CN111560442B - 一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用 - Google Patents

一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用，试剂盒包括扩增20个黄牛STR位点和1个Amel性别位点的21对特异性引物，特异性引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示，可同时扩增20个黄牛STR位点和1个Amel性别位点。本发明提供的黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用，试剂盒同时包括常染色体STR、Y染色体STR与Amel性别位点，为同类型产品中检测位点最多的试剂盒，可在单管中同时扩增、检测20个黄牛STR位点及1个黄牛性别位点，具有特异性强、分辨率高、分型准确、灵敏度高等特点，可完全满足黄牛亲权鉴定、个体识别、性别辨别等多方面需求。

Description

一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用
技术领域
本发明属于法医遗传学技术领域，具体涉及一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用。
背景技术
在我国，牛主要分为黄牛、水牛和牦牛3大类。其中，水牛属于偶蹄目、牛科、水牛属，牦牛属于偶蹄目、牛科、牛属、牦牛亚属，而在我国,黄牛是指牦牛和水牛以外的所有家牛,属于偶蹄目、牛科、牛属中的牛种。故而，水牛与黄牛及牦牛分属2个不同的属，而黄牛与牦牛分属于不同亚属。中国黄牛有28个地方品种,另外,还存在其他一些地方类群或品种,是世界上牛品种最多的国家。
短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat，STR)作为继限制性片段长度多态性之后的第二代遗传标记，自二十世纪八九十年代以来，被广泛应用于法医物证学方面相关的研究及鉴定，是目前应用最广泛的遗传标记之一。STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，且多个STR基因座可以同时进行复合扩增，具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点，被广泛应用于法医物证中的个体识别和亲子鉴定。经研究报道发现，该项技术也可用于黄牛亲权鉴定与个体识别。
目前市场上针对牛STR的商品化试剂盒仅有AB的Thermo Scientifc BovineGenotypes Panel 3.1，其为四色试剂盒，包括18个STR位点(TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA23、ETH3、ETH225、BM1824、BM1818、SPS113、RM067、CSRM60、MGTG4B、CSSM66、ILSTS006)。根据其用户手册，这些基因座选自FAO-ISAG所推荐的牛微卫星位点，所适用的也是黄牛品种。但由于这些基因座只位于常染色体且数目不多，不排除可能遇到等位基因型相同的两个个体，且无法辨别牛的性别。本发明包含有20个STR位点与1个性别Amel位点，可更高效地解决黄牛亲权鉴定和个体识别的问题，不仅弥补国内该类产品的空白，而且能够提高该类案件的解决速率。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用。
为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：
一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒，共包括21对特异性引物，用于同时扩增20个黄牛STR位点和1个黄牛性别位点，所述特异性引物的序列如序列表中SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:42所示；
所述20个黄牛STR位点(或基因座)包括UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60、BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833、TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113；1个黄牛性别位点(或基因座)为Amelogenin，缩写为Amel。
进一步的，BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60、BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、Amel、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833、TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113为常染色体STR基因座，UMN0108、UMN0929为Y染色体STR基因座，Amelogenin为性别判别位点。
进一步的，所述黄牛STR位点和黄牛性别位点与对应的特异性引物分别为：
UMN0108，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；
BM2113，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示；
FJ232028，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示；
SPS115，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8所示；
CSRM60，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示；
BM067，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12所示；
TGLA122，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示；
INRA023，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示；
BM1818，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18所示；
ILSTS006，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示；
UMN0929，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:21～22所示；
Amelogenin，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:24所示；
ETH225，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:25～26所示；
BM1824，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28所示；
TGLA126，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:29～30所示；
G18833，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:32所示；
TGLA227，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:34所示；
FJ232023，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:36所示；
FJ232022，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:38所示；
FJ232026，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:40所示；
SPS113，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:42所示。
进一步的，所述特异性引物分为四组，至少有一条采用荧光染料标记其5’端，UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60为第一组，BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929为第二组，Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833为第三组，TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113为第四组。
进一步的，第一组的五个STR位点UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.4μM、0.6μM、0.1μM、0.32μM、0.32μM；
第二组的六个STR位点BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.2μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM；
第三组的五个位点Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.12μM、0.2μM、0.32μM、0.48μM、0.32μM；
第四组的五个STR位点TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.32μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM、0.8μM。
进一步的，所述荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一种，四组特异性引物采用的荧光染料均不同，内标选用橙色荧光SIZ标记。
进一步的，所述复合扩增试剂盒的组成为：21个基因座的等位基因分型标准物、如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42序列所示的特异性引物的混合物、反应混合液、热启动Taq酶、黄牛基因组DNA、sdH2O和荧光分子量内标，21个基因座的等位基因分型标准物为PCR产物的混合物，包括20个黄牛STR位点、1个黄牛性别位点以及其他所有的已知分型，在实际运用中可作为校准的标尺使用。
进一步的，所述反应混合液的组成为：MgCl2 7.5mM、Tris-HCl 125mM、KCl 125mM、dNTPs 7.5mM、BSA 2g/L，BSA是牛血清中的一种白蛋白，对酶有保护作用，可防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻酶的变性。
本发明还提供了一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒在法医鉴定、黄牛亲权鉴定或个体识别中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明公开了一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用，试剂盒可同时扩增20个黄牛STR位点和1个性别Amel位点，共包括扩增20个黄牛STR位点和1个性别Amel位点的21对特异性引物，特异性引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示。本发明提供的黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒及应用，采用的基因座同时包括常染色体STR、Y染色体STR与性别Amel位点，相比一般仅含有常染STR位点的试剂盒，本发明的基因座涵盖范围更加全面；可在单管中同时扩增、检测20个黄牛STR位点及1个黄牛性别位点，为同类型产品中检测位点最多的试剂盒；本发明选用的基因组尽量分布在各条染色体上，相互之间不存在遗传连锁，有助于提高试剂盒的整体识别能力；引物混合物中含有21对共42条引物，通过逐条加入测试的方法保证每条引物之间相互无干扰，无非特异峰产生；具有特异性强、分辨率高、分型准确、灵敏度高等特点，可完全满足黄牛亲权鉴定、个体识别、性别辨别等多方面需求。
附图说明
图1为本发明的基因座排布示意图；
图2-6为本发明的实际样本分型图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
如图1-6所示，一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒，共包括用于同时扩增20个黄牛STR位点和1个黄牛性别位点的21对特异性引物，特异性引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42所示。
20个黄牛STR位点包括UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60、BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833、TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113；1个黄牛性别位点为Amelogenin。
黄牛STR位点和黄牛性别位点与对应的特异性引物分别为：
UMN0108，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；
BM2113，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示；
FJ232028，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示；
SPS115，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:8所示；
CSRM60，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10所示；
BM067，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12所示；
TGLA122，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示；
INRA023，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16所示；
BM1818，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18所示；
ILSTS006，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20所示；
UMN0929，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:21～22所示；
Amelogenin(Amel)，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:23～SEQ IDNO:24所示；
ETH225，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:25～26所示；
BM1824，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28所示；
TGLA126，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:29～30所示；
G18833，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:32所示；
TGLA227，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:34所示；
FJ232023，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:36所示；
FJ232022，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:38所示；
FJ232026，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:40所示；
SPS113，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:42所示。
特异性引物分为四组，至少有一条采用荧光染料标记其5’端，荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一种，四组特异性引物采用的荧光染料均不同，内标选用橙色荧光SIZ标记；UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60为第一组，BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929为第二组，Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833为第三组，TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113为第四组；其中，第一组的五个STR位点UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.4μM、0.6μM、0.1μM、0.32μM、0.32μM；第二组的六个STR位点BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.2μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM；第三组的五个位点Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.12μM、0.2μM、0.32μM、0.48μM、0.32μM；第四组的五个STR位点TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.32μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM、0.8μM。
试剂盒包括：反应混合液(Reaction Mix)、如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:42序列所示的特异性引物的混合物、热启动Taq酶、黄牛基因组DNA、sdH2O、21个基因座等位基因分型标准物(为PCR产物的混合物，包括20个黄牛STR位点、1个黄牛性别位点)和荧光分子量内标；其中，反应混合液的组成为：MgCl2 7.5mM、Tris-HCl 125mM、KCl 125mM、dNTPs 7.5mM、BSA 2g/L。
本发明提供了一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒在法医鉴定、黄牛亲权鉴定或个体识别中的应用，包括以下步骤：
收集黄牛基因组DNA，进行PCR扩增，分析扩增产物；其中，PCR扩增条件为：变性95℃2min，循环94℃30s、60℃1min、68℃1min，共30个循环，终止延伸72℃20min，4℃维持。
法医鉴定、亲权鉴定或个体性别鉴定中采用的样品来源包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机抽提法提取的黄牛基因组DNA。
一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、配制PCR扩增体系；
步骤二、扩增热循环
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择表1推荐的PCR扩增条件进行PCR扩增；
(3)扩增后的产物应避光保存；
表1
步骤三、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物：(0.5μL AGCU Marker SIZ-500)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数)，AGCUMarker SIZ-500购于无锡中德美联生物技术有限公司；
将12.5μL所述上样混合物与1μL扩增产物或21个基因座等位基因分型标准物Allelic Ladder(无锡中德美联生物技术有限公司)混合，避免产生气泡，95℃变性3min，冰浴3min，并尽快使遗传分析仪进行电泳检测；
步骤四、分型分析
用片段分析软件GeneMapper ID-X分析步骤三中遗传分析仪检测收集的数据，电泳采用多道或单道毛细管电泳。
实施例1
一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
一、基因座位点筛选
根据多态性高、标记间不连锁、易于基因分型等要求及实际引物测试效果与基因座排布需求，筛选出20个染色体STR基因座与1个Amel性别位点：UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60、BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929、Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833、TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113。
二、基因座排布
根据以上21个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60为第一组，荧光染料标记物为6-FAM；BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929为第二组，荧光染料标记物为HEX；Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833为第三组，荧光染料标记物为TAMRA；TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113为第四组，荧光染料标记物为ROX，基因座排布如图1。
三、特异性引物设计及复合扩增条件的建立
通过基因座名称或者染色体位置，利用UCSC或NCBI网站进行基因座序列下载；其次，根据每个基因座重复单元两侧的序列进行引物设计。
(1)特异性引物设计
在设计特异性引物时，使用的设计软件最佳搭配是Premier和Oligo合并使用，以Premier进行自动搜索，Oligo进行分析评价，特异性引物碱基分布要随机、Tm值相近、GC含量在40％～60％之间、引物自身及引物之间不应存在互补序列；同时也要保证引物扩增的特异性，在NCBI数据库中使用Primer-BLAST软件对设计的引物进行比对分析，要充分考虑引物3’端的特异性，因为引物3’端序列同源性较高的话容易导致错误引发。
随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座的特异性引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试，最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。
(2)复合扩增条件的建立
先对21个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究21个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，包括循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出21个基因座或位点(20个黄牛STR位点、1个黄牛性别位点)，最终特异性引物序列及浓度见表2。
表2
四、调整PCR反应混合液
PCR体系中，Mg2+浓度分别测试1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM 5个梯度，dNTPs浓度分别测试0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM 5个梯度，热启动Taq酶含量分别测试1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U共5梯度，Tris-HCl浓度定为10mM，KCl浓度定为40mM。通过设计正交实验，最终将Mg2+浓度定为2.0mM，dNTPs浓度定为0.25mM，热启动Taq酶含量2.0U，Tris-HCl浓度定为10mM，KCl浓度定为40mM，利用以上材料制备成反应混合液，加入到PCR体系中，PCR体系各组成及其含量见表3，总体积25.0μL，选择表1推荐的PCR扩增条件进行PCR扩增，扩增产物在遗传分析仪上荧光检测和电泳检测，最后进行结果分析。
表3
本试剂盒仅可用于提取样本的扩增，黄牛基因组DNA指的是黄牛基因组DNA提取物。因提取检材与提取方式的不同，所获得的DNA提取物浓度也不同，加入量X为不定值，根据所提DNA提取物的浓度可调节黄牛基因组DNA的加入量，保证加入的DNA为0.125-5ng，可获得准确分型结果。黄牛基因组DNA最大加入量X为9.5μL。
实施例2
一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒的应用，包括以下步骤：
(1)取5份不同黄牛的血斑样本：样本由某公安局提供。
(2)利用Chelex法对样本进行黄牛基因组DNA提取，使用本发明的试剂盒对提取样本进行分型检测，将5份样本的所有位点分型进行对比，如表4所示：
表4
位点名称 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
UMN0108 72,74 74,74 74,74 84,84 74,74
BM2113 127,133 131,135 125,127 127,133 131,133
FJ232028 150,162 154,162 150,154 150,162 150,162
SPS115 215,219 207,209 207,209 213,215 215,219
CSRM60 250,266 254,264 264,264 256,264 246,250
BM067 117,119 117,119 117,133 117,117 117,123
TGLA122 153,155 155,167 155,155 147,167 155,155
INRA023 201,209 207,215 197,201 207,209 209,209
BM1818 257,259 255,257 253,255 257,257 261,265
ILSTS006 268,278 284,294 282,288 284,288 280,284
UMN0929 303,321 315,321 307,309 305,305 305,315
Amel X,Y X,X X,Y X,X X,X
ETH225 150,162 152,154 146,162 142,152 146,152
BM1824 191,193 189,191 189,189 191,193 191,191
TGLA126 250,254 248,250 248,248 250,256 248,256
G18833 306,306 306,310 310,310 310,310 306,310
TGLA227 75,81 75,81 75,77 79,93 75,79
FJ232023 114,134 114,130 114,130 130,142 130,142
FJ232022 177,177 177,183 177,181 177,179 177,183
FJ232026 250,262 262,278 242,250 242,262 242,262
SPS113 302,310 300,310 300,300 296,306 294,310
结果显示，使用本发明对上述黄牛样本进行分型检测，发现各个黄牛个体之间分型存在较大差异，如图2-6的样本1-样本5的实际分型图所示，使用本发明可对黄牛个体进行有效辨别，同时可确定黄牛性别，在黄牛个体识别上有较大的作用。
本发明未详细说明的部分采用现有技术即可实现，在此不做赘述。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒，其特征在于，共包括21对特异性引物，用于同时扩增20个黄牛STR位点和1个黄牛性别位点，所述特异性引物的序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:42所示；
所述20个黄牛STR位点包括UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60、BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833、TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113；其中，BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60、BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833、TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113为常染色体STR基因座，UMN0108、UMN0929为Y染色体STR基因座；
1个黄牛性别位点为Amelogenin；
所述黄牛STR位点和黄牛性别位点与对应的特异性引物分别为：
UMN0108，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2所示；
BM2113，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO: 3~SEQ ID NO:4所示；
FJ232028，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5~SEQ ID NO: 6所示；
SPS115，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7~SEQ ID NO: 8所示；
CSRM60，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO: 9~SEQ ID NO: 10所示；
BM067，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11~SEQ ID NO: 12所示；
TGLA122，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13~SEQ ID NO: 14所示；
INRA023，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO: 15~SEQ ID NO: 16所示；
BM1818，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:17~SEQ ID NO: 18所示；
ILSTS006，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:19~SEQ ID NO: 20所示；
UMN0929，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:21~22所示；
Amelogenin，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:23~ SEQ ID NO: 24所示；
ETH225，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:25~26所示；
BM1824，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:27~ SEQ ID NO: 28所示；
TGLA126，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:29~30所示；
G18833，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:31~ SEQ ID NO: 32所示；
TGLA227，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:33~ SEQ ID NO: 34所示；
FJ232023，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:35~ SEQ ID NO: 36所示；
FJ232022，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:37~ SEQ ID NO: 38所示；
FJ232026，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:39~ SEQ ID NO: 40所示；
SPS113，对应的特异性引物序列如序列表中SEQ ID NO:41~ SEQ ID NO: 42所示；
所述特异性引物分为四组，每个位点对应的两条特异性引物中至少有一条采用荧光染料标记其5’端，UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60为第一组，BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929为第二组，Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833为第三组，TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113为第四组；
第一组的五个STR位点UMN0108、BM2113、FJ232028、SPS115、CSRM60对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.4μM、0.6μM、0.1μM、0.32μM、0.32μM；
第二组的六个STR位点BM067、TGLA122、INRA023、BM1818、ILSTS006、UMN0929对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.2μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM；
第三组的五个位点Amelogenin、ETH225、BM1824、TGLA126、G18833对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.12μM、0.2μM、0.32μM、0.48μM、0.32μM；
第四组的五个STR位点TGLA227、FJ232023、FJ232022、FJ232026、SPS113对应的特异性引物在扩增体系中的终浓度为0.32μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM、0.8μM；
所述荧光染料为6-FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一种，四组特异性引物采用的荧光染料均不同，内标选用橙色荧光SIZ标记；
所述复合扩增试剂盒的组成为：21个基因座的等位基因分型标准物、如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:42序列所示的特异性引物的混合物、反应混合液、热启动Taq酶、黄牛基因组DNA、sdH2O和荧光分子量内标。
2.根据权利要求1所述的一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述反应混合液的组成为：MgCl2 7.5mM、Tris-HCl 125mM、KCl 125mM、dNTPs 7.5mM、BSA 2g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种黄牛亲权鉴定和个体识别的复合扩增试剂盒在黄牛亲权鉴定或个体识别中的应用。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112342304B (zh) * 2020-12-07 2023-10-13 无锡中德美联生物技术有限公司 水牛21个str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN114561477B (zh) * 2022-03-17 2024-01-30 公安部物证鉴定中心 牛str复合扩增检测试剂盒、引物组合物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992013102A1 (en) * 1991-01-15 1992-08-06 Genmark Polymorphic dna markers in bovidae
CN109136384A (zh) * 2017-07-26 2019-01-04 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 同时分析牛基因组dna16个基因座的荧光检测试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7083925B2 (en) * 2002-01-11 2006-08-01 Schnabel Robert D Method of parentage testing in North American bison, Bison bison and domestic cattle using microsatellite loci

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992013102A1 (en) * 1991-01-15 1992-08-06 Genmark Polymorphic dna markers in bovidae
CN109136384A (zh) * 2017-07-26 2019-01-04 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 同时分析牛基因组dna16个基因座的荧光检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.C. Mateus等.Exploring the genetic diversity and substructure of the Portuguese cattle breed "Brava de Lide" using microsatellites.《Animal Genetic Resources》.2014,第第55卷卷摘要、第11页左栏第1段. *
张润锋等.3个黄牛品种Y-STR多态性.《西北农业学报》.2012,第第21卷卷(第第21卷期),摘要. *
朱贵等.亲子鉴定技术在龙江和牛产业化生产中的应用.《黑龙江畜牧兽医》.2019,(第undefined期),第74页右栏第2-3段. *
王均辉.中国部分地方黄牛品种遗传多样性研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》.2007,(第undefined期),摘要、第21-22页. *

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