KR102313439B1 - 진교, 진범, 흰진범 판별용 분자마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진교, 진범, 흰진범을 판별하기 위한 분자마커 및 이를 이용한 판별 방법 등에 관한 것으로, 본 발명을 통해 진교, 진범, 흰진범을 효과적으로 판별 가능하므로 분자표지를 이용한 한약재 원료판별 시스템 구축을 통해 국내 한약재 시장에 발생하는 한약재 혼·오용 등 다양한 문제를 해결할 수 있으며 독성을 가진 진범 및 흰진범의 정확한 종 확인을 통해 국민 신뢰도 향상 및 농가 소득 증대에 기여할 수 있다. 또한, 한약재 등 가공된 식물에서 분자마커를 이용하여 종을 동정하는 기술 확립하여 한약재의 정확한 종을 판별하여 안정성을 확보하여 소비자 신뢰 증진하고 약용작물산업 및 의약품산업 활성화에도 기여할 수 있다.

Description

진교, 진범, 흰진범 판별용 분자마커{Molecular marker for distinguishing Gentina macrophylla, Aconitum pseudolaeve and Aconitum longecassidatum}

본 발명은 진교, 진범, 흰진범을 판별하기 위한 분자마커 및 이를 이용한 판별 방법 등에 관한 것이다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로, 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르게 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타날 수 있으나, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않다는 단점이 있다.

이에 반해 InDel(insertion/deletion)마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로, 특정 위치에 있는DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법으로 위 방법들에 비해 장점이 있다.

한편, 문헌상으로 진교는 Gentina macrophylla Pall (큰잎용담) 등의 Gentina속 식물을 기원으로 하고 있으나, 우리나라에서는 현재 독성이 강한 흰진범, 진범 등의 Aconitum속 식물이 잘못 유통되고 있으며, Gentina속 식물이 수입되어 수입진교로 유통되고 있다. 국산진교로 유통되는 흰진범과 진범은 한국특산식물이며 독성이 강하여 부작용의 위험이 따르므로 수입진교인 큰잎용담과 구별하여 사용하여야 한다. 또한 흰진범, 진범 및 큰잎용담 뿌리의 약리작용이 알려지면서 한약재로 사용되고 있으며 약용작물의 특성상 생체나 종자 뿐만 아니라 가공되어 유통되기도 한다. 이러한 상황에 비추어 원료 혼용이 문제가 될 경우 처방의 목적에서 생리활성 및 효능이 달라지므로 큰 문제로 번질 수 있으나 이를 구별하기 위한 기술에 대한 연구는 부족한 실정이다.

따라서 진교, 진범, 흰진범의 안정적인 공급을 위하여 원료판별의 시스템 및 분자마커를 이용한 정확한 종 판별 시스템 구축이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허공보 10-1912194

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 진교, 진범, 흰진범간 차이가 있는 특이적 염기서열을 탐색한 다음 재현성이 있으며 종 간에 확실한 차이를 보이는 프라이머를 선발하여 진범과 흰진범 판별 분자마커 1개(ApAlInDel013), 진교와 진범 또는 흰진범 판별 분자마커 1개(GmApAlInDel010) 발굴하여 본 발명을 완성하였다.

상기 과제의 해결을 위해 본 발명은 진범(A. pseudolaeve)과 흰진범(A. longecassidatum) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 진범과 흰진범 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 진범과 흰진범 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 진범과 흰진범 구별용 마이크로 어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 진범과 흰진범 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 진범 또는 흰진범 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 진범과 흰진범 구별 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 진교(G. macrophylla)와 진범(A. pseudolaeve) 및 흰진범(A. longecassidatum) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 마이크로 어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 진교, 진범 또는 흰진범 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명을 통해 진교, 진범, 흰진범을 효과적으로 판별 가능하므로 분자표지를 이용한 한약재 원료판별 시스템 구축을 통해 국내 한약재 시장에 발생하는 한약재 혼·오용 등 다양한 문제를 해결할 수 있으며 독성을 가진 진범 및 흰진범의 정확한 종 확인을 통해 국민 신뢰도 향상 및 농가 소득 증대에 기여할 수 있다. 또한, 한약재 등 가공된 식물에서 분자마커를 이용하여 종을 동정하는 기술 확립하여 한약재의 정확한 종을 판별하여 안정성을 확보하여 소비자 신뢰 증진하고 약용작물산업 및 의약품산업 활성화에도 기여할 수 있다.

도 1은 유전자 라이브러리 제작을 위한 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 염기서열 분석 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 genomic DNA를 추출을 위한 CTAB method를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 ApAlInDel013 마커를 이용하여 흰진범과 진범을 판별한 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 GmApAlInDel010 구간 진교와 진범, 흰진범 InDel 차이 염기서열 정보를 나타낸 것이다.
도 6은 GmApAlInDel010 마커를 이용하여 진교와 진범 또는 흰진범을 판별한 전기영동 결과를 나타내는 것으로 GmA2의 경우 국내산 진교로 알고 입수한 것이 실제로는 진범 또는 흰진범 이라는 점도 확인한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진범(A. pseudolaeve)과 흰진범(A. longecassidatum) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 진범과 흰진범 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 진교(G. macrophylla)와 진범(A. pseudolaeve) 및 흰진범(A. longecassidatum) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1, 2, 5 및 6은 각각 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 표 1 및 3에 나타내었다.

본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 진범과 흰진범 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 “진교와 진범 또는 흰진범 구별용” 이라는 것은 예를 들어 진교와 진범이 혼합된 경우; 진교와 흰진범이 혼합된 경우; 또는 진교, 진범 및 흰진교가 모두 혼합된 경우 혼합된 종 가운데 어느 것이 진교인지 판별해 내는 용도를 의미한다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 상기 2개의 프라이머 세트를 이용하면 진교, 진범, 흰진범을 모두 구별 가능하다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 3, 4, 7 및 8의 서열 내의 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 3의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 3의 서열 내의 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3, 4, 7 및 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 진범과 흰진범 구별용 마이크로 어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 마이크로 어레이를 제공한다.

바람직하게는, 상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 진범과 흰진범 구별용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 Taq 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 진범 또는 흰진범 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 진범과 흰진범 구별 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 진교, 진범 또는 흰진범 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 진교, 진범 또는 흰진범 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 진교, 진범 또는 흰진범 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 진범과 흰진범; 진교와 진범 또는 흰진범을 구별하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 실험준비 및 방법>

실시예 1-1: 유전자원의 수집 및 처리

1차로 분자마커 개발을 위한 진교, 진범, 흰진범 유전자원은 국립생물자원관, 식물원에서 무료분양, 산지 시장에서 구매 등을 통해 확보하였으며 산지가 확실한 진범, 흰진범 유전자원의 자생지 및 농가를 방문하여 구입하였다. 2차로 진범과 흰진범은 전국 산지에 자생하는 야생 진범과 흰진범의 잎을 수집하였으며 진교는 한약재 시장에서 유통, 판매되고 있는 한약재를 구입하였다.

수집된 유전자원의 잎은 -20℃에서 보관 후 액체질소로 분쇄하여 파우더 형태로 -80℃로 보관하여 DNA추출에 사용하였으며, 한약재로 수집된 유전자원은 절편 하나를 한 개체로 취급하여 액체질소로 분쇄하여 파우더 형태로 -80℃로 보관하여 DNA추출에 사용하였다.

실시예 1-2: 라이브러리 제작 및 염기서열분석, assembly

염기서열분석용 샘플 DNA 추출을 위해 각 개체에서 Qiagen사의 DNeasy Plant Mini kit를 사용하여 DNA를 추출한 다음, DNA는 -20℃에 보관하고 이의 정량은 Quant-It (Invitrogen) kit를 이용하여 실시하였다.

라이브러리 제작을 위해 먼저 DNA를 500 bp 길이로 자른 후 End Repair (ERP) mix를 이용하여 3‘ to 5’ exonuclease 활성을 이용하여 3‘ overhang을 제거하고 polymerase 활성을 이용하여 5’ overhang을 제거하였다. 그 후 3‘ 말단에 한 개의 'A' 염기를 부착하고 adapter를 부착한 후 PCR을 이용하여 양쪽 끝에 adapter가 부착된 조각을 증폭하여 양을 많게 하여 증폭된 library를 제작하였다(도 1 참조).

염기서열 분석을 위해 Illumina HiSeq 2500을 이용하여 증폭된 library의 양쪽 염기서열을 각각 101 bp 씩 분석하였다. 구체적으로 형광이 표지된 4종류의 염기를 이용하여 DNA가 합성될 때 서로 다른 염기의 경우 서로 다른 형광이 표지되는 성질을 이용하여 염기서열을 분석을 수행하였다(도 2 참조).

상기 방법으로 얻어진 염기서열의 품질은 FastQC 프로그램을 이용하여 확인하였으며 CLC Genomics Workbench 프로그램을 이용하여 assembly를 실시하였다.

실시예 1-3: Genotyping 유전자원 DNA추출 및 Quality 확인

각 개체의 잎을 액체질소를 이용하여 분쇄한 다음 파우더 상태로 만들었다. 이를 CTAB method를 이용(도 3 참조)하여 genomic DNA를 추출하였다. Genomic DNA 농도 확인을 위해 분광광도계를 사용하여 흡광도(OD)를 측정하였으며 Genomic DNA Quality 확인의 경우 1% Agarose gel에서 100V로 20분간 전기영동을 수행하였다.

실시예 1-4: 종 판별 염기서열 탐색

CLC Genomics Workbench 프로그램을 이용하여 InDel 부위를 검색하여 InDel을 보유한 contig를 선별하고 해당 contig를 다른 유전자원에서 assembly한 contig와 비교하여 변이를 보이는 InDel 을 검색하였다.

진교는 Gentiana 속이며 진범과 흰진범은 Aconitum로 같은 속에 속하므로 염기서열의 유사성 및 이질성을 고려하여 진범과 흰진범 판별하는 염기서열 탐색과 진교를 진범 또는 흰진범과 판별하는 염기서열 탐색을 따로 진행하였다.

실시예 1-5: 종 판별 분자마커 선발 및 적용

분석된 염기서열 중에 InDel을 포함하고, 중복되지 않는 염기서열을 골라내어 InDel을 target으로 증폭산물이 150~700 bp 크기가 되도록 CLC Genomics Workbench 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였다.

상기 프라이머를 이용하여 수집된 유전자원을 대상으로 PCR을 진행하였다. 구체적으로, DNA 20ng/ul, 10umol 프라이머세트, Taq polymorase 등으로 구성된 PCR mixture를 만든 후 denaturation, annealing, extension을 35반복으로 PCR을 수행하였으며 프라이머 세트의 annealing 온도에 따라 PCR 조건을 조정하였다. PCR 수행 후 PCR product를 2% agarose gel에 전기영동 시켜 InDel로 인한 염기서열 길이 차이를 확인함으로써 종을 판별 하였다.

<실시예 2: 진범, 흰진범 판별 염기서열 탐색 및 분자마커 선발>

상기 실시예 1 방법에 따라 1차 염기서열분석 결과 5개 contig에서 17개 InDel변이가 발견하였고, 2차 염기서열분석 결과 2개 contig에서 18개 InDel변이 발견하여 총 35개 InDel변이 염기서열 발견되었다. 상기 발견된 35개 염기서열 중 1차 염기서열분석과 2차 염기서열분석 사이에 중복되는 5개 염기서열을 제외하였다. 분석된 염기서열 중에 InDel을 포함하고 InDel을 target으로 증폭산물이 150~400 bp 크기가 되도록 하여 총 21 세트의 프라이머 후보를 제작하였다.

제작된 상기 프라이머 21세트를 53개의 자원(진범 19개체, 흰진범 22개체, 종 판별이 어려웠던 12개체(이하 그룹 S라 함))에 적용하였다. 구체적으로 20 ul의 PCR 반응 용액에 게놈 DNA(20 ng)와, 제작된 forward primer(10 uM) 및 reverse primer(10 uM) 2 ul과 PCR master solution 10 ul, 그리고 멸균 증류수 2 ul을 첨가하고 혼합 한 후, 94℃에서 5분간 pre denaturation하고, 이어서 35회 사이클의 PCR 반응(94℃ 20초, 47℃ ~ 52℃ 10초, 72℃ 35초의 온도 변화 사이클)을 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 final extension 반응을 수행하였다.

PCR 반응 종료 후, 10 ul의 반응액을 2% agarose 젤에서 전기영동하고 자외선 조사 하에서 PCR 증폭 산물을 확인한 결과 진범과 흰진범이 판별되는 ApAlInDel013 프라이머를 발견하였고, 재현성 검정 결과 ApAlInDel013 프라이머는 도 4에 나타난 바와 같이 진범과 흰진범 사이에 서로 다른 밴드 사이즈를 증폭시킴을 확인하였다. 더불어 유전자원 수집 당시 종을 알 수 없었던 그룹 S는 ApAlInDel013 마커 적용결과 흰진범으로 판별되어 본 발명의 ApAlInDel013 프라이머를 통해 진범과 흰진범을 판별 할 수 있음을 확인하였다.

하기 표 1에는 진범과 흰진범 InDel 차이 염기서열 정보를 나타내었고 표 2에는 ApAlInDel013 프라이머의 정보를 나타내었다.

<실시예 3: 진교, 진범, 흰진범 판별 염기서열 탐색 및 분자마커 선발>

진교, 진범, 흰진범의 염기서열 aliment 결과 20개 InDel변이가 발견되었다(도 5 참조). 분석된 염기서열 중에 InDel을 포함하고, 변이 구간 외 3 종이 같은 서열을 가지며 InDel을 target으로 증폭산물이 150~1,000 bp 크기가 되도록 하여 총 19개 마커 후보를 제작하였다.

이러한 정보를 이용하여 제작된 프라이머 19개를 개의 93자원(진범 19개체, 흰진범 22개체, 그룹 S 12개체, 진교 40개체)에 적용하였다. 구체적으로, 20 ul의 PCR 반응 용액에 게놈 DNA(20 ng)와, 제작된 forward primer(10 uM) 및 reverse primer(10 uM) 2ul과 PCR master solution 10 ul, 그리고 멸균 증류수 2 ul을 첨가하고 혼합한 후, 94℃에서 5분간 pre denaturation하고, 이어서 35회 사이클의 PCR 반응(94℃ 20초, 47℃ ~ 52℃ 10초, 72℃ 35초의 온도 변화 사이클)을 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 final extension 반응을 수행하였다. PCR 반응 종료 후, 10 ul의 반응액을 2% agarose 젤에서 전기영동하고 자외선 조사 하에서 PCR 증폭 산물을 확인한 결과 종이 판별되는 GmApAlInDel010 프라이머를 발견하였고, 재현성 검정 결과 도 6에 나타난 바와 같이 GmApAlInDel010 프라이머는 진교와 진범, 흰진범 사이에 서로 다른 밴드 사이즈를 증폭 시킴을 확인하였다. 더불어 유전자원 수집 당시 국내산 야생 진교로 수집된 일부 샘플(도 6에서 GmA2)는 GmApAlInDel010 마커 적용 결과 진범 또는 흰진범으로 나타나 본 발명의 GmApAlInDel010 프라이머를 통해 진교와 진범 또는 흰진점을 구별 가능함을 확인하였다.

하기 표 3은 진교와 진범, 흰진범 InDel 차이 염기서열 정보를 나타낸 것이고 표 4는 GmApAlInDel010 프라이머의 정보를 나타낸 것이다.

<110> Institute for Plant Resources, Momoreal Inc. <120> Molecular marker for distinguishing Gentina macrophylla, Aconitum pseudolaeve and Aconitum longecassidatum <130> P200101 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 277 <212> DNA <213> Aconitum pseudolaeve <400> 1 cctcttgtga ctcttctttt tgactataaa cgatggaatc gtccatcgcg ttatataaaa 60 aaaagaaaga attcatttgt aagaataaga atgaatctaa gaaaatttga aaaccctgag 120 aagaaacaaa ttttctttat attatttatg atatcatatt ctaaataatg atatatcctt 180 tatcttataa acttcttaga aactatatat ataagtaaga aattactaaa aaaatggata 240 caaaaaataa gtaaaaaaag agataagaag agatccg 277 <210> 2 <211> 388 <212> DNA <213> Aconitum longecassidatum <400> 2 cctcttgtga ctcttctttt tgactataaa cgatggaatc gtccatcgcg ttatataaaa 60 aaaagaaaga attcatttgt aagaataaga atgaatctaa gaaaatttga aaaccctgta 120 agaaatgaaa tgtcacaata ttttttttat acatgtcgaa gtgatggaaa acaaaaaatc 180 tcttttacat atccaccaag tttgtcaact ttttttgaaa tgatacaaca gaagaaacaa 240 attttcttta tattatttat gatatcatat tctaaataat gatatatcct ttatcttata 300 aacttcttag aaactatata tataagtaag aaattactaa aaaaatggat acaaaaaata 360 agtaaaaaaa gagataagaa gagatccg 388 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApAlInDel013 Forward primer <400> 3 cctcttgtga ctcttctt 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApAlInDel013 Reverse primer <400> 4 cggatctctt cttatctctt 20 <210> 5 <211> 267 <212> DNA <213> Gentina macrophylla <400> 5 ccggagaatg ccttagatat atcaaaaaga tggacaatca aacctatttc tcgattcaat 60 agaagctcaa agagatgaat agggtcccaa ataaggagag atgtgtaaaa agcaagtccg 120 attacgccta ttcctaatcc taaatggaat gtaaggacgt agggatccat atgtaaatag 180 agtatctatt taaatgcgct cgaatgaccc cttctcatac tgagaatgta tagaacccta 240 ttccggtctg gtccggtatg gaatgaa 267 <210> 6 <211> 108 <212> DNA <213> Aconitum pseudolaeve, Aconitum longecassidatum <400> 6 ccggaggata ccttatatat atatatatat caaaaagatg cacaatcaaa cctacttcta 60 atgagaatgt acataaccct attccggtct ggtccggtat ggaatgaa 108 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GmApAlInDel010 Forward primer <400> 7 ccggagratr ccttagata 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GmApAlInDel010 Reverse primer <400> 8 ttcattccat accggacca 19

Claims (12)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 진교(G. macrophylla)와 진범(A. pseudolaeve) 및 흰진범(A. longecassidatum) 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 InDel 조성물.
   
8. 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 프라이머 세트.
   
9. 제7항에 기재된 InDel의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 마이크로 어레이.
   
10. 제8항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범 구별용 키트.
    
11. 진교, 진범 또는 흰진범 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제8항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 진교와 진범 또는 흰진범를 구별하는 방법.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 겔 전기영동을 통해 수행되는 것인 진교와 진범 또는 흰진범를 구별하는 방법.

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