CN114182033B - 薄壳山核桃Mahan、Pawnee和Greenriver的SSR分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及薄壳山核桃品种鉴定技术领域,具体涉及薄壳山核桃Mahan、Pawnee和Greenriver的SSR分子标记及其应用。本发明提供的SSR分子标记由SEQ ID NO.1‑2所示的引物扩增得到。该SSR分子标记能够实现薄壳山核桃品种Mahan、Pawnee和Greenriver的鉴定,既可以从不同薄壳山核桃品种中将Mahan、Pawnee和Greenriver鉴别出来,而且,还可用于Mahan、Pawnee和Greenriver之间的区分鉴别。利用该SSR分子标记进行薄壳山核桃品种鉴定,能够有效降低鉴定成本、提高效率、而且操作简便、鉴定结果准确,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及薄壳山核桃品种鉴定技术领域,具体涉及鉴别薄壳山核桃品种Mahan、Pawnee和Greenriver的SSR分子标记及其应用。
背景技术
薄壳山核桃(Carya illinoinensis),是胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(Carya)的植物,是世界范围重要的干果和木本油料树种。该树种原产于美国南部和墨西哥北部,中国引种已有100余年的历史。早期作为绿化树种引进,目前主要转为果用。薄壳山核桃在中国又称碧根果,其坚果含油率高,其中不饱和脂肪酸占总脂肪含量的90%以上,同时含有丰富的酚类物质、矿物质元素、氨基酸、维生素等,营养丰富、经济价值高。随着薄壳山核桃种植的推广,对于良种苗木的需求迅速增加,良种是确保果园能够优质丰产的基础,如何确保苗木品种的真实性成为亟待解决的问题。
‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’是中国薄壳山核桃生产中较早引种且应用较多的品种。‘Mahan’的中文译名通常为‘马汉’或‘马罕’,大果型品种,单果重9克以上,雌蕊先熟型品种。‘Pawnee’的中文译名通常为‘波尼’,由‘Mohawk’בStarking Hardy Giant’两个品种杂交而成,单果重在8克左右,为雄蕊先熟型品种。‘Greenriver’实生选育,与品种‘Major’等在同一林分选出,单果重为6.5g,雌蕊先熟型品种。这几个品种在坚果品质和丰产性等方面表现良好,深受种植户的青睐。薄壳山核桃雌雄同株异花,雌雄花期不遇,需对不同品种进行配置才能充分授粉,实现优质丰产。不同品种之间也存在区域适应性和栽培管理的差异。然而,薄壳山核桃引种和繁育单位较多,过程中可能存在引种不规范,品种混杂,“一物多名”和“多物一名”等现象。而且,苗期不同品种之间表型差异不明显,难以实现有效区分,如果种植的品种与目标不符,往往需要4~6年开花结实之后才能发现,为育种单位和种植户造成较大的人力、时间和经济上的损失。因此,在薄壳山核桃建园初期,确定品种的真实性就显得尤为重要。在生产实践中,通常依靠有经验的专家通过叶片、果实、花、树姿等表型特征实现品种的辨别,但是同一品种在不同气候区域条件、不同生长发育阶段、不同栽培条件下表型性状具有较大差异,造成依赖经验的品种鉴别方法成功率不高。
近年来,分子标记因能直接检测DNA水平的差异,不依赖于表型性状,稳定性强、可重复性好等优势,已广泛应用于动植物的品种鉴定和亲缘关系研究。在薄壳山核桃方面,已有基于分子标记手段的亲缘关系研究,但存在品种覆盖度低、标记数量多、操作复杂等问题。因此亟需建立一种准确率高、操作简便、鉴别结果稳定的薄壳山核桃品种鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的SSR分子标记及其应用。
为实现上述目的,本发明使用生物信息学的方法,从薄壳山核桃全基因组序列中发掘超过14万个SSR(简单重复序列标记,Simple Sequence Repeat,SSR)位点,批量设计特异性引物超过6万对。进一步对这些引物进行筛选,主要筛选标准如下:1)SSR位点的类型为2~4个碱基重复;2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃;3)引物中不包含未知碱基;4)目标产物在100bp~300bp。初步筛选并合成300对引物。采集在中国应用较多的36个薄壳山核桃品种的嫩叶,提取基因组DNA,对PCR反应条件、扩增产物检测条件进行优化。使用优化后的程序对36个品种进行扩增并检测,筛选得到一对扩增效果好、稳定性强、在薄壳山核桃常用品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’中均有特异性条带的SSR引物,从而实现使用1个SSR分子标记准确鉴别‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’。
具体地,本发明提供以下技术方案:
第一方面,本发明提供用于鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的SSR分子标记,所述SSR分子标记由SEQ ID NO.1-2所示的引物扩增得到。
以上所述的引物序列具体如下:
SEQ ID NO.1(5’-3’):GACCACCTTACGTGGGAGAA;
SEQ ID NO.2(5’-3’):GCATCGAGACACATCCTTTG。
第二方面,本发明提供用于鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
第三方面,本发明提供包含如SEQ ID NO.1-2所示的引物的试剂盒。
优选地,所述试剂盒还包括用于PCR扩增的其他成分,包括但不限于PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照等。
第四方面,本发明提供的包含如SEQ ID NO.1-2所示的引物的DNA芯片。
第五方面,本发明提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’中的应用。
本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在构建薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’的DNA指纹数据库中的应用。
本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’的分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’的种质资源鉴定中的应用。
本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’的种苗质量检测中的应用。
第六方面,本发明提供一种鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’的方法,该方法包括以下步骤:以待鉴定薄壳山核桃的DNA为模板,采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增,若得到的扩增产物的长度为96bp和108bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Mahan’;若得到扩增产物的长度为96bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Pawnee’;若得到扩增产物的长度为94bp和96bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Greenriver’。
具体地,所述鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’的方法包括如下步骤:
(1)提取待鉴定薄壳山核桃的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板,采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增;
(3)根据PCR扩增产物的条带类型,判断待鉴定薄壳山核桃是否为薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’。
优选地,所述PCR扩增的反应程序包括:95℃,2min;94℃变性40s,56℃退火45s,72℃延伸1min,29个循环;72℃延伸7min。
或者,所述PCR扩增的反应程序包括:94℃,3min;94℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸3min。
本发明的有益效果在于:本发明提供的SSR分子标记能够实现薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的鉴定,既可以从不同薄壳山核桃品种中将‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’鉴别出来,而且,还可用于‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’之间的区分鉴别。利用该SSR分子标记进行‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的鉴定,能够有效降低鉴定成本、提高效率、而且操作简便、鉴定结果准确,该SSR分子标记和鉴定方法具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中利用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)对36个薄壳山核桃品种的45个样品进行PCR扩增得到的扩增产物的电泳图,其中,M泳道为DNA Marker,从下到上的条带大小分别为:100、150、200、250、300、400、500bp;其他1~45泳道每一个泳道为一个样品,第1~45泳道的样品依次为:‘Kanza’、‘Mohawk’、‘Shawnee’、‘Mahan’、‘Mahan’(生物学重复)、‘Osage’、‘Pawnee’、‘Mcmillan’、‘Lakota’、‘Silver back’、‘Carter’、‘Colby’、‘Stuart’、‘Greenriver’、‘Waco’、‘Major’、‘Oconee’、‘Oconee’(生物学重复)、‘Navaho’、‘Gloria Grande’、‘Forkert’、‘Choctaw’、‘Creek’、‘Mohawk’(生物学重复)、‘Elliott’、‘Barton’、‘Creek’(生物学重复)、‘Desirable’、‘Graking’、‘Greenriver’(生物学重复)、‘Hopi’、‘Jayhawk’、‘Kiowa’、‘Lakota’(生物学重复)、‘Maramec’、‘Mohawk’(生物学重复)、‘Nacono’、‘Navaho’(生物学重复)、‘Oconee’(生物学重复)、‘Posey’、‘Houma’、‘Yates68’、‘Shepherd’、‘Deerstand’、‘Chetopa’。
图2为本发明实施例2中利用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)扩增得到的薄壳山核桃‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的PCR扩增产物的毛细管电泳图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的36个薄壳山核桃品种可通过市售购买途径获得,或者从中国林业科学研究院亚热带林业研究所种质资源库获得,其中,‘Mahan’、‘Pawnee’、‘Greenriver’、‘Mohawk’、‘Osage’、‘Lakota’、‘Mcmillan’、‘Carter’、‘Colby’、‘Stuart’等品种已在文献(Zhang C.C.,Yao X.H.,Ren H.D.,Chang J.,Wu J.,Shao W.Z.,FangQ.Characterization and Development of Genomic SSRs in Pecan(Caryaillinoinensis).Forests.2020,11(1),61.)中公开。
实施例1SSR分子标记的开发
从薄壳山核桃全基因组序列中发掘超过14万个SSR位点,批量设计特异性引物超过6万对。进一步对这些引物进行筛选,主要筛选标准如下:1)SSR位点的类型为2~4个碱基重复;2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃;3)引物中不包含未知碱基;4)目标产物在100bp~300bp。初步筛选并合成300对引物。
选取在中国应用较多的36个薄壳山核桃品种,这36个品种中包含与‘Mahan’和‘Pawnee’亲缘关系很近的多个品种,包括‘Mohawk’(‘Pawnee’的亲本)、‘Creek’(与‘Pawnee’有共同的亲本‘Mohawk’),以及‘Mahan’的子代‘Lakota’、‘Choctaw’、‘Kiowa’、‘Lakota’和‘Mohawk’等。采集36个薄壳山核桃品种的嫩叶,每个品种至少采集3个样品,分别提取基因组DNA,对PCR反应条件、扩增产物检测条件进行优化。使用优化后的程序对36个品种的各样品进行扩增并检测,筛选得到一对扩增效果好、稳定性强、在薄壳山核桃常用品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’中均有特异性条带的SSR引物,可实现使用1个SSR分子标记准确鉴别‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’,该SSR引物的序列如下:
P1:SEQ ID NO.1(5’-3’):GACCACCTTACGTGGGAGAA;
P2:SEQ ID NO.2(5’-3’):GCATCGAGACACATCCTTTG。
利用上述SSR引物进行PCR扩增,薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’均存在特异性条带,其中,‘Mahan’在96bp和108bp处均有单一条带,‘Pawnee’仅在96bp处有单一条带,‘Greenriver’在94bp和96bp处均有单一条带。
实施例2利用SSR分子标记鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’
利用实施例1获得的SSR分子标记及其扩增引物进行薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的鉴定,具体方法如下:
1、基因组DNA的提取和检测:
采集待鉴定薄壳山核桃的幼嫩叶片,使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)提取待鉴定薄壳山核桃的叶片DNA,,具体步骤如下:
(1)将Spin Column置于Collection Tube中,加入250μl Buffer BL,12000rpm/min离心1min活化硅胶膜;
(2)取幼嫩叶片组织(不大于100mg),加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中,加入400μl Buffer gP1,涡旋振荡1min,65℃水浴10~30min,期间可取出颠倒混匀以充分裂解;
(3)加入150μl Buffer GP2,涡旋振荡1min,冰浴5min;
(4)12000rpm/min离心5min,将上清转移至新的离心管中;
(5)加入上清等体积的无水乙醇,立即充分振荡混匀,液体全部转入Spin Column中,12,000rpm/min离心30s,弃废液;
(6)向Spin Column中加入500μl Buffer PW(使用前已加入无水乙醇),12000rpm/min离心30s,弃废液;
(7)向Spin Column中加入500μl Wash Buffer(使用前已加入无水乙醇),12000rpm/min离心30s,弃废液;
(8)重复操作步骤7;
(9)将Spin Column放回Collection Tube中,12,000rpm/min离心2min,开盖晾干1min;
(10)取出Spin Column,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中央处加50~100μl TE Buffer(65℃预热TE Buffer),20~25℃放置2min,12,000rpm/min离心2min。
(11)使用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量,使用紫外分光光度计检测基因组DNA浓度。
2、SSR分子标记的PCR扩增
以提取的不同样本的基因组DNA为模板,使用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)对不同样本进行PCR扩增,PCR反应体系如表1所示。
表1 PCR扩增的反应体系
PCR反应条件如表2所示。
表2 PCR扩增的反应条件
3、PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表3所示。
表3非变性聚丙烯酰胺凝胶配方
电泳方法如下:
电泳缓冲液为0.5×TBE,左右端空格避免边缘效应,电泳上样量1μl,两端各设置一个泳道上样50bp Marker。电泳条件为:180V,400mA,电泳180min。
电泳结束后取出胶,用枪尖进行打孔标记,AgNO3溶液(1.0g AgNO3溶于1L水中)银染10-15min;显色液(20g NaOH溶于1L水中,加入10ml甲醛)显色5-8min;水漂洗2次后置于灯箱上拍照,人工判定各个样本的扩增产物的条带大小。
当扩增产物在96bp和108bp处均有单一条带时确定该样本为‘Mahan’,当扩增产物仅在96bp处有单一条带时,确定该检测样本为‘Pawnee’,当扩增产物在94bp和96bp处均有单一条带,确定该检测样本为‘Greenriver’。
利用上述鉴定方法对薄壳山核桃种质资源库采集的36个薄壳山核桃品种的样品进行鉴定,部分样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示,图1中包含了36个品种的样品以及‘Mahan’、‘Oconee’、‘Greenriver’、‘Navaho’、‘Creek’、‘Mohawk’等部分品种的生物学重复,共计45个样品,其它各生物学重复之间均具有相同的检测结果,未全部列出。
4、PCR扩增产物的毛细管电泳检测
以提取的不同样本的基因组DNA为模板,使用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)对不同样本进行PCR扩增,PCR反应体系如表4所示。
表4 PCR扩增的反应体系
PCR反应条件如表5所示。
表5 PCR扩增的反应条件
ABI 3730毛细管电泳检测方法如下:
根据琼脂糖凝胶电泳检测结果估计PCR产物浓度,并将产物稀释10倍后,与ROX500内标(大小分别为70,80,100,120,140,160,180,200,240,280,320,360,400,450,490,500base)混匀,反应体系见表6,于95℃反应5min后迅速冰浴3min,然后置于ABI3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测,各品种的检测结果见表7,其中,‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’品种的PCR扩增产物的检测结果如图2所示。
表6毛细管电泳反应体系
表7 36个薄壳山核桃品种PCR扩增产物的条带大小
结果表明,36个品种的各生物学重复之间的带型一致,表明该SSR分子标记在同一品种不同个体间可重复性较好。‘Mahan’样本的扩增产物在96bp和108bp处均有单一条带,‘Pawnee’样本的扩增产物仅在96bp处有单一条带,‘Greenriver’在94bp和96bp处均有单一条带。
以上结果表明,本发明提供的SSR分子标记能够实现‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’与其他33个薄壳山核桃品种的准确区分,从36个薄壳山核桃品种中鉴别出常用品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’,特别是与其亲缘关系很近的品种‘Lakota’、‘Choctaw’、‘Mohawk’、‘Creek’也不会对检测结果造成干扰。本发明的SSR分子标记实现了使用单一SSR分子标记即可进行‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的鉴定。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所
<120> 薄壳山核桃Mahan、Pawnee和Greenriver的SSR分子标记及其应用
<130> KHP211121080.6
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccacctta cgtgggagaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatcgagac acatcctttg 20
Claims (4)
1.SSR分子标记或引物或试剂盒在从36个薄壳山核桃品种中鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’中的应用;
所述SSR分子标记由SEQ ID NO.1-2所示的引物扩增得到;
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示;
所述试剂盒包含所述引物;
所述36个薄壳山核桃品种为‘Carter’、‘Choctaw’、‘Colby’、‘Creek’、‘Desirable’、‘Elliott’、‘Forkert’、‘Gloria Grande’、‘Greenriver’、‘Kanza’、‘Lakota’、‘Mahan’、‘Major’、‘McMillan’、‘Mohawk’、‘Navaho’、‘Oconee’、‘Osage’、‘Pawnee’、‘Shawnee’、‘Stuart’、‘Waco’、‘Silver back’、‘Barton’、‘Graking’、‘Hopi’、‘Jayhawk’、‘Kiowa’、‘Maramec’、‘Nacono’、‘Posey’、‘Houma’、‘Yates68’、‘Shepherd’、‘Deerstand’、‘Chetopa’。
2.SSR分子标记或引物或试剂盒在区分鉴别薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’中的应用;
所述SSR分子标记由SEQ ID NO.1-2所示的引物扩增得到;
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示;
所述试剂盒包含所述引物。
3.一种从36个薄壳山核桃品种中鉴定薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’或‘Greenriver’的方法,其特征在于,包括:以待鉴定薄壳山核桃的DNA为模板,采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增,若得到的扩增产物的长度为96bp和108bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Mahan’;若得到扩增产物的长度为96bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Pawnee’;若得到扩增产物的长度为94bp和96bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Greenriver’;
所述36个薄壳山核桃品种为‘Carter’、‘Choctaw’、‘Colby’、‘Creek’、‘Desirable’、‘Elliott’、‘Forkert’、‘Gloria Grande’、‘Greenriver’、‘Kanza’、‘Lakota’、‘Mahan’、‘Major’、‘McMillan’、‘Mohawk’、‘Navaho’、‘Oconee’、‘Osage’、‘Pawnee’、‘Shawnee’、‘Stuart’、‘Waco’、‘Silver back’、‘Barton’、‘Graking’、‘Hopi’、‘Jayhawk’、‘Kiowa’、‘Maramec’、‘Nacono’、‘Posey’、‘Houma’、‘Yates68’、‘Shepherd’、‘Deerstand’、‘Chetopa’。
4.一种区分鉴别薄壳山核桃品种‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Greenriver’的方法,其特征在于,包括:以待鉴定薄壳山核桃的DNA为模板,采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增,若得到的扩增产物的长度为96bp和108bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Mahan’;若得到扩增产物的长度为96bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Pawnee’;若得到扩增产物的长度为94bp和96bp,则判断待鉴定薄壳山核桃为‘Greenriver’。
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