CN111363844B - 一种荸荠ssr引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种荸荠SSR引物组及其应用，本发明以荸荠为材料，提取荸荠的DNA并进行酶切、测序、分析得到相应的SSR引物，可为荸荠的遗传多样性和遗传关系的应用研究提供更多有效的SSR标记，本发明的SSR引物具有高多态百分数的特点，使用该引物进行验证扩增效果更好；该SSR标记有效性较高，为后期荸荠种质资源的高效利用、品种的遗传改良及分子育种提供了一个有效的工具；使荸荠的种质鉴定更方便、快捷。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种荸荠SSR引物组及其应用。
【背景技术】
荸荠(Eleocharis dulcis(N.L.Burman)Trinius ex Henschel)俗称马蹄，多年生浅水草本植物，分布区域广泛包括东亚、东南亚、美洲、欧洲及大洋洲。中国是荸荠的原产地之一，而广西是我国荸荠生产第一大产地，约占全国的44.98％。荸荠的用处较广，块茎具有较高的营养和药用成分，独特的口感，无脂肪，无胆固醇等特点，是较受欢迎的食物。另外，荸荠的大面积种植还可以用于处理水污染。荸荠的品种多样性较高，野生品种通常只产生很小的的球茎，直径仅有1cm。栽培品种茎秆更健壮，球茎更大，更甜，略带紫色至棕褐色，直径可达4cm，长约2.5cm。荸荠的研究主要集中在栽培技术，组织培养，生理生化特性和加工上，而不是遗传学研究上。目前，NCBI数据库仅仅收录了112条荸荠的核酸序列。缺乏遗传数据限制了荸荠的遗传育种及其功能性功能基因的研究和利用。
本研究旨在通过RAD测序办法，检测和分析荸荠基因组中的SSR序列并筛选有效的引物，用于开发荸荠的基因组SSR，研究结果将为利用SSR标记评估荸荠的遗传多样性和系统发育提供资源和理论基础。目前，申请人研究发现，根据SSR技术设计出来的引物，多数都不能很好的对荸荠(Eleocharis dulcis(N.L.Burman)Trinius ex Henschel)进行种质资源的分型，因此加强在基因水平上对荸荠种质进行区分尤为重要。对荸荠的SSR引物的开发能为后续开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的引物。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种荸荠SSR引物组及其应用，该引物组具有扩增多态性好，能快速区分荸荠的种植种和野生品种。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种荸荠SSR分子标记引物组，所述SSR引物组的序列如SEQ ID NO.1～108所示。
进一步的，所述SSR引物组能区分荸荠的野生型和种植型。
进一步的，所述种植型为桂林马蹄。
本发明还包括一种所述荸荠SSR分子标记引物组的构建方法，所述方法包括提取荸荠的DNA、对DNA进行测序、对测序完成的DNA序列进行分析、选取适合引物设计的位点设计引物序列并合成相应引物、用引物对不同种质资源的荸荠样品进行扩增，选取具有特异性的引物构建引物组。
进一步的，所述对测序完成的DNA序列进行分析的方法为：检测DNA序列中的简单重复序列，搜索分析的单，二，三，四，五和六核苷酸基序的重复基序，过滤去除距离过近的重复序列，最终确认SSR的标准如下：重复单元的最小长度为2，SSR重复单元的最大长度为6，SSR序列的最小长度为12，SSR上下游序列长度为100bp，两个SSR的最小距离为12bp，确认好重复序列于基因组的位置后，进行序列的引物设计。
本发明还包括一种应用所述荸荠SSR分子标记引物组对荸荠野生型和种植型进行区分的方法，所述方法为：对样品采样、提取基因组DNA、采用所述引物进行琼脂糖凝胶电泳的PCR扩增，当对应的扩增引物、琼脂糖凝胶电泳条带与荸荠的野生型或种植型一致时，认定该样品为野生型或种植型；所述PCR扩增的反应体系为：2X的TSINGKE Master Mix 10μl，10μM的SSR上游引物0.5μl上游引物，10μM的SSR下游引物0.5μl上游引物，10ng/μl的DNA模板1μl，8μl的ddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
进一步的，该引物用于检测不同荸荠品种遗传多样性。
进一步的，该引物用于对不同荸荠品种进行聚类分析。
本发明具有如下有益效果：
本发明以荸荠为材料，提取荸荠的DNA并进行酶切、测序、分析得到相应的SSR引物，可为荸荠的遗传多样性和遗传关系的应用研究提供更多有效的SSR标记，本发明的SSR引物具有高多态百分数的特点，使用该引物进行验证扩增效果更好；该SSR标记有效性较高，为后期荸荠种质资源的高效利用、品种的遗传改良及分子育种提供了一个有效的工具；使荸荠的种质鉴定更方便、快捷。
【附图说明】
图1是本发明实施例中荸荠的SSR重复数量统计图；
图2是本发明引物P2-P20在2个样品中的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是本发明引物P21-P38在2个样品中的琼脂糖凝胶电泳图；
图4是本发明引物P41-P61在2个样品中的琼脂糖凝胶电泳图；
图5是本发明引物P65-P78在2个样品中的琼脂糖凝胶电泳图；
图6是本发明引物P83-P99在2个样品中的琼脂糖凝胶电泳图；上图2-6中Maker均为DL500，从上至下条带大小依次为：500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、50bp。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
一、实验方法：
(一)样品来源：
荸荠品种描述：桂林马蹄，农业部地理标志农产品，以个大皮薄，颜色暗红，肉质细嫩，晶莹无渣而著名。其生长期为120-150d，耐运输，抗病性较强，株高84cm，球茎横茎3.4cm左右，纵茎2.4cm左右，脐部稍凹，茎芽小，皮红褐色。品质细嫩多汁，干物质含量29％，每100g鲜重含维生素C 5.66mg，可溶性糖5.79％，淀粉9.28％，蛋白质2.5％。
样本——荸荠叶片。
(二)SSR引物构建方法：
1、荸荠基因组DNA的提取方法：
荸荠叶片使用液氮进行研磨，使用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒(博日科技，#BSC13S1)提取基因组DNA。所得的DNA使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测浓度及完整度，并使用NanoDrop检测每个DNA的纯度，使用Qubit检测DNA的准确浓度。
对DNA进行测序、对测序完成的DNA序列进行分析：
使用SSR search软件分析RAD测序组装后的DNA序列(测序后的数据质量见表1)，对RAD组装的contig进行SSR分析，搜索分析单，二，三，四，五和六核苷酸基序的重复基序，对有效的contig进行SSR分析得到SSR片段，其中4127个片段可以用于设计引物。不同SSR基序类型分布如和表2所示；在这些SSR中，AT是数量最多的，有269条，占总数的6.52％，平均长度分别为17.37bp。三碱基的重复中，数量最多的是TAT/ATA，总数为170条，占比4.12％，平均长度为14.24bp(具体如表3)：
表1测序数据质量表
上表中，各项目的注释为：Raw Base(bp)：原始数据产量，以bp为单位。Clean Base(bp)：过滤之后的有效数据量，以bp为单位。Effective Rate(％)：过滤后获得clean data与raw data的比值。Q20、Q30：Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比。GCContent(％)：碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比。Clean reads：clean datareads数目。Removed duplication reads：去重之后reads数目。Clean duplication rate(％)：clean reads的重复率。Digestion reads：酶捕获的reads数目。Digestion ratio(％)：酶捕获的reads数目与去重之后reads数目的比值。Cluster Tag number：数据聚类后的类数。Cut Tag number：统计类中的reads支持数在10-400之间的类数目。Cut pairreads：对reads支持深度进行过滤之后所剩下的pair reads数。Total contig base(bp)：组装结果总长度。Total contig number：组装结果总个数。Average contig length(bp)：组装contig的平均长度。N50 length(bp)：序列从大到小排列，当长度达到组装总长度一半时，contig的长度。
从表1可知，本研究所进行的RAD测序总共得到39.38G的Raw Base(bp)，经过数据有效性过滤之后，所得的Clean Base(bp)数据量为39.29G，数据有效率为99.78％，Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比分别为96.75％和91.43％，GC含量(GC Content)为33.87％。得到的Clean Reads数量为130,963,222条，去重后的reads数为77,437,310条，Clean reads的重复率为40.87％，具有EcoRⅠ酶切位点的reads数为75,883,448条。对含EcoRⅠ酶切位点的reads用Cd-hit进行聚类，把相似的RAD-tag相近的reads聚集到一起作为一个聚类(Cluster)，总共得到24,848,206个聚类数(Cluster tag number)。把聚集在一起的reads数少于10个的类进行过滤，得到了450,203个聚类，这些聚类中包含的可用reads数为43,491,152条。对筛选后的每一类进行局部组装，去除小于100bp的contig，总共得到393324个contig，每个contig的平均长度为263bp。
表2RAD测序分析所得的SSR序列的统计表
从表2可知，可以设计引物的SSR中，所得的SSR核心序列(Motif)的长度从二碱基到六碱基，其中丰度最高的是三碱基重复，比率为45.89％，数量为1894条，平均的SSR长度为13.92个碱基；丰度第二高的为二碱基重复，比率为34.07％，数量为1406条，平均长度为16.33个碱基。上述重复次数如图1所示，4次重复占比45.67％，5次重复占比11.90％，6次重复占比17.93％，7次重复占比7.78％，8次重复占比5.28％，9次重复占比3.13％，10次重复占比2.11％，大于10次的重复占比6.2％。
表3数量最多的前20种SSR重复
从表3可知，本申请SSR核心序列占比最多的是AT/AT和TA/TA序列，其数量均为269，平均长度分别为17.37和16.52，占比均达到6.52％。
2、用引物对不同种质资源的荸荠样品进行扩增：
提取不同样品的荸荠DNA，提取方法参考步骤1；
采用如下反应体系和反应程序对不同样品的荸荠DNA进行扩增：
PCR扩增的反应体系为：2X的TSINGKE Master Mix 10μl，10μM的SSR上游引物0.5μl上游引物，10μM的SSR下游引物0.5μl上游引物，10ng/μl的DNA模板1μl，8μl的ddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
根据电泳结果选取具有特异性的引物构建引物组(筛选出的引物见表4)。
表4引物信息表
实施例2：
应用实施例1构建的引物组对不同荸荠品种进行多样性分析：
样本来源：野生型(YSMT)对野生型荸荠进行采样，2019年5月采集于广西农业科学院水生蔬菜种质资源圃(种质资源采集于广东省韶关乐昌市北乡镇)野生荸荠株高60-70cm，叶状茎细，直径0.1-0.3cm，球茎个头小，直径1-2cm，单个球茎重8-15g。
种植型(GLMT)对桂林马蹄进行采样，2019年5月采集于广西农业科学院水生蔬菜种质资源圃(种质资源采集于桂林市荔浦市青山镇)，栽培种桂林马蹄株高70-84cm，叶状茎粗壮，直径0.4-0.6cm，球茎个头大，直径4-4.5cm，单个球茎重25-30g，以个大皮薄，颜色暗红，晶莹无渣而著名。其生长期为120-150d，耐运输，抗病性较强，脐部稍凹，茎芽小，皮红褐色。
采样后提取上述样品的基因组DNA，利用如表4所示引物进行琼脂糖电泳扩增，扩增结果参见图2-6，可见上述引物对野生型马蹄和种植型马蹄具有良好的多态性，能对野生型马蹄和种植型马蹄进行区分；根据图2-6的有带无带情况建立0，1数据矩阵；对总位点和多态位点进行统计，并计算多态百分数，结果见表5；利用POPGENE 32软件分析了该两个品种的遗传相似系数与遗传距离矩阵表。结果显示两样品遗传相似系数在0.4190，遗传距离范围为0.8699(结果参见表6)。
表5引物的多态性分析
从表5可见，本申请的引物具有丰度高、条带丰富、多态性好的特点。
表6Nei’s无偏遗传相似系数(对角线上)和遗传距离(对角线下)
| Pop.ID | 桂林马蹄(GLMT) | 野生型(YSMT) |
| 桂林马蹄(GLMT) | **** | 0.4190 |
| 野生型(YSMT) | 0.8699 | **** |
从表6可见，两个样品的遗传相似系数在0.4190，遗传距离范围为0.8699；说明这两个样品的亲缘关系较远，可明显被上述引物区分。
实施例3：
使用上述SSR引物对野生型(YSMT)和种植型(GLMT)进行区分，以引物P5、P25、P28、P31、P71、P84、P90和P96为例：
引物P5的判定：提取样本的DNA，采用P5引物进行琼脂糖凝胶电泳的PCR扩增；
PCR扩增的反应体系为：2X的TSINGKE Master Mix 10μl，10μM的SSR上游引物0.5μl上游引物，10μM的SSR下游引物0.5μl上游引物，10ng/μl的DNA模板1μl，8μl的ddH2O；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，共35个循环；最终72℃延伸5min。
如图2所示，当样本在400bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本无扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
引物P25的判定(PCR反应体系、程序与P5一致)：
如图3所示，当样本在130bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本在140bp有扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
引物P28的判定(PCR反应体系、程序与P5一致)：
如图3所示，当样本在210bp、200bp、155bp、130bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本在160bp、150bp、120bp有扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
引物P31的判定(PCR反应体系、程序与P5一致)：
如图3所示，当样本在290bp、280bp、140bp、120bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本在410bp、170bp有扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
引物P71的判定(PCR反应体系、程序与P5一致)：
如图5所示，当样本在390bp、380bp、370bp、150bp、100bp、80bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本在140bp、70bp有扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
引物P84的判定(PCR反应体系、程序与P5一致)：
如图6所示，当样本在230bp、220bp、190bp、120bp、105bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本在225bp、215bp、110bp有扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
引物P90的判定(PCR反应体系、程序与P5一致)：
如图6所示，当样本在120bp、90bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本在110bp有扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
引物P96的判定(PCR反应体系、程序与P5一致)：
如图6所示，当样本在120bp、110bp有扩增条带时，证明该样本为种植型(GLMT)荸荠；当样本在无扩增条带时，证明该样本为野生型(YSMT)荸荠。
综上所述，使用本申请得到的SSR引物具有良好的多态性，能对野生型荸荠(YSMT)和种植型荸荠(GLMT)进行区分；能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新引物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 一种荸荠SSR引物组及其应用
<160> 108
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 25
aaggaaagtt tctggagttt gct 23
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tgctcttgtt gttgttgttc ttc 23
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actctatgag cagtggagca gtc 23
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<400> 28
tgacgacaaa taacaaattg tgc 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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tttttgctct ggacttgact ctg 23
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aataatccac tttgcaccag cta 23
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<400> 32
attagttccc cacacaaagt tca 23
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<212> DNA
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<400> 33
atgatcaaag taaagtcgag ggc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttttatattt ctgcgtttga gcg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtagtgcagt gttgctttct ctg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agagatctga tcaacgtcac cat 23
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<211> 23
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caagaggaat accaagacca aga 23
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgctcctgc tcctactctt tat 23
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<400> 39
gtggactcgt aacccatgag ac 22
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<211> 23
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aaggcactag gtaggggtgt tac 23
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<212> DNA
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atgtcaaact ttagaggtgg caa 23
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<212> DNA
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gattcgggtt agtttgactt cct 23
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agacacggtg atcaggaagc 20
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<212> DNA
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cacgtgaaag agaggagaag aga 23
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<212> DNA
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gctctctcta gcgaataacc aca 23
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atatacccaa aaagcaaggg gta 23
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taacggctca tactttcgaa ctc 23
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cactttctct ctctaaatgg ggc 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctctccttc tctttccttc tcc 23
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cgtcttcttg ttcttcgtgc tat 23
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gaaacaagga agtacgaaaa tcaa 24
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attatggtat cctttctatc acttgc 26
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tcaattaaag tgaggttgca gataa 25
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gcagtcaaga gaagagaatg gaa 23
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gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtt 23
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ttcatacgaa tacaaggagc gat 23
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gccatttctg atctgattct tca 23
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gtgttggagc aaggaggaaa t 21
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aacagtggag ctaccagata tgc 23
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ttttcgttca ccaacttttg ttt 23
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ctaattgcag ccgatagtgg tat 23
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ccgatcaact ctacaatcca ttt 23
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tgcatgttga tttaatgtct caaa 24
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<212> DNA
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gatacgtgag aagaacccct agc 23
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aataatttgc gaagtaacct cacc 24
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<212> DNA
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gataagaaga gtgcgatgtt tgg 23
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acttcaccac cgacactgat act 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcttccaaaa atatctcatc cca 23
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atatagagaa gggggtctgt gga 23
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caaagcaaga agaagaagaa gca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
acctgggtac cgttgtctaa ttt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tgcttccatc aagttccagt att 23
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 82
cctccttaac agacctctca tca 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ttcatcgcta ttctaccgaa tgt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tgcactgcat aacttgagaa ttg 23
<210> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
cagctgcaga ggtgtcagag 20
<210> 86
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tcagatcaga tccacattct aattct 26
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
cagattgcaa attgttaatt gga 23
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cagatactca gatcagatca ttgtga 26
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
cttccaaaac accaaacaaa cat 23
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
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<400> 90
ggcctggtgg attttattca t 21
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
cttcctccat ctgtctctct tga 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ttttacagtc ttgcctgttg tga 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
caagtcgtgg tacttttgaa ctg 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
aggtgatatg atctgccatg taa 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
tggaacaata atttggtctc acc 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tccttgtgca cctgttagta tga 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
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<400> 97
taatactttt gctttccatg cgt 23
<210> 98
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atggttattg catttggtat tgc 23
<210> 99
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggggattg gtctacactc ttt 23
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ttcaggaaaa gtaaattgcg ttc 23
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ccacttcttg gcaattacat cat 23
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<212> DNA
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tttaaaagga aaacacgcga tta 23
<210> 104
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<212> DNA
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<400> 104
tccaaaataa ggttgtttac cca 23
<210> 105
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<212> DNA
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aatcgttgga ctggagagta tca 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
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<400> 106
ctccaacctc tagcaaacaa atg 23
<210> 107
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
taattggaag ggaagttgga agt 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
aattttgaaa acgttcgttt gag 23
Claims (3)
1.一种荸荠SSR分子标记引物组，其特征在于，所述SSR引物组的序列如SEQ ID NO.1～108所示。
2.如权利要求1所述荸荠SSR分子标记引物组的应用，其特征在于，该引物组用于检测不同荸荠品种遗传多样性，所述荸荠品种为广东省韶关乐昌市北乡镇的野生型和广西壮族自治区桂林市荔浦市青山镇的桂林马蹄。
3.如权利要求1所述荸荠SSR分子标记引物组的应用，其特征在于，该引物组用于对不同荸荠品种进行聚类分析，所述荸荠品种为广东省韶关乐昌市北乡镇的野生型和广西壮族自治区桂林市荔浦市青山镇的桂林马蹄。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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