CN110607374A - 一种同时扩增人27个str基因座的荧光标记扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，包含24个常染色体STR基因座、1个Y染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座的特异性扩增引物对，基因座为：D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、D2S1338、D6S1043、D22S1045、D19S433、D1S1656、D12S391、D10S1248、D2S441、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、SE33、Penta D、DYS391、Y‑INDEL和Amelogenin。前述基因座包含公安部规定的20个核心基因座和四个优选基因座，涵盖了目前市面上主流试剂盒的所有位点，可有效预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险，具有高个体识别力和高非父排除率的优势。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，尤其是一种同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒及其应用。
背景技术
STR(short tandem repeats，短串连重复序列)又称微卫星序列，是大量存在于人类基因组DNA中的短串连重复序列，重复单位为2～6个核苷酸。由于具有高度多态性和稳定性，并且与AMP-FLP和VNTR等分型方法相比，STR基因分型方法所扩增的产物长度小得多(小于500 bp)，因此对于模板质量要求较低，即使降解的DNA模板也可以进行分析。此外，STR分型适用于多种DNA纯化方法所纯化的DNA，而这些纯化方法所获得的DNA量往往不够作Southern印迹分析。鉴于以上这些特点，STR分型技术已经广泛应用于法医身份识别鉴定。
法医DNA数据库是集成现代DNA检验技术、信息技术、网络技术和科学管理等要素，实现跨时空多元化应用、精确打击犯罪、保护人民、维护社会稳定的十分重要的科技利器。法医DNA数据库的核心在于所收录的STR(short tandem repeat)数据信息，一个完善的法医DNA数据库应该包含常染色体STR数据库和Y染色体STR数据库。Y染色体 STR数据为案件提供侦查线索，缩小侦查范围，可以预测罪犯可能存在的地区、种族甚至姓氏，常染色体STR数据用于最后罪犯个体的筛查及确认。
最早由美国公布了13个CODIS核心基因座(CSF1PO、D3S1358、 D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、 FGA、TH01、TPOX、vWA)随着我国法医DNA数据库的完善，我国公安部公布了属于我们自己的核心基因座(20个基因座，包含原美国13个CODIS核心基因座及Amelogenin、D2S1338、D19S433、D6S1043、 D12S391、Penta D、Penta E)及优选基因座(10个基因座，包换 D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、 D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435用于扩大筛查使用)，相对应的，公安DNA法医鉴定对试剂盒的基因座数量、信息含量及试剂盒的兼容性就有了更高的需求。而目前市面上的试剂盒大多只包含有20个核心基因座，在优选基因座上各家的试剂盒各不相同，公安在使用过程中极不方便，要想使用更多的基因座进行犯罪嫌疑人的判定，通常需要多款试剂盒联合使用，也需要耗费更多的时间。公安用户除了对基因座的需求增加以外，还对扩增时间、适用检材种类、灵敏度等也有了越来越高的要求。
为了从根本上解决公安用户的使用需求，提高试剂盒的兼容性、减少扩增时间、提高试剂盒的检材适应性、提高试剂盒的灵敏度，亟需开发一款新的常染色体STR试剂盒。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明的目的在于提供在一个单管中可同时扩增检测27个STR基因座(含24个常染色体STR基因座、1 个Y染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座)的荧光标记扩增试剂盒及其应用，可以提高试剂盒的兼容性、减少扩增时间、提高试剂盒的检材适应性、提高试剂盒的灵敏度，进一步满足公安用户的使用需求。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，所述试剂盒包含24个常染色体STR基因座、1个Y染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座的特异性扩增引物对，所述基因座如下：
24个常染色体STR基因座分别是：D3S1358，TH01，D21S11， D18S51，Penta E，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539， CSF1PO，D2S1338，D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656， D12S391，D10S1248，D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA， SE33，Penta D；
1个Y染色体STR基因座DYS391；
2个性别鉴定基因座Y-INDEL和Amelogenin。
根据本发明的技术方案，所述27个基因座的特异性扩增引物对为： D3S1358：SEQID NO:1-2；TH01：SEQ ID NO:3-4；D21S11：SEQ ID NO:5-6；D18S51：SEQ ID NO:7-8；PentaE：SEQ ID NO:9-10； Amelogenin：SEQ ID NO:11-12；D5S818:SEQ ID NO:13-14； D13S317:SEQ ID NO:15-16；D7S820：SEQ ID NO:17-18；D16S539： SEQ ID NO:19-20；CSF1PO：SEQ IDNO:21-22；D2S1338：SEQ ID NO:23-24；D6S1043：SEQ ID NO:25-26；D22S1045：SEQ ID NO:27-28；D19S433：SEQ ID NO:29-30；D1S1656：SEQ ID NO:31-32；DYS391：SEQ ID NO:33-34；D12S391：SEQ ID NO:35-36； D10S1248：SEQ ID NO:37-38；D2S441：SEQ ID NO:39-40；vWA：SEQ ID NO:41-42；D8S1179：SEQ ID NO:43-44；TPOX：SEQ ID NO:45-46；FGA：SEQ ID NO:47-48；Y-INDEL：SEQ ID NO:49-50； SE33：SEQ ID NO:51-52；Penta D：SEQ ID NO:53-54。
根据本发明的技术方案，进一步地，所述27个基因座进行分组并且每个基因座的至少1个特异性扩增引物的5’端通过化学荧光染料进行标记。
根据本发明的技术方案，进一步地，所述27个基因座按照如下方式分组：
第一组：D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，Penta E；
第二组：Amelogenin，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，D2S1338；
第三组：D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，DYS391， D12S391，D10S1248；
第四组：D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA；
第五组：Y-INDEL，SE33，Penta D。
本发明采用六色荧光标记系统，分别是FAM、HEX、TAMAR、 ROX、PURPLE、ORG；其中FAM代表蓝色，HEX代表绿色，TAMAR 代表黄色，ROX代表红色，PURPLE代表紫色，ORG代表橙色。
具体地，所述第一组到第五组分别采用不同的荧光染料标记，其中第一组采用FAM，代表蓝；第二组采用HEX，代表绿；第三组采用 TAMAR，代表黄；第四组采用ROX，代表红；第五组采用PURPLE，代表紫；ORG代表橙色，用于内标。
根据本发明的技术方案，进一步地，本发明的试剂盒由两部分组成，一部分为反应体系，包含引物混合物、反应预混液、阳性对照DNA 9947和去离子水，所述引物混合物是指所述27个基因座的特异性扩增引物对的混合物；另一部分为检测试剂，包含分子量内标和等位基因阶梯。
根据本发明的技术方案，进一步地，所述27个基因座的特异性扩增引物对的浓度如下：
SEQ ID NO:1-2为0.06-0.1μM，SEQ ID NO:3-4为0.07-0.11μM， SEQ ID NO:5-6为0.1-0.15μM，SEQ ID NO:7-8为0.1-0.15μM， SEQ ID NO:9-10为0.18-0.23μM，SEQ ID NO:11-12为0.1-0.15μM，SEQ ID NO:13-14为0.08-0.13μM，SEQ ID NO:15-16为0.05-0.08μM，SEQ ID NO:17-18为0.13-0.17μM，SEQ ID NO:19-20为0.11-0.15μM， SEQ ID NO:21-22为0.1-0.15μM，SEQ ID NO:23-24为0.1-0.15μM， SEQ ID NO:25-26为0.12-0.16μM，SEQ IDNO:27-28为0.2-0.25μM， SEQ ID NO:29-30为0.13-0.18μM，SEQ ID NO:31-32为0.11-0.16μM，SEQ ID NO:33-34为0.17-0.22μM，SEQ ID NO:35-36为0.2-0.25μM， SEQ ID NO:37-38为0.3-0.4μM，SEQ ID NO:39-40为0.12-0.18μM， SEQ ID NO:41-42为0.12-0.18μM，SEQ IDNO:43-44为0.2-0.25μM， SEQ ID NO:45-46为0.22-0.28μM，SEQ ID NO:47-48为0.06-0.1μM， SEQ ID NO:49-50为0.2-0.25μM，SEQ ID NO:51-52为0.06-0.1μM， SEQ ID NO:53-54为0.2-0.3μM。
根据本发明的技术方案，所述反应预混液中包含热启动DNA聚合酶、dNTP、镁离子、钾离子、Tris缓冲液及增强剂等。
优选地，所述反应预混液的配方为：0.19-0.38U/ul的热启动Taq DNA聚合酶、100-200mM的Tris缓冲液、100-200mM的KCL、 3.75-7.5mM的MgCl2、50-100mM的(NH4)2SO4、0.5-1uM的dNTP、 1000-1500mM的甜菜碱、0.19％-0.38％的Triton、2-3mg/ml的BSA、 5％-15％的Tween、2.5％-7.5％的甘油、去离子水。
所述反应预混液为专门对应本发明特定而开发的反应预混液，反应预混液中包含热启动DNA聚合酶、dNTP、镁离子、钾离子、Tris缓冲液及增强剂等试剂。所述反应预混液具有快速、灵敏度高、适应性强等特点，并且反应预混液可以在-20℃条件下不结冰，可以有效的防止冻融对试剂性能的影响。本发明的反应预混液灵敏度高达0.03ngDNA，有效扩增时间降低到1.5小时以内，并且对不同来源(血液、血痕、精液、精斑、唾液、唾液斑、毛发、组织、指甲、体液等)的DNA均具有优良的扩增效果，同时对特种血卡、唾液卡、FTA卡也有非常好的扩增效果。
根据本发明的技术方案，扩增试剂盒的扩增程序为：
变性：95℃，5min，
扩增：94℃10s→59℃40s→72℃45s,30个循环；
终止延伸60℃，30min；
15℃低温保存。
根据本发明的技术方案，所述检测试剂中，对应各基因座的等位基因阶梯为：
在第一组中：D3S1358：12,13,14,15,16,17,18,19,20；TH01：5, 8,9,10；D21S11：26,27,28,28.2,29,29.2,30,31,31.2,32.2,33,33.2,34, 34.2,35.2,36.2,38；D18S51：8,9,10,11,12,13,14,16,17,18,19,20,21, 23,24,25,26,27；Penta E：5,6,7,9,10,12,13,14,16,17,19,20,21, 22,23,24,26；
在第二组中：Amelogenin：X，Y；D5S818：7,8,9,10,11,12,13, 14,15；D13S317：7,8,9,10,11,12,13,14；D7S820：7,8,9.3,10,11, 12,13,14,15；D16S539：5,6,8,9,10,12,13；CSF1PO：6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16；D2S1338：16,17,18,20,21,23,24,25,26；
在第三组中：D6S1043：9,10,11,13,14,15,16,17,18,19,20,21；
D22S1045：11,12,14,15,16,17,18；D19S433：9,10,11,11.2,13, 14,15,16,17,18.2；D1S1656：10,11,12,13,14,15,16,17,18；DYS391：6,7,8,9,10,11,12,13；D12S391：15,16,17,20,21,23,24, 25,26,27；D10S1248：10,11,12,13,14,15,16,17,18；
在第四组中：D2S441：8.1,9,10,11,12,13,14,15；vWA：12,13, 14,15,16,17,18,19,20；D8S1179：7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17；
TPOX：6,7,8,9,10,11,12,13,14；FGA：16,17,18,19,20,21, 23,24,25,26,27,29,30,31.2,43.2,44.2,45.2,46.2；
在第五组中：Y-INDEL：1,2；SE33：16,18,18.2,19,21,21.2,22.2, 23.2,24.2,25.2,26.2,27.2,28.2,29.2,31.2,32.2；Penta D：5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16。
根据本发明的技术方案，所述检测试剂中，分子量内标为 BTY-500，其包含75、100、139、150、160、200、250、300、340、 400、450、490、500共13条DNA片段，可以有效的区分75-500bp的 DNA片段的大小。
本发明应用荧光标记的方法在引物的5’端标记一个荧光染料，PCR 产物在激光激发状态下，可以发射特定波长的光信号，通过遗传分析仪 (ABI3130\ABI3500\ABI3730系列一传一)进行电泳检测可以收集到光信号，通过收集的光信号进行检测。
遗传分析仪检测原理是利用毛细管电泳的原理来进行检测。扩增产物、分子量内标、甲酰胺按一定比例混合，利用DNA的荷质比不变的特性，根据分子量大小来进行区分。分子量内标是由不同大小荧光标记的DNA片段组成，目的是用来区分扩增产物的大小。
遗传分析仪得到的数据，通过Genemapper数据分析软件分析，可以得到样本的STR基因分型图谱及数据。
本发明可以应用到法医、司法鉴定、人类学研究等领域。
(三)有益效果
本发明的有益效果包括：
(1)本发明的荧光标记扩增试剂盒，包含市面常用常染色体STR试剂盒全部基因座，具体包括24个常染色体STR基因座，1个Y-STR基因座，2个性别鉴定基因座Y-INDEL和Amelogenin。通过研究筛选，确保所选基因座与市场主流试剂盒的基因座具有一定兼容性，即可以与已有 DNA数据进行共享与交流，最后筛选出所述27个STR基因座。本发明的试剂盒可快速扩增、灵敏度高、同时可适用于各种检材的常染色体 STR扩增检测。所选的27个基因座包含了公安部规定的20个核心基因座，以及四个优选基因座，包含了目前市面上主流试剂盒的所有位点。同时还包含了3个性别鉴定基因座，可以有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险。27个基因座联合起来，具有高个体识别力、高非父排除率的特征。
(2)本发明27个基因座的引物对(共27对引物)均经过特别设计优化，特异性强，无非特异性扩增，同时各条引物之间不互相产生干扰，不形成引物二聚体。引物长度皆在18bp-32bp之间，TM值在60℃左右，且每对引物均具有很高的特异性，所有27对引物之间均无相互作用，使得27个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在80-460bp之间。经过扩增反应，每个基因座均能得到特异性的 1-2条扩增带，无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰。
(3)本发明采用六色荧光标记系统，分别是FAM、HEX、 TAMAR、ROX、PURPLE、ORG。其中FAM代表蓝色，HEX代表绿色，TAMAR代表黄色，ROX代表红色，PURPLE代表紫色，ORG代表橙色。借此，在一个反应中可以同时扩增27个基因座，充分满足了目前公安DNA数据库对比的兼容性。
(4)本发明开发的反应预混液具有不冻的特性，可以有效防止由于冻融引起的试剂性能下降的风险，同时本发明的反应预混液中包含Taq 酶、dNTP、镁离子，不需要单独添加，可以有效的减少操作步骤，从而减少交叉污染的风险。本发明的反应预混液还具有快速、灵敏、适应性强的特点，反应时间缩短至1.5小时以内，灵敏度高达0.03ng、适应各类DNA及各种血卡、FTA卡、唾液卡等。
(5)本发明的等位基因阶梯囊括了各个基因座最常见的所有等位基因及绝大多数的稀有等位基因，非常方便数据分析和基因分型结果的比对。
(6)本发明的分子量内标大小合适，可以有效区分75-500bp的DNA 片段大小。
综上所述，本发明对现有技术的贡献包括：对基因座的合理筛选、设计各个基因座的引物、选用合适的荧光染料、优化高效的反应预混液，优化扩增程序，筛选各个基因座的等位基因，设计大小合适的分子量内标，从而完成了一款可以满足当前法医身份鉴定、法医DNA数据库建设、司法亲缘关系鉴定的多功能STR身份鉴定试剂盒。
附图说明
图1为阳性对照DNA 9947基因分型图。
图2为阳性对照DNA 9948基因分型图。
图3为等位基因阶梯分型图。
图4为分子量内标BTY-500图谱。
图5为疑似子基因分型图。
图6为疑似父基因分型图。
图7为血卡检材基因分型图。
图8为提取DNA检材基因分型图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明针对现有技术的问题，提出一种可同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，具体包括24个常染色体STR基因座，1个 Y-STR基因座(也是一种性别鉴定基因)，2个性别鉴定基因座Y-INDEL 和Amelogenin，通过在一个反应中同时扩增27个基因座，充分满足了目前公安DNA数据库对比的兼容性，减少扩增时间、提高鉴定效率和试剂盒的检材适应性。
以下对本发明可同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒的各部分设计和特点进行详细说明。
(一)基因座的选择和引物的设计
本发明检测的27个基因座包含：
24个常染色体STR基因座，分别是：D3S1358，TH01，D21S11， D18S51，Penta E，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539， CSF1PO，D2S1338，D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656， D12S391，D10S1248，D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA， SE33，Penta D；
1个Y染色体STR基因座DYS391；2个性别鉴定基因座Y-INDEL 和Amelogenin(也可认为是3个性别鉴定基因座)。
本发明荧光标记扩增试剂盒共分为两大部分，第一部分为反应体系，包含引物混合物、反应预混液、阳性对照DNA 9947、去离子水；第二部分为检测试剂，分为分子量内标和等位基因阶梯。
其中，引物混合物包含27对引物，分别对应本发明中涉及的27个基因座。针对27个基因座，设计了27对引物，引物长度在18bp-30bp 之间，TM值在60℃左右，且每对引物均具有很高的特异性，所有27对引物之间均无相互作用，使得27个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在80-460bp之间。经过扩增反应，每个基因座均能得到特异性的1-2条扩增带，无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰。
表1：引物序列及引物混合物中引物的浓度
目前常染色体STR扩增试剂盒主要用于案件侦破、亲缘关系鉴定过程，市面上充斥着各类试剂盒，虽然都包含了13个CODIS核心基因座，但是其他基因座各不相同。为了减少法医等使用者在排查过程中的重复扩增，本发明选择基因座方面，包含了目前主流试剂盒所有的24个常染色STR基因座，24个常染色体STR基因座分别是：D3S1358， TH01，D21S11，D18S51，Penta E，D5S818，D13S317，D7S820， D16S539，CSF1PO，D2S1338，D6S1043，D22S1045，D19S433， D1S1656，D12S391，D10S1248，D2S441，vWA，D8S1179，TPOX， FGA，SE33，Penta D；同时为了减少鉴定过程当中出现由于Y染色体基因缺失造成的性别鉴定错误，本发明在传统的性别鉴定基因座 Amelogenin外，还加入了一个高度保守的基因座Y-INDEL和一个Y染色体STR基因座DYS391，用于辅助性别鉴定。
为了能在同一管中同时扩增27个基因座，在对27个基因座的引物进行设计时，使各对引物能在一个管中、稳定兼容互不反应，且特异性、二级结构、扩增效率、稳定性等大大提高。引物序列见表1。
(二)荧光染料的选择
根据需求，本发明荧光标记扩增试剂盒是采用六色荧光标记系统，分别是FAM、HEX、TAMAR、ROX、PURPLE、ORG。其中FAM代表蓝色，HEX代表绿色，TAMAR代表黄色，ROX代表红色，PURPLE代表紫色，ORG代表橙色。
本发明27个基因座分别用FAM、HEX、TAMAR、ROX、PURPLE 五种荧光染料标记，并将基因座分为五组，代表蓝、绿、黄、红、紫。第六种，ORG代表橙色，用于内标。27个基因座分布情况如下：
第一组，蓝，荧光染料为FAM，标记基因座：D3S1358，TH01， D21S11，D18S51，PentaE；
第二组，绿，荧光染料为HEX，标记基因座：Amelogenin， D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，D2S1338；
第三组，黄，荧光染料为TAMAR，标记基因座：D6S1043， D22S1045，D19S433，D1S1656，DYS391，D12S391，D10S1248；
第四组，红，荧光染料为ROX，标记基因座：D2S441，vWA， D8S1179，TPOX，FGA；
第五组，紫，荧光染料为PURPLE，标记基因座：Y-INDEL， SE33，Penta D。
将本发明荧光标记扩增试剂盒的与市面上主流试剂盒位点对比，对比结果见表2。
表2：本发明荧光标记扩增试剂盒与市面主流试剂盒位点对比
(三)对试剂盒的进一步优化
为了能使本发明的性能达到预期指标：同时扩增27个基因座、高灵敏度、适应各种类型检材、快速扩增等指标，本发明还对试剂盒的各个部分均进行了优化。
(1)对试剂盒的组成进行优化
本发明可同时扩增27个基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其包含：引物混合物、PCR预混液、去离子水、阳性对照DNA9947/9948、等位基因阶梯27A、分子量内标BTY-500、六色光谱校正试剂(包括蓝、绿、黄、红、紫、橙)。
阳性对照DNA9947/9948，是扩增标准品，用来检验扩增体系质量好坏。在本发明优选方案中，阳性对照均可以得到正确分型，灵敏度高达0.03ng，远低于标准的0.125ng。本发明扩增的9947分形图见图1、 9948分型图见图2、9948/9948基因型见表3。
六色光谱校正试剂包含六条用六种荧光标记的DNA片段，用于对遗传分析仪进行光谱校正，从而适配本发明。
表3：9947/9948的基因分型
(2)引物混合物浓度的优化
引物混合物包含了27个基因座的引物对，为了使各个基因座扩增效率相当，均衡性指标达到《GB/T 37226-2018法庭科学人类荧光标记STR 复合扩增检测试剂质量基本要求》中所述标准(基因座内≥70％、同一颜色组内≥50％、不同颜色组间≥30)，对引物浓度进行了全面的优化，引物浓度见表1，扩增均衡性全面超越以上标准。
(3)反应预混液的优化
优化的反应预混液中包含热启动DNA聚合酶、dNTP、镁离子、钾离子、Tris缓冲液及增强剂等试剂，本发明的反应预混液具有快速、灵敏度高、适应性强等特点，并且反应预混液可以在-20℃条件下不结冰，可以有效的防止冻融对试剂性能的影响。本发明的反应预混液灵敏度高达0.03ngDNA，有效扩增时间降低到1.5小时以内，并且对不同来源(血液、血痕、精液、精斑、唾液、唾液斑、毛发、组织、指甲、体液等)的 DNA均具有优良的扩增效果，同时对特种血卡、唾液卡、FTA卡也有非常好的扩增效果。反应预混液配方可参见表4。
表4：本发明实施例的PCR反应预混液配方
对上表经换算后，PCR预混液包含了0.19-0.38U/ul的热启动Taq DNA聚合酶、100-200mM的Tris缓冲液、100-200mM的KCL、 3.75-7.5mM的MgCl2、50-100mM的(NH4)2SO4、0.5-1uM的dNTP、 1000-1500mM的甜菜碱、0.19％-0.38％的Triton、2-3mg/ml的BSA、 5％-15％的Tween、2.5％-7.5％的甘油、去离子水。
其中的H2O为去离子水，是高度去离子的水，电阻率达到 18.2MΩ，完全排除外来离子对扩增体系的干扰。
(4)PCR扩增程序的优化
根据标准的扩增体系，配制扩增体系(25ul扩增体系里加5ul引物混合物、10ulPCR预混液、7.5ul去离子水、2.5ul阳性对照DNA 9947、 9948)，配制25ul的扩增体系。按照优化好的扩增程序在ABI Proflex PCR仪上进行扩增，扩增程序如表5：
表5：本发明实施例的PCR扩增程序如下
(5)检测试剂中等位基因阶梯的优化
本发明的等位基因阶梯27A囊括了各个基因座绝常见的所有等位基因及绝大多数的稀有等位基因，更加方便基因分型结果的比对。
以下所选等位基因阶梯囊括了各个基因座最常见的所有等位基因及绝大多数的稀有等位基因，更加方便基因分型结果的比对。
表6：本发明较佳实施例的基因座所包含的等位基因
(6)检测试剂中分子量内标的优化
分子量内标BTY-500包含75、100、139、150、160、200、250、 300、340、400、450、490、500共13条DNA片段，可以有效的区分 75-500bp的DNA片段的大小。
(7)检测方法
使用本发明可同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，在PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500XL进行电泳检测。8.5μl HiDi甲酰胺+0.5μl分子量内标BTY-500+1μl PCR产物/1ul等位基因阶梯 27A；分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8kVolts，进样时间12sec，之后开始电泳。
电泳结束后，在GeneMapper_IDX软件上进行分析，阳性对照 9947、9948均能得到正确分型，见图1：9947分型图；图2：9948分型图；图3：等位基因阶梯图；图4：分子量内标BTY-500。
以下结合具体实施例对本发明可同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒的应用进行举例说明。
实施例1：本发明试剂盒在亲缘关系鉴定中的应用
对来自疑似父子的两份头发进行直接复合扩增，检测27个基因座。扩增方法采用直接扩增的方法:取一段带有毛囊的头发，直接放入扩增体系中，使毛囊完全浸入液体以内，扩增程序采用本发明标准扩增程序，扩增仪器采用ABI Proflex PCR仪，遗传分析仪采用3500xl遗传分析仪，分析软件采用GeneMapper-ID-X分析软件。本实施例操作步骤如下：
①用剪刀在头发毛囊上方0.5cm处剪短，将剪短的带有毛囊的头发放入200ulPCR管中。用于扩增的头发一定要有毛囊，如没有毛囊不可用，无法获得正确的分型。
②根据本发明的标准反应体系配制10ul扩增体系：2ul引物混合物、4ul反应预混液、4ul去离子水，加入带有剪好头发的PCR管中。在 ABI Proflex PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为：95℃5min； 94℃10sec、59℃40sec、72℃45sec、30循环；60℃30min；10℃恒温保存。本例中引物混合物中各引物的浓度和PCR预混液的配方参见前述优选浓度和预选配比。
③遗传分析仪检测并进行数据分析
PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500XL进行检测。8.5μl HiDi 甲酰胺+0.5μl分子量内标BTY-500+1μl PCR产物/1ul等位基因阶梯27A；分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8kVolts，进样时间12sec，之后开始电泳。
④电泳结束后在GeneMapper_IDX软件上进行分析，见图5：疑似子基因分形图；图6：疑似父基因分型图；疑似父、子基因分型结果见表7。
表7：疑似父子基因分型
| 基因座 | 疑似父基因型 | 疑似子基因型 |
| D3S1358 | 16/18 | 16/17 |
| TH01 | 6/7 | 6/7 |
| D21S11 | 30/33.2 | 30/31 |
| D18S51 | 13/14 | 14/17 |
| Penta E | 18/21 | 14/18 |
| Amelogenin | X/Y | X/Y |
| D5S818 | 10/11 | 11/12 |
| D13S317 | 8/12 | 12 |
| D7S820 | 11/12 | 10/12 |
| D16S539 | 11 | 9/11 |
| CSF1PO | 11 | 11 |
| D2S1338 | 18/25 | 18/20 |
| D6S1043 | 14/19 | 14/19 |
| D22S1045 | 15/16 | 16 |
| D19S433 | 13 | 13/15.2 |
| D1S1656 | 14/17.3 | 14/15 |
| DYS391 | 10 | 10 |
| D12S391 | 18/19 | 18/19 |
| D10S1248 | 15/16 | 12/15 |
| D2S441 | 10/11 | 11 |
| vWA | 17 | 17/18 |
| D8S1179 | 14/15 | 12/14 |
| TPOX | 8 | 8/9 |
| FGA | 21/22 | 22/23 |
| Y-INDEL | 1 | 1 |
| SE33 | 25.2/28.2 | 25.2 |
| Penta D | 9/10 | 10/11 |
利用本发明对获得的27个基因座的基因分型进行分析比对，可以发现疑似父子的27个基因座基因信息均符合遗传规律，可以判定为父子关系。
实施例2：本发明试剂盒在法医当中的应用
本发明在法医领域主要用于违法犯罪人员DNA数据库的建设及对违法犯罪嫌疑人身份的鉴定。
全国法医DNA数据库是我国公安部建设的全国违法犯罪人员DNA 数据库，如今数据库突破5000万数据，是公安系统案件侦破的主要工具。数据库通常采用血样直接扩增检测的方法建库，违法犯罪嫌疑人身份的鉴定工作中检材通常为复杂检材，采用提取DNA后进行扩增检测方法进行检测。本发明可以兼顾两种不同的检材，方便全国DNA数据库的建设及对违法犯罪嫌疑人身份的鉴定。操作的详细部分如下：
①已知违法犯罪人员检材通常为血卡，可以直接扩增。使用直径 1mm的打孔器，直接在干燥血卡上打取直径1mm血片，放入200ulPCR 管中。
②未知违法犯罪人员通常为案件现场检材，检材复杂，通常采用先提取DNA，后扩增的方法进行数据的检测分析。DNA通过Chelex-100 和磁珠法进行DNA的提取。(提取方法参照郑秀芬《法医DNA分析》第四章DNA提取)。
③反应体系的配制及扩增，参照本发明标准体系配制10ul反应体系，见下表8。在ABI Proflex PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为： 95℃5min；94℃10sec、59℃40sec、72℃45sec、30循环；60℃30min； 10℃恒定。
表8：本实施例的反应体系
④遗传分析仪检测并进行数据分析
PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500xl上进行检测。8.5μl HiDi 甲酰胺+0.5μl分子量内标BTY-500+1μl PCR产物/1ul等位基因阶梯27A；分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8kVolts，进样时间12sec，之后开始电泳。
电泳结束后在GeneMapper_IDX软件上进行分析，分析完成后将分析的数据导出CODIS格式文件，然后将导出的数据上传全国DNA数据库。图7为血卡检材分型图，图8为DNA提取检材分型图。
序列表
<110> 百特元生物科技（北京）有限公司
<120> 一种同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒及其应用
<130> 201901009
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (12)
1.一种同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含24个常染色体STR基因座、1个Y染色体STR基因座和2个性别鉴定STR基因座的特异性扩增引物对，所述基因座如下：
24个常染色体STR基因座分别是：D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，Penta E，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，D2S1338，D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，D12S391，D10S1248，D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA，SE33，Penta D；
1个Y染色体STR基因座DYS391；
2个性别鉴定基因座Y-INDEL和Amelogenin。
2.根据权利要求1所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，
所述27个基因座的特异性扩增引物对为：D3S1358：SEQ ID NO:1-2；TH01：SEQ ID NO:3-4；D21S11：SEQ ID NO:5-6；D18S51：SEQ ID NO:7-8；Penta E：SEQ ID NO:9-10；Amelogenin：SEQ ID NO:11-12；D5S818:SEQ ID NO:13-14；D13S317:SEQ ID NO:15-16；D7S820：SEQ ID NO:17-18；D16S539：SEQ ID NO:19-20；CSF1PO：SEQ ID NO:21-22；D2S1338：SEQ ID NO:23-24；D6S1043：SEQ ID NO:25-26；D22S1045：SEQ ID NO:27-28；D19S433：SEQ ID NO:29-30；D1S1656：SEQ ID NO:31-32；DYS391：SEQ ID NO:33-34；D12S391：SEQ ID NO:35-36；D10S1248：SEQ ID NO:37-38；D2S441：SEQ ID NO:39-40；vWA：SEQ ID NO:41-42；D8S1179：SEQ ID NO:43-44；TPOX：SEQ ID NO:45-46；FGA：SEQ ID NO:47-48；Y-INDEL：SEQ ID NO:49-50；SE33：SEQ ID NO:51-52；Penta D：SEQ ID NO:53-54。
3.根据权利要求2所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述27个基因座进行分组并且每个基因座的至少1个特异性扩增引物的5’端通过化学荧光染料进行标记。
4.根据权利要求2所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述27个基因座按照如下方式分组：
第一组：D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，Penta E；
第二组：Amelogenin，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，D2S1338；
第三组：D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，DYS391，D12S391，D10S1248；
第四组：D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA；
第五组：Y-INDEL，SE33，Penta D。
5.根据权利要求4所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述第一组到第五组分别采用不同的荧光染料标记，其中第一组采用FAM，代表蓝；第二组采用HEX，代表绿；第三组采用TAMAR，代表黄；第四组采用ROX，代表红；第五组采用PURPLE，代表紫；ORG代表橙色，用于内标。
6.根据权利要求2所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光标记扩增试剂盒由两部分组成，一部分为反应体系，包含引物混合物、反应预混液、阳性对照DNA 9947和去离子水，所述引物混合物是指所述27个基因座的特异性扩增引物对的混合物；另一部分为检测试剂，包含分子量内标和等位基因阶梯。
7.根据权利要求6所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述27个基因座的特异性扩增引物对的浓度如下：
SEQ ID NO:1-2为0.06-0.1μM，SEQ ID NO:3-4为0.07-0.11μM，
SEQ ID NO:5-6为0.1-0.15μM，SEQ ID NO:7-8为0.1-0.15μM，
SEQ ID NO:9-10为0.18-0.23μM，SEQ ID NO:11-12为0.1-0.15μM，
SEQ ID NO:13-14为0.08-0.13μM，SEQ ID NO:15-16为0.05-0.08μM，
SEQ ID NO:17-18为0.13-0.17μM，SEQ ID NO:19-20为0.11-0.15μM，
SEQ ID NO:21-22为0.1-0.15μM，SEQ ID NO:23-24为0.1-0.15μM，
SEQ ID NO:25-26为0.12-0.16μM，SEQ ID NO:27-28为0.2-0.25μM，
SEQ ID NO:29-30为0.13-0.18μM，SEQ ID NO:31-32为0.11-0.16μM，
SEQ ID NO:33-34为0.17-0.22μM，SEQ ID NO:35-36为0.2-0.25μM，
SEQ ID NO:37-38为0.3-0.4μM，SEQ ID NO:39-40为0.12-0.18μM，
SEQ ID NO:41-42为0.12-0.18μM，SEQ ID NO:43-44为0.2-0.25μM，
SEQ ID NO:45-46为0.22-0.28μM，SEQ ID NO:47-48为0.06-0.1μM，
SEQ ID NO:49-50为0.2-0.25μM，SEQ ID NO:51-52为0.06-0.1μM，
SEQ ID NO:53-54为0.2-0.3μM。
8.根据权利要求6所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述反应预混液的配方为：0.19-0.38U/ul的热启动Taq DNA聚合酶、100-200mM的Tris缓冲液、100-200mM的KCL、3.75-7.5mM的MgCl2、50-100mM的(NH4)2SO4、0.5-1uM的dNTP、1000-1500mM的甜菜碱、0.19％-0.38％的Triton、2-3mg/ml的BSA、5％-15％的Tween、2.5％-7.5％的甘油、去离子水。
9.根据权利要求6或7或8所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光标记扩增试剂盒的扩增程序为：
变性：95℃，5min，
扩增：94℃10s→59℃40s→72℃45s,30个循环；
终止延伸60℃，30min；
15℃低温保存。
10.根据权利要求6所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，对应各基因座的等位基因阶梯为：
在第一组中：D3S1358：12,13,14,15,16,17,18,19,20；TH01：5,8,9,10；D21S11：26,27,28,28.2,29,29.2,30,31,31.2,32.2,33,33.2,34,34.2,35.2,36.2,38；D18S51：8,9,10,11,12,13,14,16,17,18,19,20,21,23,24,25,26,27；Penta E：5,6,7,9,10,12,13,14,16,17,19,20,21,22,23,24,26；
在第二组中：Amelogenin：X，Y；D5S818：7,8,9,10,11,12,13,14,15；D13S317：7,8,9,10,11,12,13,14；D7S820：7,8,9.3,10,11,12,13,14,15；D16S539：5,6,8,9,10,12,13；CSF1PO：6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16；D2S1338：16,17,18,20,21,23,24,25,26；
在第三组中：D6S1043：9,10,11,13,14,15,16,17,18,19,20,21；
D22S1045：11,12,14,15,16,17,18；D19S433：9,10,11,11.2,13,14,15,16,17,18.2；D1S1656：10,11,12,13,14,15,16,17,18；DYS391：6,7,8,9,10,11,12,13；D12S391：15,16,17,20,21,23,24,25,26,27；D10S1248：10,11,12,13,14,15,16,17,18；
在第四组中：D2S441：8.1,9,10,11,12,13,14,15；vWA：12,13,14,15,16,17,18,19,20；D8S1179：7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17；
TPOX：6,7,8,9,10,11,12,13,14；FGA：16,17,18,19,20,21,23,24,25,26,27,29,30,31.2,43.2,44.2,45.2,46.2；
在第五组中：Y-INDEL：1,2；SE33：16,18,18.2,19,21,21.2,22.2,23.2,24.2,25.2,26.2,27.2,28.2,29.2,31.2,32.2；Penta D：5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。
11.根据权利要求6或7或8所述的荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，分子量内标为BTY-500，其包含75、100、139、150、160、200、250、300、340、400、450、490、500共13条DNA片段，可以有效的区分75-500bp的DNA片段的大小。
12.权利要求1-11中任意一项所述同时扩增人27个STR基因座的荧光标记扩增试剂盒在法医个体识别、法医DNA数据库建设、嫌疑人家系排查及司法亲缘关系鉴定中的应用。
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