KR101860232B1 - Ssr 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SSR 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 대추의 감별 방법은 유전체 정보에 근거한 SSR 마커를 이용하여 대추의 품종 구분을 가능하게 하고, 국내 시장에서 유통되어지는 대추의 품종 혼용을 방지하며, 과수 작물이 품종으로써 갖추어야 할 요건인 구별성, 균일성, 안정성, 품종 명칭 등을 포함한 품질 관리에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.

Description

SSR 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법{Method for discrimination of jujube varieties using SSR marker}

본 발명은 SSR 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법에 관한 것이다.

대추 (Zizyphus jujuba) 나무의 열매는 예로부터 한약재와 식용을 위해 다양한 용도로 널리 이용되어 온 과실이다. 최근에는 높은 항산화 효과와 암세포 증식 억제 효과 등의 효능이 있다는 것도 알려졌다. 이러한 다양한 이용 및 높은 가치에도 불구하고, 정확한 품종 구분을 위한 방법은 아직 미미하다.

기존의 품종 구별 방법은 육안으로 구별되는 형태적 특성에 근거한 것이나, 이와 같은 방법은 환경에 의해 많은 영향을 받으므로 정확한 품종 구별 방법으로써는 한계를 가진다. 그러나, 대추의 유전체 정보에 근거한 마커의 개발은 염기서열에 의해 구분되는 것이므로 영양번식을 하는 대추에게 있어 정확한 품종 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 마커 중 SSR 마커는 PCR 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 결과를 얻을 수 있는 방법이다.

SSR (Simple Sequence Repeat)은 짧은 염기서열(2-10 뉴클레오티드)의 반복으로 이루어진 부분으로, 진핵 세포의 유전체에 매우 풍부하게 존재하며, 집단 또는 개체 간의 변이가 매우 높다. 반복 서열의 길이에 차이가 있는 것을 다형성(polymorphism)이라고 하며, 이를 검출함으로써, 집단 또는 개체의 다양성 및 유전적 구조를 분석하는데 많이 이용되어진다. 또한, 종간 및 종내에서도 다양한 길이로 존재하여, 품종 구분에 적합한 마커이다. SSR 프라이머는 이 반복 서열 구간을 검출하기 위하여 제작된 프라이머이다. SSR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행한 후, 반복 서열의 차이인 다형성을 이용하여 품종을 구별하는 방법은 비교적 용이한 방법으로 육안 구별이 되게 할 뿐만 아니라, 실험적으로 재현성이 높아 신뢰도가 높은 방법이다.

대한민국 공개 특허 제2015-0003589호

본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 포함하는, 대추 품종 감별용 SSR 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 대추 품종 감별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 대추 품종 감별용 키트를 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 대추로부터 얻은 DNA 시료에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 대추 품종의 감별 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 포함하는, 대추 품종 감별용 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 대추 품종은 추석 또는 보은일 수 있다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 대추 품종 감별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 대추 품종 감별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 대추의 품종 중 추석 또는 보은을 감별하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 대추로부터 얻은 DNA 시료에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 대추 품종의 감별 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감별은 대추의 품종 중에서 추석 또는 보은을 감별할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 대추의 감별 방법은 유전체 정보에 근거한 SSR 마커를 이용하여 대추의 품종 구분을 가능하게 하고, 국내 시장에서 유통되어지는 대추의 품종 혼용을 방지하며, 과수 작물이 품종으로써 갖추어야 할 요건인 구별성, 균일성, 안정성, 품종 명칭 등을 포함한 품질 관리에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 '추석' 품종을 식별하기 위한 ZiSSR 0249 프라이머 세트에 대한 다형성 패턴 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 '보은' 품종을 식별하기 위한 ZiSSR 5666 프라이머 세트에 대한 다형성 패턴 사진을 나타낸 것이다.

본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 포함하는, 대추 품종 감별용 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

상기 대추는 한국, 중국, 일본에서 식용 또는 약용으로 사용되는데, 원산지에 따라 그 품종이 상이하다. 우리나라에서는 1970년대까지 품종으로 명명된 것은 없고 대추 주산지의 명칭을 붙여서 충청도의 보은대추, 경기도의 경대추, 논산의 연산대추, 밀양의 고례대추, 경상북도의 동곡대추 등으로 불렀다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 다양한 대추 품종 중에서 '추석' 또는 '보은' 품종을 감별하는데 사용될 수 있다.

'추석' 품종은 숙기가 빨라 추석용 품종으로 적합하며, 수확전 열과 및 낙과가 매우 적은 수량성이 우수한 품종이다. 또한, 당도는 30 Bx 이상의 고당도이므로 건과용뿐만 아니라 생과용으로도 이용이 가능하다. 겨울철에는 3-4년생 까지는 보온 대책을 세워야하나, 비교적 내한성이 강한 품종이다.

'보은' 품종은 충청남북도 지방종으로 알려져 있으며, 유행을 타지 않으며 우리나라 사람들이 가장 선호하는 품종이다. 크기는 호두보다 약간 작고, 당도가 26~27Bx 정도로 그다지 높지 않은 품종이어서, 생과용 보다는 건과용으로 주로 이용되며 조생종이다. 형태적 특징으로 핵속에 종자(인)가 없는 것이 특징이다.

본 명세서에서 '프라이머'는 그 서열과 상보적인 염기서열을 갖는 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 SSR 마커의 증폭을 위하여 각각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머로 구성되어 있다.

본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 대추 감별용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 대추 감별용 키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 대추 감별용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 PCR 반응에 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP를 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물 또는 키트는 다양한 대추 품종 중 '추석' 또는 '보은'을 감별하는데 사용될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 감별하고자 하는 대상 대추로부터 얻은 DNA 시료에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 대추 품종의 감별 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 감별 방법은 PCR을 통해 수득한 PCR 산물의 전기영동 패턴을 분석하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 예컨대 상기 PCR은 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분간 preheating을 거친 후, 90 내지 100℃에서 1분 내지 5분(denaturation), 45 내지 60℃에서 10초 내지 50초(annealing), 72℃에서 30초 내지 2분(extension)간의 반응을 30 내지 40회 실시하고, 최종 extension 과정으로 72℃에서 1 내지 10분간 하는 과정을 30 내지 40 cycle 반복하여 반응시키는 과정을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR 수행을 통해 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide: EtBr), Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사선 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCT 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사선이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사선으로 표지될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 증폭된 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사선 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사선 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사선 측정기구, 예를 들면, 가이어 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사선을 측정할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 감별 방법은 다양한 대추 품종 중 추석또는 보은을 감별하는데 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

대추의 품종 식별을 위한 마커 제조방법

<1-1> 대추의 genomic DNA 추출

대추의 잎을 채취하여 Biomedic Plant Genomic DNA Extraction Kit를 이용하여 대추의 genomic DNA를 추출하였다.

<1-2> PCR 을 이용한 DNA 증폭

추출한 DNA를 이용하여 DNA를 5 ng/ul의 농도로 희석하여, 총 20 ng의 genomic DNA, SSR primer 1 uM을 넣어 25 ul의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 preheating 95℃ 180 초, denaturation 95℃ 30 초, annealing 55℃ 30 초, extension 72℃ 30 초, post extension 72℃ 300 초, 총 35cycle을 반복하여 PCR을 수행하였다.

<1-3> PCR 에 사용된 SSR 마커

대추 추석 품종을 구별하기 위하여 1개의 SSR 프라이머 세트 ZiSSR 0249를 이용하였으며,보은 품종을 구별하기 위하여 1개의 SSR 프라이머 세트 ZiSSR 5666 을 이용하였다. 개발되어진 SSR 프라이머의 염기 서열 정보는 하기 표 1과 같다.

프라이머	서열(5-3)	서열번호
ZiSSR 0249-F	GAGAGTTGGTGAGACCATCG	1
ZiSSR 0249-R	CACTCTTTTTAGTCGGCGTG	2
ZiSSR 5666-F	CCGCGGCTTTCTATGTAGT	3
ZiSSR 5666-R	GCTGCTACAACTTGGCTGTT	4

< 실시예 2>

본 발명의 마커를 이용한 대추 품종 확인

본 발명자들은 PCR을 수행한 후, Fragment Analyzer를 이용하여 전기영동을 하여 추석과 보은 품종에서 나타나는 각각의 특이적인 밴드를 검출하기 위한 다형성 패턴을 판독하였다.

대추 총 12품종 62개체를 이용하여, PCR을 수행한 후, Fragment Analyzer를 이용하여 전기영동을 하여 다형성 패턴을 판독한 결과, 본 발명의 'ZiSSR 0249' 프라이머 세트를 이용한 경우, 191 bp에서 추석 품종 특이적인 밴드가 검출되어 다른 11개 품종과 구분할 수 있다.

또한, 대추 총 12품종 62개체를 이용하여, PCR을 수행한 후, Fragment Analyzer를 이용하여 전기영동을 하여 다형성 패턴을 판독한 결과, 보은 품종에서만 198 bp의 단일 밴드를 나타내었다.

따라서, 'ZiSSR 5666' 프라이머 세트를 이용 시보은 품종을 국내 품종 내에서 뿐만 아니라, 일본 및 중국 품종과도 구별할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for discrimination of jujube varieties using SSR marker <130> PN1611-428 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZiSSR 0249-F primer <400> 1 gagagttggt gagaccatcg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZiSSR 0249-R primer <400> 2 cactcttttt agtcggcgtg 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZiSSR 5666-F primer <400> 3 ccgcggcttt ctatgtagt 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZiSSR 5666-R primer <400> 4 gctgctacaa cttggctgtt 20

Claims (7)

1. 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 대추 품종 감별용 조성물로서,
   상기 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트는 대추 품종 추석을 감별하고,
   상기 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트는 대추 품종 보은을 감별하는 것인 대추 품종 감별용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 대추 품종 감별용 키트로서,
   상기 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트는 대추 품종 추석을 감별하고,
   상기 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트는 대추 품종 보은을 감별하는 것인 대추 품종 감별용 키트.
5. 삭제
6. 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트를 이용하여 대추로부터 얻은 DNA 시료에 대해 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 대추 품종의 감별 방법으로서,
   상기 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트는 대추 품종 추석을 감별하고,
   상기 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트는 대추 품종 보은을 감별하는 것인 대추 품종의 감별 방법.
7. 삭제

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