KR102174274B1 - 대추 품종 '보은'과 '추석'을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대추 품종 '보은'과 '추석'을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커는 국내 시장에서 유통되는 대추의 품종 혼용을 방지하며 과수 작물이 품종으로써 갖추어야 할 요건인 구별성, 균일성, 안정성, 품종명칭 등을 포함한 품질관리에 활용할 수 있을 것이라 기대된다.

Description

대추 품종 '보은'과 '추석'을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating Zizyphus jujuba 'Boeun' and 'Chuseok' cultivar and uses thereof}

본 발명은 대추 품종 '보은'과 '추석'을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

대추(Zizyphus jujuba)는 갈매나무과(Rhamnaceae) 대추나무속(Zizyphus)에 속하는 식물로, 원산지는 중국이며, 중국, 한국 및 일본을 포함한 아시아, 유럽, 미국, 캐나다, 오스트레일리아 등 약 30여 개국에서 재배되는 작물이다. 핵과류(stone fruits)인 대추의 과육에는 특히 당질과 비타민 C, 아미노산류, 페놀류가 풍부하고 종자에는 올레산 등 불포화지방산이 포함되어 있으며, 항산화 또는 진정작용 등 약리효과가 우수하여 건과형태로 한방 재료나 음식 부재료로 다양하게 이용되고 있다. 키위에 비해 비타민 C가 약 4배, 당류가 사탕무보다 2배 정도 높다. 이러한 높은 이용 가치를 갖는 작물이기 때문에, 다양한 품종의 대추가 개발되었으나 정확한 품종 구분을 위한 방법은 아직 부족한 실정이다. 특히 대추는 주로 영양번식을 함으로써 몇몇 종들을 제외하고는 육안으로 품종을 구분하기 힘들고 유전적으로도 유사하여 이를 구별하기가 상당히 까다로운 작물이다. 하지만 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종 내 품종 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위하여 DNA 수준에서 유전자원의 다양성 연구를 가능하게 하는 분자마커들이 개발되고 있다. DNA 분석에 의한 분자 수준에서의 감별은 양적 수준과 더불어 다수의 특성을 파악할 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다.

차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 기술을 통해 분석한 DNA 정보를 비교하여 차이점을 찾아내고 이를 활용한 분자마커 개발은 대추 품종의 정확한 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 분자마커 중 InDel(Insertion/Deletion) 마커는 PCR(polymerase chain reaction) 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 결과를 얻을 수 있는 방법이다. InDel 마커는 염기서열에서 삽입(insertion)되거나 결실(deletion)된 염기서열의 차이를 이용하는 것으로 종간뿐만 아니라 종내에서도 다양한 유전형으로 존재하여 품종 구분에 적합한 분자마커이다.

한편, 한국등록특허 제009712호에는 '대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1860232호에는 대추 품종 보은과 추석을 판별할 수 있는 'SSR 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법'이 개시되어 있으나, InDel 다형성에 기반한 본 발명의 '대추 품종 '보은'과 '추석'을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 보은, 추석, 복조, 금성, 무등, 월출, 천상 7개 대추 품종의 유전체 정보에 근거한 다형성 마커 중, '보은'과 '추석' 품종을 다른 대추 품종들과 구분 가능하게 하며, '보은'과 '추석' 품종도 서로 판별할 수 있는 신규의 InDel 마커를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 대추 '보은'과 '추석' 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 대추 '보은'과 '추석' 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대추 '보은'과 '추석' 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명은 PCR 기술을 이용하여 대추 품종 간 다형성을 보이는 InDel 마커를 개발하여 전기영동을 통해 증폭된 밴드의 패턴을 파악함으로써 간단하고 신속하게 정확한 대추 품종을 식별할 수 있도록 하였다. 따라서, 본 발명의 분자마커를 이용하면 국내 과수 시장과 한약재 시장에서 유통되는 대추 품종을 명확히 판별하여 국내 시장에서 혼용되어 유통되는 것을 방지하는데 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 ZjncInDel8 마커를 이용하여 보은, 추석, 복조, 금성, 무등, 월출 및 천상의 대추 품종 자원들의 PCR 증폭산물을 겔 전기영동한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 대추 '보은'과 '추석' 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 대추의 게놈 상에 위치하는 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로, 대추 품종 보은, 추석, 복조, 금성, 무등, 월출 및 천상 중에서 보은과 추석을 다른 대추 품종들로부터 구분할 수 있으며, 보은과 추석에서도 각각 다른 크기의 증폭 산물이 확인되어 이들을 서로 판별할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 대추 '보은'과 '추석' 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 대추 '보은'과 '추석' 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 대추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 대추 복조 품종을 판별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 대추의 게노믹 DNA 추출

충북 보은에 위치한 대추연구소에서 입수한 보은, 추석, 복조, 금성, 무등, 월출 및 천상의 7개 대추 품종에서 각 3자원씩 어린잎 샘플을 채취하였다. NGS 분석용 게노믹 DNA는 Qiagen DNeasy Plant Mini 키트를 사용하여 추출하였고, PCR 분석을 위한 DNA는 CTAB 방법을 이용하여 추출한 후 TE 버퍼로 용출하였다.

2. 프라이머 제작

NGS(Next Generation Sequencing) 분석은 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 이렇게 얻은 데이터를 생물 정보학적 기법을 이용하여 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하기 위한 방법이다. 이 기술을 통해 얻어진 DNA 염기서열을 비교하여 7개의 대추 품종 간 다형성을 보이는 구간을 탐색하였다. InDel 다형성 부위 탐색과 상기 InDel 다형성 위치를 증폭시키는 프라이머 세트의 제작은 CLC genomics workbench 프로그램을 이용하였다.

3. PCR을 이용한 DNA 증폭

CTAB 방법을 사용하여 추출한 대추의 게노믹 DNA를 10 ng/㎕로 희석하여 사용하였고, 상기 게노믹 DNA 2 ㎕, Taq mix 10 ㎕, 5 pmol/㎕의 정방향 및 역방향 프라이머 각 2 ㎕ 및 증류수 4 ㎕를 혼합하여 20 ㎕의 PCR 조성물을 만들었다. PCR 과정은 전변성 94℃ 180초; 변성(denaturation) 94℃ 30초, 결합(annealing) 51℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 60초의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 300초 조건으로 수행하였다.

실시예 1. PCR을 이용하여 다형성을 나타내는 Indel 마커의 다형성 판독

다형성이 확인된 InDel 마커들 중 보은과 추석 품종에 대하여 다형성을 보이는 ZjncInDel8번 마커를 선발하였다. PCR을 수행한 후 3% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 ZjncInDel8 마커의 다형성 패턴분석을 실시하였다. 시료로는 복조, 금성, 무등, 월출, 천상, 보은 및 추석 품종의 자원이 각각 3개씩 이용되었다.

ZjncInDel8 마커를 이용한 PCR 결과, 복조, 금성, 무등, 월출, 천상 품종에서는 모두 267 bp의 밴드가 확인되었고, 보은 품종에서는 237 bp의 밴드가, 추석 품종에서는 237 bp와 267 bp의 밴드가 확인되어(도 1), 복조, 금성, 무등, 월출, 천상, 보은 및 추석 품종으로부터 보은과 추석 품종을 각각 구분하는 것이 가능함을 확인하였다.

ZjncInDel8 마커의 프라이머 염기서열 정보

프라이머명	서열(5'→3')
ZncInDel8 Fwd	GTGGATTTTGAAGCTATGG (서열번호 1)
ZncInDel8 Rev	GATGTGTGGTGTGTATGT (서열번호 2)

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for discriminating Zizyphus jujuba 'Boeun' and 'Chuseok' cultivar and uses thereof <130> PN19317 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtggattttg aagctatgg 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gatgtgtggt gtgtatgt 18

Claims (5)

1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 대추 복조, 금성, 무등, 월출, 천상, 보은 및 추석 품종으로부터 '보은' 또는 '추석' 품종 판별용 프라이머 세트.
2. 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 대추 복조, 금성, 무등, 월출, 천상, 보은 및 추석 품종으로부터 '보은' 또는 '추석' 품종 판별용 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 대추 복조, 금성, 무등, 월출, 천상, 보은 및 추석 품종으로부터 '보은' 또는 '추석' 품종 판별용 키트.
4. 대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 대추 복조, 금성, 무등, 월출, 천상, 보은 및 추석 품종으로부터 '보은' 또는 '추석' 품종의 판별 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 대추 복조, 금성, 무등, 월출, 천상, 보은 및 추석 품종으로부터 '보은' 또는 '추석' 품종의 판별 방법.

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