CN115786575B - 一种基于毛细管电泳鉴定板栗等栗属植物品种的ssr引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于毛细管电泳鉴定区分板栗及其他栗属植物品种的SSR引物组合，属于分子生物学技术领域。所述的SSR引物组合由6对引物组成，其不仅在板栗中，而且在欧洲栗、日本栗等其他栗属植物中均可有效扩增，扩增重复性好，区分度高，适用于荧光毛细管电泳检测，具有分辨率高、结果可靠、方便快捷等优点。本发明的SSR引物组合可应用于板栗及其他栗属植物的品种鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析、分子身份证构建等方面研究，不仅有利于改善板栗品种混杂、同名异物和同物异名等现象，为板栗及其他栗属植物品种的鉴定和优品选育提供参考依据，而且有利于维护消费者、生产者和育种者的合法权益，促进板栗、欧洲栗、日本栗等品种市场的良好发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种SSR分子标记引物组合用于板栗等栗属植物品种鉴定的方法及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
在板栗生产上品种混杂、同物异名和同名异物等问题普遍存在，导致因假冒品种造成生产者和消费者等经济损失的现象时有发生，阻碍优良品种的选育和推广。基于此，一种快速、高效、准确的品种鉴定方法迫切需要建立。现今分子生物学发展快速，已有多种分子标记技术，例如：RAPD、AFLP、ISSR、SSR和SNP等，先后被应用于植物品种鉴定等研究。其中，SSR分子标记技术是由1～6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，具有多态性高、共显性遗传、结果准确且稳定等突出优势，广泛应用于植物遗传多样性分析、品种鉴定和分子身份证构建等研究。
分子身份证是一种识别种质资源便捷且有效的方法，在多种植物的品种识别和鉴定中已有十分广泛的应用。通过二维码生成器生成专属的二维码分子身份证，将DNA分子数据实现数字化、信息化，使用扫码器扫描二维码可以立即得到品种信息，十分方便快捷。因此，分子身份证是一种进行品种鉴定的有效措施，构建板栗及其他栗属植物品种分子身份证将有助于解决品种混杂，伪劣品种假冒以次充好等问题，有利于维护市场的良好秩序，维护生产者、经营者和消费者等的合法权益。
发明内容
针对同物异名、同名异物、品种混杂、以次充好等问题，本发明的目的在于提供一种用于板栗等栗属植物品种鉴定的SSR分子标记引物组合及其应用。所述SSR引物组合扩增重复性好、稳定，具有丰富的多态性，能够高效应用于栗属植物遗传多样性及亲缘关系分析、品种鉴定、分子身份证构建等方面研究。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案内容如下：
本发明提供了一种基于毛细管电泳鉴定板栗及其他栗属植物品种的SSR分子标记引物组合，其特征在于，所述的SSR分子标记引物组合包括序列如下所示的6对引物：P4正向引物和P4反向引物，P82正向引物和P82反向引物，P106正向引物和P106反向引物，P108正向引物和P108反向引物，P127正向引物和P127反向引物，P138正向引物和P138反向引物，所述6对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-12所示。
所述鉴定板栗及其他栗属植物品种的SSR引物组合应用于栗属植物遗传多样性及亲缘关系分析、品种鉴定和分子身份证构建等研究。
本发明提供了一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①提取供试板栗及其他栗属植物品种的基因组DNA。
②将权利要求1所述的SSR引物组合中的每对引物对的正向引物进行荧光修饰。
③以步骤①提取的DNA为模板，利用步骤②中加荧光修饰的正向引物与相应的未加荧光修饰的反向引物进行PCR扩增。
④将步骤③中所获得的PCR产物经分组混合后进行毛细管电泳混检。
⑤对步骤④的毛细管电泳结果进行分析，实现对板栗及其他栗属植物品种的鉴定。
其中，步骤①基因组DNA提取的方法采用改良CTAB法：板栗中含有较高的酚类物质，在2％CTAB提取液中加入2％螯合剂PVP40和2％抗氧化剂β-巯基乙醇(现用现加)，可以排除酚类物质及色素的干扰，增加DNA的溶解性。提取的基因组DNA，用Nano-100仪器检测DNA的质量和浓度，将合格的DNA于-20℃冰箱保存、备用。
其中，步骤②中将权利要求1所述的SSR引物组合中的每对引物对P4、P82、P106、P108、P127、P138的正向引物5′端分别进行TET、TAMRA、Fam、Hex、ROX、Fam荧光修饰。
其中，步骤③的PCR扩增反应体系采用15μL：7.5μL 2x TSINGKE Master Mix(擎科生物公司)，1μL 50ng/μL DNA模板，0.3μL 10μM/μL的荧光修饰正向引物，0.3μL 10μM/μL的反向引物，5.9μL ddH2O补足15μL体系。PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸45s、共35个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存。
其中，步骤④采取将3对引物的PCR产物混合检测的方式进行毛细管电泳，将6对引物分为组合1(P4、P82、P106)和组合2(P108、P127、P138)两组，在保证检测效果的前提下将每组中的3对引物的PCR产物先分别进行预检以推知每对引物的PCR产物浓度，后稀释至1ng/μL的浓度进行混合用于毛细管电泳检测，有效的降低了毛细管电泳的成本。取3对PCR产物的混匀液0.7-1.0μL、10μL预混液Mix(GS-500LIZ分子量内标与HiDi缓冲液按1:130的混匀液)混合加入96孔PCR板中，金属浴加热95℃预变性5min，-20℃冷却后4000rpm离心，使用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳。
其中，步骤⑤中使用Gene mapper 4.1软件进行数据整理和图像分析，将毛细管电泳检测结果进行取整后，运用DataFormater软件转换数据格式，用NTSYS Version 2.10软件进行聚类分析，可以将板栗及其他栗属植物品种完全区分开。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
1.本发明筛选出的6对SSR引物不仅在板栗，而且在欧洲栗、日本栗等其他栗属植物中均可有效扩增，扩增重复性好且稳定，区分度高，差异大，目的条带易于检测及判读，适用于荧光毛细管电泳检测。
2.本发明的SSR分子标记引物组合应用于板栗及其他栗属植物的品种鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析、分子身份证构建等方面研究，不仅有利于改善板栗品种混杂、同名异物和同物异名等现象，为板栗及其他栗属植物品种的鉴定和优品选育提供参考依据，而且有利于维护消费者、生产者和育种者的合法权益，促进板栗、欧洲栗、日本栗等品种市场的良性发展。
3.本发明提供的SSR引物组合的应用，具有简便快捷、结果稳定、准确度高、不易受环境和生长周期影响等优势，能够在板栗及其他栗属植物生长的任意时期进行高效的遗传多样性分析、品种鉴定和分子身份证构建等研究。
4.本发明采用PCR产物混合检测的方式进行毛细管电泳，大大降低了毛细管电泳的成本，达到了快捷经济的目的。
附图说明
图1为6对板栗SSR引物对118份栗属植物品种的聚类分析图。
图2为板栗品种‘九家种’的二维码分子身份证。
图3为板栗品种‘九家种’二维码分子身份证的扫码内容示例图。
具体实施方式
以下实施例用于解释说明本发明，但并不限制本发明。
实施例1一种SSR分子标记引物组合用于板栗等栗属植物品种鉴定的方法
①提取供试板栗及其他栗属植物品种的基因组DNA
a)118份品种材料
表1 118份品种材料
b)采用改良CTAB法提取基因组DNA，具体操作步骤如下：
(1)取板栗幼嫩叶片适量(0.2～0.4g)于2ml离心管中，加入5颗钢珠，液氮中放置3min后(65Hz，60s)研磨成粉末，加入800ul CTAB裂解液，每管再加入16ul(2％)的巯基乙醇，用匀浆器或者手动混合均匀。
(2)65℃水浴30min,每隔5-8min颠倒混匀一次。
(3)加入等体积的800ul氯仿:异戊醇(24:1)，旋涡或者颠倒混匀，放置2-3min，12000rpm，室温离心10min。
(4)取上清(600-800μL)转移至一新的2ml离心管(吸取过程中不可接触蛋白层，以免污染DNA)。加入等体积的(600-800μL)氯仿:异戊醇(24:1)重复抽提一次。
(5)取上清(400-600μL)移至一新1.5ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃沉淀10min。15000rpm，4℃离心15min。
(6)弃上清，加入500μL的70％乙醇洗涤沉淀2次。
(7)室温放置干燥或真空抽干DNA沉淀，约5-10分钟。加入100μL ddH2O，充分溶解沉淀。
(8)提取的板栗基因组DNA，用Nano-100仪器检测DNA的质量和浓度，将合格的DNA于-20℃冰箱保存、备用。
②权利要求1所述的SSR引物组合的获得与荧光修饰
申请人利用已公开发表的板栗全基因组序列信息进行SSR位点搜索并设计合成了153对板栗基因组SSR引物，从118份品种材料中随机挑选55份不同的板栗品种经聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选得到多对多态性好的SSR引物分子标记，从中选出P4、P82、P106、P108、P127、P138这6对引物组成SSR核心引物组合。
将SSR核心引物组合中的每对引物对P4、P82、P106、P108、P127、P138的正向引物5′端分别进行TET、TAMRA、Fam、Hex、ROX、Fam荧光修饰，OD值为2，纯化方式为HPLC，由擎科生物科技有限公司合成。
③PCR扩增反应
PCR扩增反应体系采用15μL：7.5μL 2x TSINGKE Master Mix(擎科生物公司)，1μL50ng/μL DNA模板，0.3μL 10μM/μL的荧光修饰正向引物，0.3μL 10μM/μL的反向引物，5.9μLddH2O补足15μL体系。PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存。
④毛细管电泳检测
采取将3对引物的PCR产物混合检测的方式进行毛细管电泳，将6对引物分为组合1(P4、P82、P106)和组合2(P108、P127、P138)两组，在保证检测效果的前提下将每组中的3对引物的PCR产物先分别进行预检以推知每对引物的PCR产物浓度，后稀释至1ng/μL的浓度进行混合用于毛细管电泳检测，有效的降低了毛细管电泳的成本。取3对PCR产物的混匀液0.7-1.0μL、10μL预混液Mix(GS-500LIZ分子量内标与HiDi缓冲液按1:130的混匀液)混合加入96孔PCR板中，金属浴加热95℃预变性5min，-20℃冷却后4000rpm离心，使用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳。
⑤结果分析
使用Gene mapper 4.1软件进行数据整理和图像分析，将毛细管电泳检测结果进行取整后，获得118份品种材料基于6对SSR引物扩增的目的条带的准确大小，即“bp值型”格式数据。运用DataFormater软件将“bp值型”格式数据转换成适用于NTSYS Version 2.10软件的“01带型”格式数据，用NTSYS Version2.10软件依据UPGMA方法进行聚类分析，获得UPGMA树状图(图1)。由图1可知，118份品种的遗传相似系数在0.75～0.98之间，可以将板栗及其他栗属植物品种完全区分开，实现了鉴别板栗及其他栗属植物品种的目的。
实施例2SSR引物组合应用于栗属植物分子身份证构建——以板栗品种‘九家种’为例
①提取板栗品种‘九家种’的基因组DNA
方法与实施例1中的相同。
②SSR引物组合的荧光修饰
将权利要求1所述的SSR引物组合中的每对引物对P4、P82、P106、P108、P127、P138的正向引物5′端分别进行TET、TAMRA、Fam、Hex、ROX、Fam荧光修饰，OD值为2，纯化方式为HPLC，由擎科生物科技有限公司合成。
③PCR扩增反应
PCR扩增反应体系采用15μL：7.5μL 2x TSINGKE Master Mix(擎科生物公司)，1μL50ng/μL DNA模板，0.3μL 10μM/μL的荧光修饰正向引物，0.3μL 10μM/μL的反向引物，5.9μLddH2O补足15μL体系。PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存。
④毛细管电泳检测
采取将3对引物的PCR产物混合检测的方式进行毛细管电泳，将6对引物分为组合1(P4、P82、P106)和组合2(P108、P127、P138)两组，在保证检测效果的前提下将每组中的3对引物的PCR产物先分别进行预检以推知每对引物的PCR产物浓度，后稀释至1ng/μL的浓度进行混合用于毛细管电泳检测，有效的降低了毛细管电泳的成本。取3对PCR产物的混匀液0.7-1.0μL、10μL预混液Mix(GS-500LIZ分子量内标与HiDi缓冲液按1:130的混匀液)混合加入96孔PCR板中，金属浴加热95℃预变性5min，-20℃冷却后4000rpm离心，使用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳。
⑤二维码分子身份证构建
使用Gene mapper 4.1软件进行数据整理和图像分析，将毛细管电泳检测结果进行取整后，获得板栗品种‘九家种’6对引物扩增的目的片段大小(P4：166bp,169bp；P82：164bp,181bp；P106：177bp,177bp；P108：198bp,198bp；P127：185bp,185bp；P138：249bp,249bp)。将6对引物P4、P82、P106、P108、P127、P138依次进行A、B、C、D、E、F编号，按照由A到F的顺序即可生成板栗品种‘九家种’的DNA指纹图谱(A，166,169/B，164,181/C，177,177/D，198,198/E，185,185/F，249,249)。将板栗品种‘九家种’的DNA指纹图谱与品种信息相结合，通过在线二维码生成器即可生成专属板栗品种‘九家种’的二维码分子身份证(图2)，通过扫描二维码即可立即获取板栗品种‘九家种’的相关信息(图3)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不用于限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理的前提下所作的改变、修饰、替换、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包括在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于毛细管电泳鉴定板栗及其他栗属植物品种的SSR分子标记引物组合，其特征在于，所述的SSR分子标记引物组合包括如下所示的6对引物：P4正向引物和P4反向引物，P82正向引物和P82反向引物，P106正向引物和P106反向引物，P108正向引物和P108反向引物，P127正向引物和P127反向引物，P138正向引物和P138反向引物，所述6对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-12所示。
2.一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：①提取供试板栗及其他栗属植物品种的基因组DNA；②将权利要求1所述的SSR引物组合中的每对引物对的正向引物进行荧光修饰；③以步骤①提取的DNA为模板，利用步骤②中加荧光修饰的正向引物与相应的未加荧光修饰的反向引物进行PCR扩增；④将步骤③中所获得的PCR产物经分组混合后进行毛细管电泳混检；⑤对步骤④的毛细管电泳结果进行分析，实现对板栗及其他栗属植物品种的鉴定。
3.如权利要求2所述的一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，步骤①基因组DNA提取的方法采用改良CTAB法：板栗中含有较高的酚类物质，在2％CTAB提取液中加入2％螯合剂PVP40和2％抗氧化剂β-巯基乙醇，现用现加，可以排除酚类物质及色素的干扰，增加DNA的溶解性，提取的基因组DNA，用Nano-100仪器检测DNA的质量和浓度，将合格的DNA于-20℃冰箱保存、备用。
4.如权利要求2所述的一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，步骤②中将权利要求1所述的SSR引物组合中的每对引物对P4、P82、P106、P108、P127、P138的正向引物5′端分别进行TET、TAMRA、Fam、Hex、ROX、Fam荧光修饰。
5.如权利要求2所述的一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，步骤③的PCR扩增反应体系采用15μL：7.5μL 2x TSINGKE Master Mix，1μL50ng/μLDNA模板，0.3μL 10μM/μL的荧光修饰正向引物，0.3μL 10μM/μL的反向引物，5.9μLddH2O补足15μL体系；PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸45s、共35个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存。
6.如权利要求2所述的一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，步骤④采取将3对引物的PCR产物混合检测的方式进行毛细管电泳，将6对引物分为组合1：P4、P82、P106和组合2：P108、P127、P138两组，在保证检测效果的前提下将每组中的3对引物的PCR产物先分别进行预检以推知每对引物的PCR产物浓度，后稀释至1ng/μL的浓度进行混合用于毛细管电泳检测，有效的降低了毛细管电泳的成本；取3对PCR产物的混匀液0.7-1.0μL、10μL预混液Mix：GS-500LIZ分子量内标与HiDi缓冲液按1:130的混匀液，混合加入96孔PCR板中，金属浴加热95℃预变性5min，-20℃冷却后4000rpm离心，使用3730xlDNA测序仪进行毛细管电泳。
7.如权利要求2所述的一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，步骤⑤中使用Gene mapper 4.1软件进行数据整理和图像分析，将毛细管电泳检测结果进行取整后，运用DataFormater软件转换数据格式，用NTSYS Version 2.10软件进行聚类分析，可以将板栗及其他栗属植物品种完全区分开。
8.如权利要求2所述的一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，利用权利要求1所述SSR引物组合可应用于板栗及其他栗属植物的遗传多样性及亲缘关系分析。
9.如权利要求2所述的一种SSR引物组合用于鉴定板栗及其他栗属植物品种的方法，其特征在于，利用权利要求1所述SSR引物组合可应用于板栗及其他栗属植物的品种鉴定及分子身份证构建。
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