는 비마약성 대마에 각각 특이적인 것으로, THC 함량 측정을 위한 이화학적 분석을 수행하지 않고도 마약성 대마와 비마약성 대마를 정확하게 판별할 수 있다. 또한, 분 발명의 분자마커는 다양한 형태의 혼용 또는 혼재된 대마 가공품들에서 마약성 또는 비마약성 대마 사용 여부를 판별하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 마약성(drug type)과 비마약성(fiber type) 대마에서 발견된 THCAS, CBDAS, CBCAS 및 위유전자(ψTHCAS/ψCBDAS/Pseudogene)의 상대적인 구조 모식도로, THCAS/CBDAS 특이적 SNPs의 위치를 수직선으로 나타내었으며, 화살표는 프라이머 위치를 보여준다. 또한, 표는 각 프라이머의 3' 말단에 위치하는 THCAS 특이적, 또는 CBDAS 특이적 SNP 변이 염기의 정보를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 분자마커를 이용한 PCR 증폭 반응 결과로, (A)는 THCAS 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과이고, (B)는 CBDAS 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과이며, (C) 다중(multiplex) PCR 결과이다. 화살표에 기재된 숫자는 사용된 프라이머의 조합을 의미하는 것으로, 각 숫자는 표 1에 기재된 serial number를 의미한다.
도 3은 본 발명의 분자마커를 이용하여 다양한 법생물 시료를 분석한 결과이다. 도 3(A)는 각 시료의 사진으로, S1은 대마 초콜릿, S2는 대마 쿠키, S3 및 S4는 대마 종자, S5는 대마 잎 시료로 추정되는 시료들이다. 도 3(B)는 THCAS 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과이고, 도 3(C)는 CBDAS 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;와 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;는 THCAS (THCA synthase) 유전자의 서열에서 마약성 대마 특이적인 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기에 기반하여 개발된 프라이머 세트이고, 상기 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;와 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;는 CBDAS (CBDA synthase) 유전자의 서열에서 비마약성 대마 특이적인 SNP에 기반하여 개발된 프라이머 세트이다(표 1 및 도 1 참고). 또한, 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3' 말단 염기가 THCAS 또는 CBDAS 특이적 SNP 변이 염기이다.

본 발명에 따른 상기 프라이머 세트 조성물은, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8;로 이루어진 4개의 프라이머 세트 중 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것으로, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 4개의 프라이머 세트는 다중(multiplex) PCR용으로도 사용가능한 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴 (biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체 (hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명에 따른 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8;의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를들면, 서열번호 1의 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8;의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

대마 식물의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 마약성과 비마약성 대마의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 마약성과 비마약성 대마의 판별 방법은 대마 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS (sodium dodecyl sulphate) 추출법, CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) 분리법 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 DNA 중합효소를 첨가하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 법생물 시료 내 마약성 또는 비마약성 대마의 혼입 여부를 판별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로는,

법생물 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 마약성 또는 비마약성 대마의 혼입 여부 판별 방법에 있어서, 상기 '법생물'이란, 국민 안전을 해하는 사건 관련 생물을 의미한다. 본 발명의 법생물 시료는 이에 한정되지 않으나, 바람직하게는 마약성 대마 식물체, 종자 또는 이들을 함유하고 있는 가공품 등일 수 있다. 본 발명의 마약성 또는 비마약성 대마 혼입 여부 판별 방법은 법생물 시료의 DNA 감정을 통해, 마약성 대마 또는 비마약성 대마의 혼입 여부에 관한 정보를 제공할 수 있게 된다.

본 발명에 따른 마약성과 비마약성 대마의 판별 방법 및 법생물 시료 내 마약성 또는 비마약성 대마의 혼입 여부 판별 방법은, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 서열분석, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 서열분석 방법은 Sanger 방법, 마이크로 전기영동 서열분석, 파이로 서열분석, 나노 포어 단일 DNA 서열분석 등을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 9의 염기서열 중 285번째 또는 612번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 1; 서열번호 9의 염기서열 중 1,272번째 또는 1,404번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 2; 서열번호 10의 염기서열 중 503번째 또는 588번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 3; 및 서열번호 10의 염기서열 중 688번째 또는 1,020번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 4;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP 마커 조성물을 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 9는 마약성 대마 품종의 THCAS 유전자 서열(GenBank accession no. MW504064.1)이며, 서열번호 10은 비마약성 대마 품종의 CBDAS 유전자 서열(GenBank accession no. KJ469374.1)이며, 각 SNP 위치의 염기변이 정보는 도 1의 표와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 대마 식물 시료들의 DNA 추출과 THC 검출

마약성과 비마약성 대마의 유전자 분석을 위해 검증 시료는 대검찰청과의 철저한 협조에 의해 이루어졌다. 마약성 대마 식물 시료와 개발된 분자 마커 검정에 사용된 5점의 대마 관련 시료(대마 초콜릿, 대마 쿠키, 대마 종자 2점, 대마 잎 감정물)는 대검찰청 디엔에이·화학분석과에서 법생물 DNA 감정을 위하여 추출한 DNA감정물의 잔여 DNA 중 일부를 제공받았으며, 비마약성 대마는 국내에서 섬유용으로 재배하기 위해 Cannabis sativa 품종을 개량한 청삼 품종을 사용하였다. 액체 질소로 냉동된 시료를 막자와 막자 사발로 균질화시키고, Qiagen Dneasy Mini kit와 제조사에서 제공하는 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 분광광도계(Nanodrop)를 이용하여 OD₂₆₀에서 농도를 측정하였다. 대마 관련 시료 5개에 대한 THC 검출은 대검찰청 법화학감정실의 도움을 받아 수행되었으며, 고체상 추출법(solid-phase extraction, SPE)과 가스크로마토그래피/질량분석법(GC/MS)을 이용하였다(Ross, S. A., et al., Journal of Analytical Toxicology (2000) 24:715-717).

2. 대마 Cannabinoid 생합성 유전자 및 위유전자(Pseudogene) 서열 발굴

마약성 대마(Purple Kush 품종, PK) 및 비 마약성 대마(Finola 품종, FN) 유전체는 NCBI에 등록되어 있는 서열을 이용하였으며(Bioproject: PRJNA73819), 대마 유전체 논문(Laverty, K. U., et al., Genome Research (2019) 29:146-156)에 기재되어 있는 Scaffold 상에서의 위치 정보를 바탕으로 THCAS, CBDAS 및 CBCAS의 염기 서열을 추출하였다. 이후 이들 서열들을 Query로 사용하고, 마약성 및 비마약성 대마 전장 유전체를 대상으로 BLASTN 분석을 통해 유전체 내에 존재하는 위유전자들의 위치 정보를 파악하고 염기서열을 추출하였다.

3. THCAS 및 CBDAS 특이 SNP 발굴 및 유전자 기반 특이 마커 개발

칸나비노이드(cannabinoid) 생합성 유전자 염기서열 3종과 BLASTN으로 발굴한 위유전자들의 염기서열들을 모두 모아 MAFFT(Katoh, K., et al., Briefings in Bioinformatics (2017) 20:1160-1166)로 pairwise 정렬을 실시하고 변이지역을 발굴하였다. 먼저 THCAS 유전자에만 특이적으로 존재하며, CBDAS, CBCAS 및 다른 위유전자들과 구별될 수 있는 SNP들을 선별하여 THCAS 특이 SNP로 분류하였다. 마찬가지로 CBDAS 유전자에만 특이적으로 존재하며, THCAS, CBCAS 및 다른 위유전자들과 구별될 수 있는 SNP를 선별하여 CBDAS 특이 SNP로 분류하였다. 분류된 각 유전자 특이 SNP 중에서 두 SNP 사이의 거리가 150~400 bp 내외인 조합을 선정하고, 이들이 정방향과 역방향 프라이머의 3' 말단에 위치할 수 있도록 Primer-BLAST(Ye, J., et al., BMC Bioinformatics (2012) 13:134)를 이용하여 특이 프라이머를 디자인하였다(표 1).

THCAS/CBDAS 특이 프라이머

Serial number	Primer name	Sequence (5' → 3')	Specificity
1	PK_AS_4_F	CAAATAACTCCCATATCCAAGCA (서열번호 1)	THCAS specific
2	PK_AS_6_R	ATTGACTAAGTGTGCATCAATA (서열번호 2)	THCAS specific
3	PK_AS_12_F	ACCCTTACGGTGGTATAATGGAG (서열번호 3)	THCAS specific
4	PK_AS_13_R	GGGACACATAAGGAGTCGTA (서열번호 4)	THCAS specific
5	FN_AS_4_F	TTGGGTTAATGAGAAAAATGAGAG (서열번호 5)	CBDAS specific
6	FN_AS_9_R	TGCTCCACCACCACGTAA (서열번호 6)	CBDAS specific
7	FN_AS_7_F	GCTATGGACCATTGATGAGAAGC (서열번호 7)	CBDAS specific
8	FN_AS_13_R	CAGCTCAATTGTCTGCAATCC (서열번호 8)	CBDAS specific

PCR을 이용한 마약성 대마 및 비마약성 대마의 판별을 위하여 약 20ng의 게노믹 DNA와 각 10 pmole의 정방향 및 역방향 프라이머를 Inclone Taq DNA polymerase 키트와 혼합하여 반응물의 총량이 25 ㎕가 되도록 제조하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 95℃(20초), 62℃(20초), 72℃(20초), 3단계를 총 35회 반복 수행하고 72℃에서 7분간 최종적으로 증폭시켰다. 증폭된 산물에 대해, 3% 농도의 아가로스 겔에서 100V 전압으로 30분간 전기영동을 실시한 후 UV광 아래에서 각 산물의 크기를 확인하였다.

실시예 1. Cannabinoid 생합성 유전자 및 위유전자(pseudogene) 서열 발굴

선행연구(Laverty 등, 2019) 결과를 바탕으로 마약성 대마와 비마약성 대마의 전장 유전체 서열을 대상으로 BLASTN 분석을 수행하여 대마에서 마약성과 비마약성 대마에 각각 배타적으로 존재하는 THCAS 유전자와 CBDAS 유전자의 위유전자 서열을 발굴하였다(도 1). 먼저 THCAS 유전자를 Query로 사용하여 마약성 대마 전장 유전체를 탐색하였을 때 염색체 2번, 3번, 6번, 7번에서 9개의 위유전자 서열이 발견되었다. 이 중 7번 염색체에 위치한 위유전자 서열 2개가 선행연구에서(Laverty 등, 2019) 보고했던 것과 동일한 것으로 분석되었고, 나머지 2번, 3번, 6번에 위치한 서열들은 보고되지 않은 새로운 위유전자 서열로 판단되었다. 2번과 7번 염색체에 존재하는 위유전자 서열을 제외한 5개 서열은 모두 길이가 1,000 bp 이상이었으며 THCAS 유전자와 비교하였을 때 78.3%~92.3%의 높은 상동성을 보여주었다. 마찬가지로 CBDAS 유전자를 Query로 사용하여 비마약성 대마 전장 유전체를 탐색하였을 때 3번과 6번 염색체에서 6개의 위유전자 서열이 발굴되었으며, 이 중 6번 염색체에 위치한 1개 서열이 기존에 Laverty 등이 보고했던 것과 동일한 것으로 분석되었고 나머지 5개 서열들은 보고되지 않은 새로운 위유전자 서열로 판단된다. 이들은 CBDAS와의 상동성이 74.6%~76.9% 정도였으며, 마약성 대마 전장 유전체에서 발굴된 위유전자보다는 다소 낮은 유사도 수치를 보여주었다.

실시예 2. THCAS , CBDAS 특이 SNP 발굴 및 마커 개발

칸나비노이드 생합성 유전자 3종과(THCAS, CBDAS, CBCAS) 앞서 발굴한 위유전자 서열들을 대상으로 MAFFT를 이용하여 다중염기서열에서의 변이 지역을 탐색하였다. 이들은 1.6 kb 정도 되는 THCAS 및 CBDAS 유전자 전반에 걸쳐 골고루 분포하고 있으며, 이 중 THCAS 유전자 특이 SNP 4개와 CBDAS 유전자 특이 SNP 4개를 발굴하여 분자 마커를 디자인 하였다(도 1). 각 유전자 특이 SNP 중에서 유전자 증폭 산물의 크기가 400 bp 이하가 되도록 2쌍의 조합을 선정하였으며, 이들을 각각 정방향과 역방향 프라이머의 3' 말단에 위치시켜 대상 유전자만을 특이적으로 증폭될 수 있도록 대립유전자 특이적(allele-specific) 프라이머를 제작하였다. THCAS 특이 SNP 4개와 CBDAS 특이 SNP 4개를 각각 증폭하는 2쌍의 프라이머를 마약성 대마 및 비마약성 대마 품종 청삼 DNA에서 PCR 하였을 때 모두 기대했던 마커 증폭 양상을 보여주는 것을 확인할 수 있었다(도 2A 및 2B).

또한, 개발한 THCAS 특이 프라이머 2쌍과 CBDAS 특이 프라이머 2쌍을 대상으로 다중(mulitplex) PCR의 구현 가능성을 테스트해 보았다. THCAS 특이 프라이머들을 이용하는 다중 PCR (PK_AS_4F, PK_AS_6R, PK_AS_12_F, PK_AS_13_R)의 경우에는 도 2A에서 확인한 증폭산물 외에도 PK_AS_4_F 프라이머와 PK_AS_13_R 프라이머의 조합으로 생성된 새로운 PCR 산물이 확인되었으며, 이들은 모두 대마 시료에서만 특이적으로 증폭되었다. 반면 CBDAS 특이 프라이머간의 다중 PCR (FN_AS_4_F, FN_AS_9_R, FN_AS_7_F, FN_AS_13_R)의 경우에는 기존 프라이머 조합으로 증폭된 산물이 아닌 다른 조합에서 유래된 크기의 증폭 산물만이 관찰되었으나 여전히 비마약성 대마 품종 청삼에서만 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있었다. 또한 THCAS 특이 프라이머 1쌍(PK_AS_12_F, PK_AS_13_R)과 CBDAS 특이 프라이머 1쌍(FN_AS_7_F, FN_AS_13_R)을 섞어 다중 PCR을 하였을 때에도, THCAS 특이 조합은 대마 시료에서만, 그리고 CBDAS 특이 조합은 비마약성 대마 품종 청삼 시료에서만 특이적으로 PCR 산물을 증폭하는 것을 확인할 수 있었다(도 2C).

실시예 3. 감정물 시료 적용

유전자 기반 마약성, 비마약성 판별 마커가 실제 법생물 감정에도 이용될 수 있을지 알아보기 위하여 4쌍의 마커를 대상으로 대검찰청에서 보관중인 DNA 시료들에 대한 식별 실험을 실시하였다(도 3A). 이들 시료는 표본으로 수집되어 있는 대마 초콜릿(추정) 1점, 대마 쿠키(추정) 1점, 대마 종자(추정) 2점, 대마 잎(추정) 1점이며, 대검찰청 법화학감정실의 이화학적 분석을 통한 사전 실험에서 대마 잎(추정) 감정물은 마약성 성분(THC)이 검출되었으나 대마 종자(추정) 2점, 대마 초콜릿(추정) 및 쿠키(추정)에서는 마약성분이 검출되지 않았었다.

각 시료들에 대해 앞서 개발한 마커 조합을 적용하였을 때, 대마 종자 2점의 경우, CBDAS 특이 프라이머 2쌍에서만 특이적인 PCR 산물이 증폭되는 것으로 보아 비마약성(혹은 저마약성) 대마 시료로 추정할 수 있었다(도 3C). 대마 잎 감정물의 경우 THCAS 특이 프라이머 2쌍에서만 특이적인 PCR 산물이 증폭되는 것으로 보아 마약성 대마 시료로 추정할 수 있었으며, 이는 THC 성분이 검출된 이화학적 분석과 일치하는 결과라 할 수 있었다(도 3B). 그러나 대마 초콜렛 1점과 대마 쿠키 1점의 경우 THCAS 특이 프라이머와 CBDAS 특이 프라이머 모두에서 PCR 산물이 증폭되어 마약성 성분이 검출되지 않은 이화학적 분석과는 다른 결과를 보여주었다(도 3B 및 3C). DNA 검사 결과로 보았을 때, 이들 제품에는 마약성 원료와 비마약성 원료가 혼합되었거나 중간형 대마가 원료로 사용되었을 것으로 추측할 수 있다. 마약성 대마 씨앗의 표피에는 제거되지 못한 모체의 세포에서 기인한 THC 성분이 극미량 존재하지만(Ross 등 2000), 껍질(포엽과 외종피)을 완전히 벗겨 가공할 경우 마약 성분이 없어 식품 원료로 사용이 가능하기 때문에 위와 같은 양상을 보이는 것으로 판단되었다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation Republic Of Korea (Supreme Public Prosecutor's Office) <120> Molecular markers derived from cannabinoid biosynthesis genes for discriminating drug and fiber type Cannabis sativa and uses thereof <130> PN21286 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caaataactc ccatatccaa gca 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 attgactaag tgtgcatcaa ta 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acccttacgg tggtataatg gag 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gggacacata aggagtcgta 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgggttaat gagaaaaatg agag 24 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgctccacca ccacgtaa 18 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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ttgggctata cgtggtggtg gaggagaaaa ctttggaatc 720 attgcagcat ggaaaatcaa actggttgct gtcccatcaa agtctactat attcagtgtt 780 aaaaagaaca tggagataca tgggcttgtc aagttattta acaaatggca aaatattgct 840 tacaagtatg acaaagattt agtactcatg actcacttca taacaaagaa tattacagat 900 aatcatggga agaataagac tacagtacat ggttacttct cttcaatttt tcatggtgga 960 gtggatagtc tagtcgactt gatgaacaag agctttcgtg agttgggtat taaaaaaact 1020 gattgcaaag aatttagctg gattgataca accatcttct acagtggtgt tgtaaatttt 1080 aacactgcta attttaaaaa ggaaattttg cttgatagat cagctgggaa gaagacggct 1140 ttctcaatta agttagacta tgttaagaaa ccaattccag aaactgcaat ggtcaaaatt 1200 ttggaaaaat tatatgaaga agatgtagga gctgggatgt atgtgttgta cccttacggt 1260 ggtataatgg aggagatttc agaatcagca attccattcc ctcatcgagc tggaataatg 1320 tatgaacttt ggtacactgc ttcctgggag aagcaagaag ataatgaaaa gcatataaac 1380 tgggttcgaa gtgtttataa ttttacgact ccttatgtgt cccaaaatcc aagattggcg 1440 tatctcaatt atagggacct tgatttagga aaaactaatc atgcgagtcc taataattac 1500 acacaagcac gtatttgggg tgaaaagtat 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cgtggtggtg gagcagaaag cttcggaatc 720 attgtagcat ggaaaattag actggttgct gtcccaaagt ctactatgtt tagtgttaaa 780 aagatcatgg agatacatga gcttgtcaag ttagttaaca aatggcaaaa tattgcttac 840 aagtatgaca aagatttatt actcatgact cacttcataa ctaggaacat tacagataat 900 caagggaaga ataagacagc aatacacact tacttctctt cagttttcct tggtggagtg 960 gatagtctag tcgacttgat gaacaagagt tttcctgagt tgggtattaa aaaaacggat 1020 tgcagacaat tgagctggat tgatactatc atcttctata gtggtgttgt aaattacgac 1080 actgataatt ttaacaagga aattttgctt gatagatccg ctgggcagaa cggtgctttc 1140 aagattaagt tagactacgt taagaaacca attccagaat ctgtatttgt ccaaattttg 1200 gaaaaattat atgaagaaga tataggagct gggatgtatg cgttgtaccc ttacggtggt 1260 ataatggatg agatttctga atcagcaatt ccattccctc atcgagctgg aatcttgtat 1320 gagttatggt acatatgtag ctgggagaag caagaagata acgaaaagca tctaaactgg 1380 attagaaata tttataactt catgactcct tatgtgtccc aaaatccaag attggcatat 1440 ctcaattata gagaccttga tataggaata aatgatccca agaatccaaa taattacaca 1500 caagcacgta tttggggtga gaagtatttt ggtaaaaatt ttgacaggct agtaaaagtg 1560 aaaaccctgg ttgatcccaa taattttttt agaaacgaac aaagcatccc acctcttcca 1620 cggcatcgtc attaa 1635

Claims (7)

1. 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 프라이머 세트 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 추가로 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 프라이머 세트 조성물.
3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별용 키트.
4. 대마 식물의 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 마약성과 비마약성 대마의 판별 방법.
5. 법생물 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
   상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 법생물 내 마약성 또는 비마약성 대마의 혼입 여부 판별 방법.
6. 서열번호 9의 염기서열 중 1,272번째 또는 1,404번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 SNP 마커 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 SNP 마커 조성물은 서열번호 9의 염기서열 중 285번째 또는 612번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 1; 서열번호 10의 염기서열 중 503번째 또는 588번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 3; 및 서열번호 10의 염기서열 중 688번째 또는 1,020번째 염기에 위치한 SNP를 각각 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커 조성물 4;를 추가로 포함하는, 마약성과 비마약성 대마 판별을 위한 SNP 마커 조성물.

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