KR102286875B1

KR102286875B1 - 무측지 수박 품종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102286875B1
Application number: KR1020210075819A
Authority: KR
Inventors: 김문교; 이미선; 김주혁; 노솔지; 이이
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-08-09

Abstract

본 발명은 무측지 수박 품종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 InDel 분자마커를 무측지 수박 품종의 육종에 활용할 경우 기존의 수박 재배 과정에서 측지 제거작업을 수행하지 않음에 따라 수박 재배에 소요되는 노동력과 시간을 절감할 수 있다.

Description

무측지 수박 품종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating branchless watermelon cultivar and uses thereof}

본 발명은 무측지 수박 품종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

수박(Citrullus lanatus)은 아프리카가 원산지로 알려져 있으며 아프리카, 온대지역 및 지중해 지역에서 발견되었다. 일년생 덩굴성 식물로서 여름철 대표적인 작물로 수분 함량이 높고 체내 흡수가 잘 되는 포도당과 과당이 함유되어 있어 피로회복에 도움을 준다. 라이코펜과 β-카로틴 등의 유용성분을 포함하고 있고, 요소대사 과정의 중간 대사물질인 시트룰린이라는 아미노산이 함유되어 있어 체내 요소 합성을 도와 이뇨작용을 촉진시키며 부종, 신장염, 방광염, 요도염, 고혈압, 염증, 고열 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

육종기술의 발달로 크기와 맛이 향상된 수박이 개발되면서 고품질 수박시장이 활성화되고 있으며, 이로 인해 재배과정에 있어서도 많은 기술 향상이 요구되고 있다. 기존 수박 재배과정에 있어서 수박은 1주에 1과를 목표로 하는데, 측지 제거작업은 상당한 노동력을 요구하기 때문에 무측지 수박 품종이 실용화되면 노동력 절감을 기대할 수 있다.

최근 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종 내 품종 간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위해 DNA 수준에서 유전자원의 다양성 연구를 가능하게 하는 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 감별은 양적 수준과 더불어 다수의 특성을 파악할 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 근래에 발달한 차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 기술을 통해 DNA 정보를 비교하여 차이점을 찾아내고, 이를 활용한 분자마커 개발은 수박 품종의 정확한 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 분자마커 중 InDel(Insertion/Deletion) 마커는 PCR(polymerase chain reaction) 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 결과를 얻을 수 있는 방법이다. InDel 마커는 염기서열에서 삽입(insertion)되거나 결실(deletion)된 염기서열의 차이를 이용하는 것으로 종간뿐만 아니라 종내에서도 다양한 유전형으로 존재하여 품종 구분에 적합한 분자마커이다.

한편, 한국등록특허 제1923647호에'쥬빌리 타입 또는 크림슨 타입 수박 품종 판별용 SNP 마커'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2004-0103987호에 '사과 무측지 유전자 연관 스카 표지 개발방법'이 개시되어 있으나, InDel 다형성에 기반한 본 발명의 '무측지 수박 품종을 구별하기 위한 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 무측지 수박 품종 구별의 필요성에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 측지가 없는 수박 품종 'CBW5(품종보호출원 명칭: 순제로)'와 측지가 있는 수박 품종 '159'의 게놈 서열을 비교하여, 수박 표준유전체 기준으로 7번 염색체의 Cla97C07G132330와 Cla97C02G042050 유전자간 부위에 존재하는 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 다양한 수박 자원을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 InDel 마커가 측지가 있는 수박 품종 56개로부터 무측지 수박 품종 CBW5를 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 무측지 수박 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 무측지 수박 품종 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 무측지 수박 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 측지가 있는 다양한 수박 품종으로부터 무측지 수박 품종인 CBW5를 정확하게 구별할 있으므로, 본 발명의 InDel 분자마커를 무측지 수박 품종의 육종에 활용할 경우 기존의 수박 재배 과정에서 측지 제거작업을 수행하지 않음에 따라 수박 재배에 소요되는 노동력과 시간을 절감하는 효과가 있을 것이다.

도 1은 측지가 없는 수박 품종인 CBW5(N5)와 측지가 있는 수박 품종인 159의 염기서열을 비교하여 두 품종 간의 InDel 다형성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 Cl-N5-InDel-26 프라이머 세트를 이용하여 측지가 없는 수박 품종인 CBW5와 측지가 있는 수박 품종 56개의 PCR 증폭산물을 겔 전기영동한 결과이다. 레인 1: 31226, 레인 2: SP904, 레인 3: 7, 레인 4: 898, 레인 5: 8, 레인 6: 93, 레인 7: SP908, 레인 8: 2, 레인 9: SP909, 레인 10: 98, 레인 11: 3, 레인 12: 96, 레인 13: 4, 레인 14: 885, 레인 15: SP905, 레인 16: 160, 레인 17: 120-1, 레인 18: 6, 레인 19: SP912, 레인 20: 달코미미니, 레인 21: SWM2, 레인 22: 717, 레인 23: 95, 레인 24: SWM3, 레인 25: 애플미니나이스샷, 레인 26: SP906, 레인 27: 101, 레인 28: 331, 레인 29: SWM1, 레인 30: 5, 레인 31: 120-2, 레인 32: 씨자근, 레인 33: 11602, 레인 34: 10, 레인 35: SP911, 레인 36: 미니스타, 레인 37: 달코미흙진주, 레인 38: 275, 레인 39: 718, 레인 40: 청풍꿀, 레인 41: 까망베타, 레인 42: 725, 레인 43: 삼복꿀, 레인 44: 274-2, 레인 45: 11501, 레인 46: 11603, 레인 47: SP902, 레인 48: SP903, 레인 49: 167-2, 레인 50: 733, 레인 51: 미니미, 레인 52: 188, 레인 53: 1, 레인 54: 9, 레인 55: SP910, 레인 56: 741).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 무측지 수박 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 무측지 수박 품종을 구별할 수 있고, 상기 무측지 수박 품종은 충청북도 농업기술원 수박연구소에서 보유하는 있는 '순제로' 품종을 의미하는 것으로, 상기 '순제로'는 국립종자관리소에 품종보호출원된 출원번호 2019-596인 수박 품종이다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 및 2의 서열 내의 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(19개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는, 서열번호 1 및 2의 각 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 수박 표준유전체(97103 품종) 기준으로 7번 염색체의 Cla97C07G132330(http://cucurbitgenomics.org/feature/gene/Cla97C07G132330)와 Cla97C02G042050(http://cucurbitgenomics.org/feature/gene/Cla97C02G042050) 유전자간 부위에 위치하는 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로, 측지가 있는 수박 품종 '159'와 비교하여 무측지 수박 품종 'CBW5'의 게놈 서열에서 50 bp 염기 결실에 의해 서로 다른 크기의 증폭산물이 확인되어, 측지가 있는 수박 품종 56개로부터 무측지 수박 품종 'CBW5'만을 특이적으로 판별할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 무측지 수박 품종 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 무측지 수박 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 무측지 수박 품종을 구별하는 방법에 있어서, 상기 무측지 수박 품종은 충청북도 농업기술원 수박연구소에서 보유하는 있는 '순제로' 품종을 의미하는 것으로, 상기 '순제로'는 국립종자관리소에 품종보호출원된 출원번호 2019-596인 수박 품종이다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 무측지 수박 품종을 구별하는 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 방법은 수박 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 무측지 수박 품종을 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 무측지 수박 품종을 구별하는 방법에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 수박 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 경우, 256 bp 크기의 밴드가 검출되면 측지가 있는 수박 품종으로 판별할 수 있고, 206 bp 크기의 밴드가 검출되면 측지가 없는 수박 품종으로 판별할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정 되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 수박의 자원수집 및 게놈 DNA 추출

실험에 사용된 측지가 있는 56개의 수박 품종과 측지가 없는 수박 품종 'CBW5'는 충청북도 농업기술원 수박연구소에서 제공받았고, 상기 무측지 수박 품종 'CBW5'는 국립종자관리소에 품종보호출원(출원번호: 출원 2019-596)된 '순제로' 품종이다. 총 57개의 수박 품종의 잎을 채취하여 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법을 통해 게놈 DNA를 추출하였다. 구체적으로, 각 수박 품종의 잎에 액체질소를 넣고 막자사발을 이용하여 분쇄 시료를 만든 후 CTAB(+0.2% Mercaptoethanol) 700 ㎕를 넣고, 65℃ 항온수조에서 30분간 배양하였다. 클로로폼(chloroform)과 아이소아밀알코올(isoamylalcohol)을 24:1 비율로 700 ㎕를 넣고 원심분리하여 상층액을 수득한 후 상등액에 아이소프로판올(isopropanol)을 넣고 원심분리하여 상층액은 제거하고 펠렛을 수득하였다. 상기 수득된 펠렛에 에탄올 200 ㎕를 첨가해 씻어주고 제거한 다음 TE 버퍼를 첨가하여 펠렛을 녹여 주었으며, RNase를 첨가하여 순수 DNA만 남게 하였다.

2. InDel 마커 개발

상기 추출된 수박 품종별 게놈 DNA 중에서 'CBW5'와 '159' 두 품종의 게놈 DNA를 대상으로 NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 실시하여 수박 품종들의 DNA 염기서열 정보를 획득한 후 상기 수박 품종들의 염기서열을 CLC genomics workbench 프로그램(version 8.0.1)을 통해 비교·분석을 수행하여, 'CBW5'와 '159' 두 품종 간의 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)의 차이를 보이는 InDel 다형성 영역을 탐색하였고, 상기 InDel 다형성 영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제작하였다(표 1). 프라이머 세트는 최대 길이, 최소 길이, 증폭 산물의 크기, 온도, GC 비율 등의 조건을 조절하여 제작되었다.

본 발명의 InDel 마커는 수박 표준유전체(97103 품종) 기준으로 7번 염색체의 Cla97C07G132330(http://cucurbitgenomics.org/feature/gene/Cla97C07G132330)와 Cla97C02G042050(http://cucurbitgenomics.org/feature/gene/Cla97C02G042050) 유전자간 부위에서, 무측지 수박 품종 'CBW5'의 게놈 서열에서 50 bp 염기가 결실된 다형성 영역에 기반하여 제작된 것이다(도 1).

본 발명의 프라이머 세트 정보

프라이머 명칭	서열(5'→3') (서열번호)
Cl-N5-InDel-26-F	CTTTGCCACATCATCCTTC (1)
Cl-N5-InDel-26-R	TCCATCAATATTACCCCTCAC (2)

3. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 DNA 증폭

CTAB 방법을 이용하여 추출된 수박 품종의 DNA를 각각 10 ng/㎕ 농도로 희석하여, DNA 2 ㎕(10 ng/㎕), 2 μM의 정방향 프라이머 2 ㎕, 2 μM의 역방향 프라이머 2 ㎕, 2X Taq mix 10 ㎕, 증류수 4 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 3분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 55℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 30초의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.

실시예 1. 본 발명의 InDel 마커를 이용한 무측지 수박 품종의 구별

측지가 있는 수박 품종과 측지가 없는 수박 품종 간의 InDel 다형성에 기반하여 제작된 Cl-N5-InDel-26 프라이머 세트를 이용하여 다양한 수박 품종들의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR을 수행한 후 아가로스 겔에 전기영동하여 Cl-N5-InDel-26 프라이머 세트의 다형성 패턴 분석을 수행하였다.

그 결과, 측지가 없는 수박 품종인 'CBW5'에서는 206 bp의 밴드가 확인되었고, 측지가 있는 수박 품종 56개에서는 256 bp의 밴드가 확인되어, 측지가 있는 다양한 수박 품종으로부터 무측지 수박 품종 'CBW5'을 특이적으로 구별하는 것이 가능함을 확인하였다(도 2).

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for discriminating branchless watermelon cultivar and uses thereof <130> PN21143 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctttgccaca tcatccttc 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tccatcaata ttacccctca c 21

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 무측지 수박 품종 구별용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 무측지 수박 품종 구별용 키트.
수박 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 무측지 수박 품종을 구별하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 무측지 수박 품종을 구별하는 방법.