CN116751872A - 一种用于鸽子身份鉴定str复合扩增检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子遗传学检测试剂盒技术领域，具体的说是一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒及其应用，包括19对扩增引物和多重PCR引物组合物，分别用于同时扩增18个常染色体STR位点，和1个性别鉴定基因座的STR位点，19对扩增引物包括PIGN15、PG1、PIGN04、PIGN57、PG5、PG6、PIGN12、PIGN26、CHD等19对常染色体和性别染色体，多重PCR引物组合物包括19对引物，19对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.38所示，荧光复合扩增体系中的19对引物的上游引物的5，端由4种不同的荧光素进行标记，相同的荧光素标记视为同一组；本发明可以有效增加单次检测位点数、提升个体识别力，同时可大幅度提高复合扩增试剂稳定性和耐受性，具有高个体识别力。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒及其应用，具体为一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒及其应用，属于分子遗传学检测试剂盒技术领域。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeats，STR)是由2-7个碱基对作为核心单位,串联重复形成的一类微卫星NDA序列,其片段可采用PCR技术扩增。STR主要由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因座的遗传多态性,使得其包含的信息更加丰富，平均一个STR位点的信息量大约是6个SNP位点的信息量。具有高度多态性和稳定性。
与AMP FLP和VNTR等分型方法相比，STR基因分型方法所扩增的产物长度小得多(小于500bp)，因此对于模板质量要求较低，即使降解的DNA模板也可以进行分析。此外，STR分型适用于多种DNA纯化方法所纯化的DNA，而这些纯化方法所获得的DNA量往往不够作为Southern印迹分析。鉴于以上这些特点，STR分型技术已经广泛应用于法医身份识别鉴定。
短串联重复序列(STR)和性别基因动物分型系统，不仅能提供重要的分子遗传标记信息，还能有效地解决动物个体识别和亲缘关系难题，是目前进行个体识别和亲缘鉴定关系鉴定中最权威、最常用的标记。目前市面上关于鸽子个体识别和亲缘关系鉴定的试剂盒较少，这就在鸽子的个体识别和亲子鉴定方面，无论是常规检测还是法律纠纷案件，带来了不少的困扰。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒及其应用，不仅可以有效增加单次检测位点数、提升个体识别力，同时可大幅度提高复合扩增试剂稳定性和耐受性，具有高个体识别力，可运用于亲子鉴定和个体识别等研究领域。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，包括19对扩增引物和多重PCR引物组合物，分别用于同时扩增18个常染色体STR位点，和1个性别鉴定基因座的STR位点，所述19对扩增引物包括PIGN15、PG1、PIGN04、PIGN57、PG5、PG6、PIGN12、PIGN26、CHD等19对常染色体和性别染色体。
进一步的，所述多重PCR引物组合物包括19对引物，所述19对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.38所示，所述荧光复合扩增体系中的19对引物的上游引物的5，端由4种不同的荧光素进行标记，相同的荧光素标记视为同一组，4种不同的荧光素标记为6-FAM标记的蓝色荧光，HEX标记的绿色荧光，6-FAMRA标记的黄色荧光和ROX标记的红色荧光。
进一步的，还包括多重PCR反应预混液和去离子水，所述PCR反应预混液以去离子水为溶剂，包括以下浓度的组分：5U/μl的热启动聚合酶、20mM pH 8.0的Tris-HCl、20mM镁离子、2.5mM的dNTPs、100mM的KCL、0.1mM的EDTA、1mM的DTT、体积分数为0.5％Tween20、质量分数为0.5％的NP-40和质量分数为50％Glycerol。
进一步的，所述19对扩增引物在复合扩增体系中的引物终浓度为0.4μM。
一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒的应用，包括以下步骤：
鸽子样品收集，包括绒羽和口腔咽拭子；
鸽子DNA基因组的提取，包括Chelex-100法抽提、经典的氯仿法抽提和试剂盒的方法抽提；
鸽子DNA基因组的定性和定量，包括NANO-400A测定吸光度进行DNA定量和1％琼脂糖电泳进行DNA定性；
将待检测DNA基因组放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行毛细管电泳检测；
将待检测样品放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行检测；所述待检测样品PCR扩增的扩增体系以25μL计，包括2μl所述基因组DNA、5μl所述引物组的混合物、4μl PCR反应预混液、0.1μl热启动聚合酶和13.9μl去离子水；所述PCR扩增的扩增程序为：98℃、5min；98℃、10sec，54℃、30sec，72℃、40sec，10循环；98℃、10sec，52℃、30sec，72℃、40sec，20循环；72℃、10min；4℃保存。
本发明的技术效果和优点：本发明不仅可以有效增加单次检测位点数、提升个体识别力，同时可大幅度提高复合扩增试剂稳定性和耐受性。19个基因座联合起来，提供了更多信息量，具有高个体识别力，可运用于亲子鉴定和个体识别等研究领域。
本发明的引物组能够实现快速扩增，且扩增特异性强，无非特异性扩增，同时各条引物之间不互相产生干扰。每对引物均具有很高的特异性，所有19对引物之间均无相互作用，使得19个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在70～430bp之间。经过扩增反应，每个基因座均能得到特异性的1～2条扩增带，无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰。
本发明的引物组还具有灵敏度高的优势，同时可适用于各种检材的常染色体STR扩增检测，可以满足当前身份鉴定、DNA数据库建设、亲缘关系鉴定的多功能STR身份鉴定需求。
附图说明
图1为本发明的应用流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，包括19对扩增引物和多重PCR引物组合物，分别用于同时扩增18个常染色体STR位点，和1个性别鉴定基因座的STR位点，所述19对扩增引物包括PIGN15、PG1、PIGN04、PIGN57、PG5、PG6、PIGN12、PIGN26、CHD等19对常染色体和性别染色体，所述19对扩增引物在复合扩增体系中的引物终浓度为0.4μM。
选取具有高鉴别力的STR基因座，对200多个个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率计算个体识别能力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，最终确立了19个STR基因座的构成，包括PIGN15、PG1、PIGN04、PIGN57、PG5、PG6、PIGN12、PIGN26、CHD等18对常染色体和1对性别染色体。
所述多重PCR引物组合物包括19对引物，所述19对引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.38所示，所述荧光复合扩增体系中的19对引物的上游引物的5，端由4种不同的荧光素进行标记，相同的荧光素标记视为同一组，4种不同的荧光素标记为6-FAM标记的蓝色荧光，HEX标记的绿色荧光，6-FAMRA标记的黄色荧光和ROX标记的红色荧光。
还包括多重PCR反应预混液和去离子水，所述PCR反应预混液以去离子水为溶剂，包括以下浓度的组分：5U/μl的热启动聚合酶、20mM pH 8.0的Tris-HCl、20mM镁离子、2.5mM的dNTPs、100mM的KCL、0.1mM的EDTA、1mM的DTT、体积分数为0.5％Tween20、质量分数为0.5％的NP-40和质量分数为50％Glycerol，最终PCR反应扩增体系为总体积25μl，包括基因组DNA模板2μl(200ng)，Reaction Mix为4μl，混合引物5μl，热启动酶0.1μl。
请参阅图1所示，一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒的应用，包括以下步骤：
鸽子样品收集，包括绒羽和口腔咽拭子；
鸽子DNA基因组的提取，包括Chelex-100法抽提、经典的氯仿法抽提和试剂盒的方法抽提；
鸽子DNA基因组的定性和定量，包括NANO-400A测定吸光度进行DNA定量和1％琼脂糖电泳进行DNA定性；
为了获得高纯度的基因组DNA，采用多种提取方法对鸽子基因组DNA提取和优化。其中鸽子样品的采集，包括采集绒羽和口腔咽拭子。基因组DNA的提取方法分别用Chelex-100法抽提、经典的氯仿法抽提和试剂盒的方法抽提。最终确定口腔咽拭子样品采用试剂盒的方法抽提DNA，绒羽样品采用Chelex-100法抽提DNA，Chelex-100法抽提DNA操作步骤包括：剪取4-7根绒羽毛根于1.5ml灭菌离心管中，加入100ul的10％Chelex和10ul的10mg/ml的蛋白酶K，100℃保温30min，12000g离心5min，取上清-20℃保存或使用。
将待检测DNA基因组放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行毛细管电泳检测；
将待检测样品放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行检测；所述待检测样品PCR扩增的扩增体系以25μL计，包括2μl所述基因组DNA、5μl所述引物组的混合物、4μl PCR反应预混液、0.1μl热启动聚合酶和13.9μl去离子水；所述PCR扩增的扩增程序为：98℃、5min；98℃、10sec，54℃、30sec，72℃、40sec，10循环；98℃、10sec，52℃、30sec，72℃、40sec，20循环；72℃、10min；4℃保存。
在实际应用时，采用多人分别多次从鸽子样品收集、基因组DNA的提取、混合PCR扩增和基因分型等各步骤操作验证，分型结果均一致。可以通过检测样品STR的基因分型图谱和分型数据，以对照样品的19个基因位点图谱和分型数据作为参考，检测样品与对照样品的一个基因位点或多个基因位点中，检测样品的等位基因是否支持对照样品所必需的等位基因，判断个体识别和个体差异。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：包括19对扩增引物和多重PCR引物组合物，分别用于同时扩增18个常染色体STR位点，和1个性别鉴定基因座的STR位点；
所述19对扩增引物包括PIGN15、PG1、PIGN04、PIGN57、PG5、PG6、PIGN12、PIGN26、CHD等19对常染色体和性别染色体。
2.根据权利要求1所述的一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR引物组合物包括19对引物，所述19对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.38所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：所述荧光复合扩增体系中的19对引物的上游引物的5，端由4种不同的荧光素进行标记，相同的荧光素标记视为同一组。
4.根据权利要求3所述的一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：4种不同的荧光素标记为6-FAM标记的蓝色荧光，HEX标记的绿色荧光，6-FAMRA标记的黄色荧光和ROX标记的红色荧光。
5.根据权利要求1所述的一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：还包括多重PCR反应预混液和去离子水，所述PCR反应预混液以去离子水为溶剂，包括以下浓度的组分：5U/μl的热启动聚合酶、20mM pH 8.0的Tris-HCl、20mM镁离子、2.5mM的dNTPs、100mM的KCL、0.1mM的EDTA、1mM的DTT、体积分数为0.5％Tween20、质量分数为0.5％的NP-40和质量分数为50％Glycerol。
6.根据权利要求1所述的一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒，其特征在于：所述19对扩增引物在复合扩增体系中的引物终浓度为0.4μM。
7.一种用于鸽子身份鉴定STR复合扩增检测试剂盒的应用，其特征在于：
用于鸽子样品收集，包括绒羽和口腔咽拭子；
用于鸽子DNA基因组的提取，包括Chelex-100法抽提、经典的氯仿法抽提和试剂盒的方法抽提；
用于鸽子DNA基因组的定性和定量，包括NANO-400A测定吸光度进行DNA定量和1％琼脂糖电泳进行DNA定性；
将待检测DNA基因组放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行毛细管电泳检测；
将待检测样品放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行检测；所述待检测样品PCR扩增的扩增体系以25μL计，包括2μl所述基因组DNA、5μl所述引物组的混合物、4μl PCR反应预混液、0.1μl热启动聚合酶和13.9μl去离子水；所述PCR扩增的扩增程序为：98℃、5min；98℃、10sec，54℃、30sec，72℃、40sec，10循环；98℃、10sec，52℃、30sec，72℃、40sec，20循环；72℃、10min；4℃保存。
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