CN110257551B - 一套用于构建桃dna指纹图谱的ssr引物、应用及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套用于构建桃DNA指纹图谱的SSR引物、应用及构建方法，所述SSR引物由10对引物组成，包括如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列。本发明通过对6份亲缘关系较远的种质为试材进行高深度重测序，对桃全基因组水平上的SSR位点进行检测，鉴定出141895个SSR标记位点。利用生物信息学手段分析了桃全基因组SSR位点在6份种质上的分布和多态性，获得187对多态性SSR位点。对187个位点设计出164对SSR引物，利用21个代表性品种为试材，对初始引物进行PCR扩增，从中获得10对多态性高、稳定性强、分辨率高、重复性好，非特异扩增片段少的核心引物。用10对核心引物对200份种质进行扩增，获得它们的基因型数据，区分率达到100％。
Description
技术领域
本发明涉及一套用于构建桃DNA指纹图谱的SSR引物、应用及构建方法，属于桃分子生物技术领域。
背景技术
桃(prunus persica L.)，2n＝16，是一种重要的蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)多年生木本落叶果树，是世界四大落叶果树之一。目前，桃在全世界范围内栽培广泛，全球240多个国家(地区)均有栽培；根据世界粮食与农业组织的统计，2017年世界桃总产量2446.5万吨，产值高达137.0亿美元，其中中国桃栽培总面积为78.2万公顷，产量1418.97万吨，分别占世界的51.2％和58％，是世界第一产桃大国。
桃品种资源是桃产业的基础，我国桃品种资源圃现保存的种质2000多份，每年选育的新品种都有近百个。在苗木市场，具有相似表型的不同芽变品种和同物异名现象非常普遍，不仅果农难以判断最适合的种质，也不利于育种者保护新品种的知识产权。在过去一段时间里，对植物新品种进行特异性、一致性和稳定性(简称DUS)测试是农作物品种鉴定常用的技术手段，但在多年生无性繁殖作物上应用周期长、易受环境影响、稳定性差等问题，在一定程度上限制了DUS工作的开展。目前在果树上仅有苹果和枣建立了相应的DNA身份鉴定分子标准，在桃上尽管有不少标记开发种质分子身份证构建的研究，但存在鉴定流程不系统、程序不标准、结果重复性差等问题。
近20年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术，如RFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism，扩增片段长度多态性)、RAPD(random amplified ploymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)、SNP(Single NucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性)等，能从本质上反映生物个体差异，具有高度个体特异性和稳定可靠性，能够准确、快速的对新品种及现存品种进行鉴定。RFLP、RAPD、AFLP技术曾被应用到建库上，但因技术的稳定性、复杂性及数据整合等问题未广泛应用，其中SSR和SNP由于均为共显性、反映的是具体片段或序列信息的标记而被国际新品种保护联盟推荐为品种真实性鉴定和数据库构建的优选标记。SSR是一种以特异引物对串联重复区段进行PCR为基础的分子标记技术，具有多态性丰富、分辨率高、位置固定和易于检测等优点，与其他标记和表型性状鉴定具有明显的优势，是表型DUS测试的重要补充。
随着二代测序技术的发展，测序通量呈现指数增长趋势，而测序成本则急剧降低，为全基因组水平SSR标记的开发提供了强有力的技术支持。基于荧光标记毛细管电泳平台，实现了SSR检测技术的高效化和自动化。利用6份高深度重测序数据，筛选出高多态性的SSR标记对桃种质进行鉴定，为保护中国桃地方品种、育成品种及其近缘野生种的知识产权提供理论依据。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一套用于构建桃DNA指纹图谱的SSR引物、应用及构建方法，该SSR引物组合可用于构建出桃DNA指纹图谱。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一套用于构建桃DNA指纹图谱的SSR引物，由10对引物组成：
引物SSR73由如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物组成；
引物SSR93由如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物组成；
引物SSR96由如SEQ ID NO.5所示的上游引物和如SEQ ID NO.6所示的下游引物组成；
引物SSR107由如SEQ ID NO.7所示的上游引物和如SEQ ID NO.8所示的下游引物组成；
引物SSR125由如SEQ ID NO.9所示的上游引物和如SEQ ID NO.10所示的下游引物组成；
引物SSR152由如SEQ ID NO.11所示的上游引物和如SEQ ID NO.12所示的下游引物组成；
引物SSR169由如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.14所示的下游引物组成；
引物SSR179由如SEQ ID NO.15所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物组成；
引物SSR181由如SEQ ID NO.17所示的上游引物和如SEQ ID NO.18所示的下游引物组成；
引物SSR184由如SEQ ID NO.19所示的上游引物和如SEQ ID NO.20所示的下游引物组成。
一种上述SSR引物在构建桃指纹图谱中的应用。
一种上述SSR引物在桃品种鉴定方面的应用。
一种利用上述SSR引物构建桃DNA指纹图谱的方法，包括以下步骤：
(1)DNA提取：采用常规CTAB法提取样品DNA；
(2)PCR扩增：以待测桃的基因组DNA为模板，用SSR引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)3730XL DNA基因分析仪检测；
(4)基因分型：样品的每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。
PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 1μl、dNTP Mix(2.5mM each)0.8μl、上下游引物(5μM each)的混合物0.6μL、20-30ng/μl DNA样品1μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl、超纯水6.5μl。
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；4℃保存备用。
本发明的有益效果：
1、本发明对6份亲缘关系较远的种质“喀什黄肉李光”、“金蜜狭叶桃”、“新疆蟠桃(无花粉)”、“下庙1号”、“撒花红蟠桃”和“五月鲜扁干”进行高深度(～75.14×)重测序(105.85Gb)，在桃全基因组上检测到141895个SSR位点，利用生物信息学手段获得187个在6份种质上分布和多态性SSR位点。
2、本发明针对187个SSR位点上下游序列进行引物设计，获得164对SSR引物对，并以“白凤”、“大久保”、“初香美”、“大红袍”、“京玉”、“上海水蜜”、“天津水蜜”、“豫白”、“白花”、“爱保太”、“春童”、“丰黄”、“NJN76”、“曙光”、“五月火”、“兴津油桃”、“早红2号”、“奉化蟠桃”、“瑞光3号”、“南山甜桃”和“砧1-3蟠桃”等21个代表性品种为试材，用164对初始引物进行PCR扩增，进一步评价引物的多态性，代表性品种包括生产上主要推广的常见品种，遗传背景相似的品种，不同果实类型的品种等。从164对引物中获得10对多态性高、稳定性强、分辨率高、重复性好，非特异扩增片段少的核心引物。
3、利用10对核心引物对200份种质进行扩增，获得它们的分型信息。10对引物能够有效区分200份桃种质，区分率达到100％。这说明通过10对核心引物获得的DNA指纹图谱能够作为桃种质资源鉴定的参考依据，为桃的市场流通、栽培管理等领域得到进一步的推广利用提供支持。同时也为DNA指纹图谱在桃上的进一步应用研究提供了坚实的理论支持。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1 SSR标记位点的获得
本发明以从中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃获得的6份亲缘关系较远的桃种质为样品(“喀什黄肉李光”、“金蜜狭叶桃”、“新疆蟠桃(无花粉)”、“下庙1号”、“撒花红蟠桃”和“五月鲜扁干”)，采用常规CTAB法提取样品DNA，并通过Illumina HiSeq 2000测序仪对6份桃种质进行高深度重测序，得到105.85G数据，平均覆盖桃基因组97.3％，平均测序深度为75.14×左右。根据测序得到的50-150bp的reads，与桃参考基因组第1版(http://www.rosaceae.org/node/355)进行比对，鉴定出141895个SSR标记位点。利用生物信息学手段分析了桃全基因组SSR位点在6份种质上的分布和多态性，获得187个多态性SSR位点。
实施例2引物的筛选
1、DNA提取
采用常规CTAB法提取待测21份桃(“白凤”、“大久保”、“初香美”、“大红袍”、“京玉”、“上海水蜜”、“天津水蜜”、“豫白”、“白花”、“爱保太”、“春童”、“丰黄”、“NJN76”、“曙光”、“五月火”、“兴津油桃”、“早红2号”、“奉化蟠桃”、“瑞光3号”、“南山甜桃”和“砧1-3蟠桃”)样品组织的DNA。用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.8，浓度稀释至20ng/μl。
2、引物设计
利用Primer 5对187个SSR位点上下游序列进行引物设计，获得164对引物(其中23个SSR位点设计不出合适的引物)，引物由北京阅微基因技术有限公司合成。
3、PCR扩增
以提取的待测21份桃样品组织的DNA为模板，利用上述164对引物进行PCR扩增。
反应体系为：10×PCR Buffer 1μl、dNTP Mix(2.5mM each)0.8μl、上下游引物的混合物(5μM each)0.6μL、20-30ng/μl DNA样品1μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl、超纯水6.5μl。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；4℃保存备用。
4、引物初筛
利用3730XL DNA基因分析仪对PCR扩增产物进行检测，具体方法为：
(1)在96孔板中每孔加入去离子甲酰胺8.5μl、ROX-500分子量内标0.5μl、PCR扩增产物1μl；
(2)94℃变性30s，将双链变性成单链；
(3)上机检测：打开3730XL DNA基因分析仪，检查仪器工作状态。将装有样品的深孔板置于样品架基座上，检测PCR扩增产物等位基因数目。
根据3730XL DNA基因分析仪检测结果，从164对引物中筛选出10对在21份代表种质扩增的等位基因数目均大于7的引物作为核心引物(SSR73、SSR93、SSR96、SSR107、SSR125、SSR152、SSR169、SSR179、SSR181、SSR184)，见表1。
表1 10对SSR引物的信息
实施例3桃指纹图谱的构建
1、DNA提取
以中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃获得的200份桃核心种质为样品，采用常规CTAB法提取样品DNA。
2、PCR扩增
用上述的10对核心引物分别对200份桃核心种质的DNA进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 1μl、dNTP Mix(2.5mM each)0.8μl、上下游引物的混合物(5μM each)0.6μL、20-30ng/μl DNA样品1μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl、超纯水6.5μl。
PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；4℃保存备用。
3、3730XL DNA基因分析仪检测
(1)在96孔板中每孔加入去离子甲酰胺8.5μl、ROX-500分子量内标0.5μl、PCR产物1μl；
(2)94℃变性30s，将双链变性成单链；
(3)上机检测：打开3730XL DNA基因分析仪，检查仪器工作状态。将装有样品的深孔板置于样品架基座上，进行检测；
(4)数据分析：将检测得到的原始数据fsa格式文件导入到分析软件GeneMapper中，查看每个SSR位点的分型图谱PDF文件和分型数据excel表。
4、等位变异数据采集
样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示，纯合位点的基因型数据记录为X/X，杂合位点的基因型数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。利用引物对200份种质进行扩增，获得它们的扩增片段大小。对检测的位点逐一进行比较，统计总位点数、差异位点数、无差异位点数、缺失位点数、无法判定位点数等信息。10对核心引物能够有效的区分200份种质，区分率达到100％，见表2。
表2 构建200份桃种质的指纹图谱
实施例4桃自交系后代纯度鉴定
1、试材
以从中国农业科学院郑州果树研究所收集的3个桃品种(样本29、30、31)的自交系后代共计119份材料为样品，提取样品DNA。
2、3个自交系后代纯度鉴定
用实施例3的方法分别对119份桃DNA进行检测，结果见表3。
3、10对引物对纯度鉴定能力
从鉴定结果可以看出，样本29的17个自交后代在10对引物的相同位点的扩增结果一致，样本29的自交系纯度为100％，与预期结果符合；样本30的59个自交后代在10对引物的相同位点的扩增结果一致，样本30的自交系纯度为100％，与预期结果符合；样本31的43个自交系后代在10对引物的相同位点的扩增结果一致，样本31的自交系纯度为100％，与预期结果符合。说明本发明的10对引物能成功的运用到桃种质的纯度鉴定中。
表3 10对核心引物对3个桃自交系后代纯度的鉴定
综上所述，本发明的SSR标记能够用于构建桃DNA指纹图谱，该方法是通过对6份亲缘关系较远的种质为试材进行高深度重测序，对桃全基因组水平上的SSR位点进行检测，鉴定出141895个SSR标记位点。利用生物信息学手段分析了桃全基因组SSR位点在6份种质上的分布和多态性，获得187对多态性SSR位点。对187个位点设计出164对SSR引物，利用21个代表性品种为试材，对初始引物进行PCR扩增，从中获得10对多态性高、稳定性强、分辨率高、重复性好，非特异扩增片段少的核心引物。用10对核心引物对200份种质进行扩增，获得它们的基因型数据。由于原始的SSR数目庞大，且经过代表种质的筛选，从而保证了得到标记的多态性高，有效的提高了SSR的鉴定效率。
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 一套用于构建桃DNA指纹图谱的SSR引物、应用及构建方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttgctgctga aaaataatga aca 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gggtggcctg ttgagaatat aa 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
aactgcctta gcttagactg gct 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
aagacgagaa accaccttga atc 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aacctcaatc attctttaca caagc 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctgcttaagg aggaacctca aat 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tgcagactag ggttttacag acaa 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gatctccaag tcatctccat ctg 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tagcgccatt gttcacacac 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gctgggagag aaagatgact gt 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gttctcgact cccatatcca a 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ctccaaagta cagagcctat cg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
tgcctacgtg gcactatagg t 21
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tccaaccaag catcaccatc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
aacagtggcc ttcccttga 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
caattgtgtt gttgggttat ga 22
<210> 17
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<212> DNA
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tcaatctgat gagatgagcc at 22
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<212> DNA
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gtcaaagatt acaacagcca gc 22
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<212> DNA
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ttgtgaggaa tattatgcct gc 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
gatggtttgg atcattggga 20
Claims (6)
1.一套用于构建桃DNA指纹图谱的SSR引物，其特征在于，由10对引物组成：
引物SSR73由如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物组成；
引物SSR93由如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物组成；
引物SSR96由如SEQ ID NO.5所示的上游引物和如SEQ ID NO.6所示的下游引物组成；
引物SSR107由如SEQ ID NO.7所示的上游引物和如SEQ ID NO.8所示的下游引物组成；
引物SSR125由如SEQ ID NO.9所示的上游引物和如SEQ ID NO.10所示的下游引物组成；
引物SSR152由如SEQ ID NO.11所示的上游引物和如SEQ ID NO.12所示的下游引物组成；
引物SSR169由如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.14所示的下游引物组成；
引物SSR179由如SEQ ID NO.15所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物组成；
引物SSR181由如SEQ ID NO.17所示的上游引物和如SEQ ID NO.18所示的下游引物组成；
引物SSR184由如SEQ ID NO.19所示的上游引物和如SEQ ID NO.20所示的下游引物组成。
2.一种如权利要求1所述的SSR引物在构建桃指纹图谱中的应用。
3.一种如权利要求1所述的SSR引物在桃品种鉴定方面的应用。
4.一种利用权利要求1所述的SSR引物构建桃DNA指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）DNA提取：采用常规CTAB法提取样品DNA；
（2）PCR 扩增：以待测桃的基因组DNA为模板，用SSR引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（3）3730XL DNA基因分析仪检测；
（4）基因分型：样品的每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。
5.根据权利要求4所述的利用SSR引物构建桃DNA指纹图谱的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：10×PCR缓冲液1 µL、dNTP混合物0.8 µL、上下游引物的混合物0.6 µL、20-30 ng/µL DNA样品1 µL、5 U/µL Taq DNA聚合酶0.1 µL、超纯水6.5 µL。
6.根据权利要求4所述的利用SSR引物构建桃DNA指纹图谱的方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；4 ℃保存备用。
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