CN115029450A - 一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系及其应用 - Google Patents

一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物基因检测技术领域，涉及一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系及其应用。本发明荧光复合扩增体系包含了30个常染色体基因座，一个性别识别以及一个辅助性别判断的Y染色体的Yindel。19个A类基因座、10个B类基因座加1个C类基因座的组合能够提供更多的遗传信息，从而提高个体的识别能力。本发明试剂盒不仅能够扩增常规各类提取样本，而且对新鲜和陈旧的血斑或唾液斑都可进行直接扩增，能够使用DNA检验技术来确认被拐卖妇女儿童身份，同时也适用于法医遗传学亲权鉴定及个体识别。

Description

一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系及其应用
技术领域
本发明属于生物基因检测技术领域，涉及一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系及其应用。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)，是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座，因个体间DNA片断长度或DNA序列差异而成高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传。常染色体STR基因座由于突变率低、稳定遗传及高度遗传多态性而广泛应用于法医学个体识别及亲权鉴定。1997年，美国正式确定了13个常染色体STR基因座为 CODIS核心STR基因座，同时建立了一系列的测试方法、评估标准和基础人员信息数据库。2009年4月，欧洲法庭科学研究机构(ENFSI)一致决定在已有的欧洲标准基因座(ESS)7个STR (D3S1358，D8S1179，D18S51，D21S11，FGA，TH01，vWA)基础上，增加了另外5个STR基因座(D1S1656，D2S441，D10S1248， D12S391，D22S1045)。
STR复合扩增荧光检测分型技术综合运用了多重复合扩增、毛细管电泳和荧光检测技术，已被广泛应用于各法医物证DNA 实验室，它具有快速、灵敏、准确、稳定、重复性好等特点，并且可以实现自动化。在我国初期STR试剂盒被国外所垄断，随着国内科研能力的提升，越来越多的自主研发的试剂盒面市。目前市场上国产灵敏度较高的常染色体试剂盒能够扩增提取样本，但是不能同时兼容直扩样本的扩增，因为直扩样本中会存在多种 PCR抑制剂。而在实际应用中，在公安机关中会留存有陈旧的直扩样本，需要重新扩增这些陈旧样本来获得比对的结果。因此需要性能更加优秀，鉴别力更强的试剂盒作为技术支撑。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种具有亲缘识别能力强和综合检测效能高的32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，包括32对扩增引物，分别用于同时扩增30个常染色体STR位点，1个C 类基因座D4S2366，1个Y-Indel位点；所述30个常染色体STR 位点分别为：Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、 D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、 D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E、 D12S391、D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、 D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435。
在上述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系中， 32对扩增引物包括如下所示的序列：
D3S1358上下游引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
TH01上下游引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
D21S11上下游引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
D18S51上下游引物序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；
Penta E上下游引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；
Y-indel上下游引物序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
D19S253上下游引物序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14 所示；
D12S391上下游引物序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16 所示；
D6S1043上下游引物序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18 所示；
D2S1338上下游引物序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20 所示；
D15S659上下游引物序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22 所示；
D6S477上下游引物序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；
Amelogenin上下游引物序列如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO. 26所示；
D5S818上下游引物序列如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28 所示；
D13S317上下游引物序列如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30 所示；
D7S820引物对序列为上下游引物序列如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示；
D19S433上下游引物序列如SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34 所示；
CSF1PO上下游引物序列如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36 所示；
Penta D上下游引物序列如SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38 所示；
D2S441上下游引物序列如SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40 所示；
VWA上下游引物序列如SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示；
D8S1179上下游引物序列如SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44 所示；
TPOX上下游引物序列如SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示；
FGA上下游引物序列如SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示；
D4S2366上下游引物序列如SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50 所示；
D3S3045上下游引物序列如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52 所示；
D16S539上下游引物序列如SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54 所示；
D22S1045上下游引物序列如SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56 所示；
D8S1132上下游引物序列如SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58 所示；
D1S1656上下游引物序列如SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60 所示；
D10S1248上下游引物序列如SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62 所示；
D10S1435上下游引物序列如SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64 所示。
作为优选，所述的引物对在扩增体积中的终浓度如下：
D3S1358 0.08μM；
TH01 0.06μM；
D21S11 0.21μM；
D18S51 0.1μM；
Penta E 0.32μM；
Y-indel 0.11μM；
D19S253 0.18μM；
D12S391 0.25μM；
D6S1043 0.1μM；
D2S1338 0.35μM；
D15S659 0.39μM；
D6S477 0.39μM；
Amelogenin 0.09μM；
D5S818 0.06μM；
D13S317 0.15μM；
D7S820 0.07μM；
D19S433 0.12μM；
CSF1PO 0.08μM；
Penta D 0.12μM；
D2S441 0.16μM；
VWA 0.1μM；
D8S1179 0.09μM；
TPOX 0.12μM；
FGA 0.13μM；
D4S2366 0.13μM；
D3S3045 0.33μM；
D16S539 0.12μM；
D22S1045 0.11μM；
D8S1132 0.18μM；
D1S1656 0.15μM；
D10S1248 0.08μM；
D10S1435 0.22μM。
在上述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系中，所述荧光复合扩增体系中的32对引物的5’端分别由5种不同的荧光素进行标记，相同的荧光素标记视为同一组，五组组合分别为：
第一组D3S1358、TH01、D21S11、D18S51和Penta E；
第二组Y-indel、D19S253、D12S391、D6S1043、D2S1338、 D15S659和D6S477；
第三组Amelogenin、D5S818、D13S317、D7S820、D19S433、 CSF1PO和Penta D；
第四组D2S441、VWA、D8S1179、TPOX、FGA和D4S2366；
第五组D3S3045、D16S539、D22S1045、D8S1132、D1S1656、 D10S1248和D10S1435。
作为优选，荧光素为蓝色荧光染料、绿色荧光染料、黄色荧光染料、红色荧光染料和紫色荧光染料中的任意一种。
在上述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系中，荧光素为FAM、HEX、TAMRA、ROX和AF549中的至少一种。
在上述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系中，还包括一组荧光分子量内标SIZE-500，所述分子量内标的片段大小为75、87、100、125、150、175、200、225、250、275、300、 325、350、375、400、425、450、475和500。
在上述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系中，分子量内标的荧光素标记采用AF633染料。
在上述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系中，还包括等位基因分型标准物Allelic Ladder。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述的荧光复合扩增体系。
本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：
S1、利用Chelex法、磁珠提取法和硅珠提取法提取的人基因组 DNA，或采用免提取的血斑采集卡和口腔细胞采集卡来获得扩增模版；
S2、对获取的DNA进行扩增；
S3、将试剂盒中的分子量内标和去离子甲酰胺混合配制成上样混合物，再将上样混合物和扩增产物或试剂盒中的32个基因座的等位基因分型标准物通过遗传分析仪进行电泳检测；
S4、对结果进行分析。
上述荧光复合扩增体系和试剂盒在查找被拐卖/失踪儿童信息系统中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明荧光复合扩增体系包含了30个常染色体基因座，一个性别识别以及一个辅助性别判断的Y染色体的Yindel。19个A类基因座、10个 B类基因座加1个C类基因座的组合能够提供更多的遗传信息，从而提高个体的识别能力。本发明试剂盒不仅能够扩增常规各类提取样本，而且对新鲜和陈旧的血斑或唾液斑都可进行直接扩增。本发明荧光复合扩增体系能够确认被拐卖妇女儿童身份，同时也适用于法医遗传学亲权鉴定及个体识别。
附图说明
图1为实施例1试剂盒0.25ng 9948标准品分型图；
图2为实施例1试剂盒等位基因分型标准物：Allelic Ladder 图；
图3为实施例1试剂盒博坤唾液卡扩增结果图；
图4为实施例1试剂盒Whatman FTA血卡样本扩增结果图；
图5为实施例1试剂盒毛发Chelex提取样本扩增结果图。
图6为实施例1试剂盒博坤自动提取样本扩增结果图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
本发明含有的基因座位点共32个，分别为Amelogenin、 D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、 D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、 TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E、D12S391、D1S1656、 D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、 D19S253、D6S477、D10S1435和Yindel。上述引物对的序列如表1所示：
表1：各基因座引物序列
Figure RE-GDA0003792226750000091
Figure RE-GDA0003792226750000101
应用荧光染料对每个引物对中至少一条引物的5’端进行标记。对上述的引物进行如下分组标记：
第一组采用蓝色荧光染料6-FAM进行标记：D3S1358、TH01、 D21 S11、D18S51和Penta E；
第二组采用绿色荧光染料HEX进行标记：Y-indel、D19S253、D12S391、D6S1043、D2S1338、D15S659和D6S477；
第三组采用黄色荧光TAMRA染料进行标记：Amelogenin、 D5S818、D13S317、D7S820、D19S433、CSF1PO和Penta D；
第四组采用红色荧光ROX染料进行标记：D2S441、VWA、 D8S1179、TPOX、FGA和D4S2366；
第五组采用紫色荧光AF549染料进行标记：D3S3045、 D16S539、D22S1045、D8S1132、D1S1656、D10S1248和D10S1435。
本发明其他一些实施方案中可采用蓝色荧光染6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA、红色荧光染料标记ROX、紫色荧光染料AF549中的任意一种对每组进行荧光染料标记，只需保证每组之间的染料都不相同即可。上述引物构成特异性扩增引物对。其中分子量内标为橙色荧光标记的SIZE-500。
引物浓度为：
D3S1358 0.08μM；
TH01 0.06μM；
D21S11 0.21μM；
D18S51 0.1μM；
Penta E 0.32μM；
Y-indel 0.11μM；
D19S253 0.18μM；
D12S391 0.25μM；
D6S1043 0.1μM；
D2S1338 0.35μM；
D15S659 0.39μM；
D6S477 0.39μM；
Amelogenin 0.09μM；
D5S818 0.06μM；
D13S317 0.15μM；
D7S820 0.07μM；
D19S433 0.12μM；
CSF1PO 0.08μM；
Penta D 0.12μM；
D2S441 0.16μM；
VWA 0.1μM；
D8S1179 0.09μM；
TPOX 0.12μM；
FGA 0.13μM；
D4S2366 0.13μM；
D3S3045 0.33μM；
D16S539 0.12μM；
D22S1045 0.11μM；
D8S1132 0.18μM；
D1S1656 0.15μM；
D10S1248 0.08μM；
D10S1435 0.22μM。
1、试剂盒操作步骤
1.1体系配置：将PCR反应液分别与特异性扩增引物对按照说明书比例进行反应体系的配置，涡旋混匀后，用离心机离心，然后用移液枪按体积进行分装。所述试剂盒在进行扩增时，25μL 的扩增反应体系如表2所示：
表2：扩增反应体系
Figure RE-GDA0003792226750000121
Figure RE-GDA0003792226750000131
1.2扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表3所示。
表3：扩增体系
Figure RE-GDA0003792226750000132
1.3扩增产物在遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将1μL 扩增产物混合或者等位基因分析标准Allelic Ladder与9μL上样混合物混合，离心去除气泡并尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2 kv，进样时间：15s。
1.4分析数据
应用GeneMapper ID-X(Lifetech公司，美国)软件进行结果分析
图1为试剂盒0.25ng 9948标准品分型图；从图中可知本试剂盒效率高，能满足日常不同浓度样本的扩增。
图2为等位基因分型标准物结果图；从图中可知本试剂盒的等位基因分型标准物包含了各个位点的常见等位基因分型，对因仪器和条件不同检测到的结果进行校正，保证了结果的准确性。
博坤唾液卡和Whatman FTA血卡是市场上使用较多的直接扩增的卡片，含有的抑制PCR扩增的组分含量相对较高，具有一定代表性。本试剂盒扩增博坤唾液卡和WhatmanFTA血卡，扩增结果如图3、4所示，从图中可知，对于这些放置时间较长的直扩样本扩增效率高，且有较好的均衡性，结果准确可靠，说明本试剂盒均有一定的抗抑制能力，可适用于多种不同类型直扩样本的扩增，对于陈旧的直扩样本也能有较好的实验结果。
实施例2：
检材为毛发和精液斑样本。
1、试剂盒操作步骤
1.1提取DNA：毛发样本按照法庭科学DNA实验室检验规范 GAT 383—2014(20140509)中聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法进行提取。毛根剪取毛发的毛根部分5mm～10mm，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入Chelex-100、蛋白酶K、DTT， 56℃消化至完全溶解。将溶解的样本放入恒温仪中95℃10min，离心后置4℃备用。精液斑样本按照博坤磁珠自动提取仪的使用说明进行样本的提取。
1.2体系配置：将PCR反应液分别与特异性扩增引物对按照说明书比例进行反应体系的配置，涡旋混匀后，用离心机离心，然后用移液枪按体积进行分装。所述试剂盒在进行扩增时，25μL 的扩增反应体系如表4所示：
表4：扩增体系
组分 体积
PCR反应液 12.5μL
特异性扩增引物对 6.25μL
人基因座DNA 2μL提取样本
无核酸水 补足至25μL
1.3扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表5所示。
表5：扩增程序
Figure RE-GDA0003792226750000151
1.4扩增产物在遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将 9μL上样混合物与1μL扩增产物混合，避免产生气泡，尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s。
1.5分析数据
应用GeneMapper ID-X(Lifetech公司，美国)软件进行结果分析
亲权鉴定中的检测样本还会包括精液(斑)、带毛囊毛发、羊水、组织块等样本。本试剂盒扩增提取样本结果如图5、6所示，从图中可知本试剂盒灵敏度能满足日常实验需求，可适用于多种不同类型的提取样本的扩增，实际应用面广。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
序列表
<110> 宁波海尔施基因科技股份有限公司
<120> 一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系及其应用
<141> 2022-06-23
<160> 64
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctcttatac tcatgaaatc aacagaggct 30
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatctgggtg acagagcaag acc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccacacag tcccctgtac 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaaataggg ggcaaaattc aaagg 25
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatgggactt ttctcagtct ccataaatat 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagagacag actaatagga ggtagatag 29
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agttcttgag cccagaaggt taa 23
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tactttaaaa ataacaaacc cgactacc 28
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggagtgca atggcgtgat 20
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccttagtttt actactggtc tactttggg 29
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taataatact gactgtcttt gagcaagaaa 30
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgagaagaga agtgagaagg catgtg 26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctgggaaat gtatttattt ctccagagta 30
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gattagatag atcatagaca gacagacgg 29
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctccagagag aaagaatcaa caggatc 27
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cttgcagatg gactgtcatg agatttttca 30
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccatgctact agattctgtg gttctcca 28
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcctttcata cagaatggca ctcttattca 30
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctcacccctt ttcctaccag aat 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggagtggag gtgcctaaag a 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tattttccat cctgtgcctc cc 22
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggcagtaatg gttagtggag aatatttaac 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
taaaactcta aggaggcaac aaaagattta 30
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagcagcagg actgtgagtt ctaa 24
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtttgcgtta acaatgccct g 21
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggaactgtaa aatcaggacc acttgaga 28
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caatcatagc cacagtttac aacatttg 28
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttcctctttg gtatccttat gtaatatttt 30
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gttcatttct ttagtgggca tccgtga 27
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcctccttca acttgggttg ag 22
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctcagaggga atatatattc ttaagaatta 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aggttaatat atataaaggg tatgatagaa 30
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtgttggtta catgaataag ttctttagc 29
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aggcatgttg gcacattcct gta 23
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctgagccttc tcagatacta tctcctg 27
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aataactgca tcttaaccta ttgggaggtc 30
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ttgagcctgg aaggtcgaag 20
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
attgatgtgt aagaattctt taatctggac 30
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcatctatga aaacttctat ctatct 26
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaattggagc taagtggctg tggtgt 26
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agatagagat aggacagatg ataaatac 28
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atgataagaa taatcagtat gtgacttgga 30
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ctttctgccc acacggcctg gcaact 26
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tatagtttca cgtagctata attagt 26
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcaggggagg aactgggaac cccaca 26
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tttcagggct gtgatcacta gcaccc 26
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctgcatatag tagacactca gtgcat 26
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgggattact aattgctatt aggaca 26
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcaaagtttc atcatgaaaa atgatg 26
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tgttagtaca aacttgctag aaaatt 26
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agaagcagag agaaagggag agatag 26
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
atctgcatgg gaaatcaata tcatct 26
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tgggtgagct gcttgccaag gagtgg 26
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gatttgtgca caacgagcat ctggca 26
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ccccgatgat agtagtctca ttatta 26
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ctcagctgta gaatggaaat agtgac 26
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccagggcaac aggagcaaaa ctctgt 26
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttagtggctt aatgtatttg tttttc 26
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caagccagga aagagagaaa ccatgtgatt 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gggtggtaga gatggaagaa aatccccata 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttctgtgcca agcacttgac atatatcatt 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tattataatt aacacttatt ctgacagttc 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acaaaatagg tgattctcac aaaaataaag 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ggtgggagaa tgacctgagc ctgggaggtc 30

Claims (10)

1.一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，其特征在于，包括32对扩增引物，分别用于同时扩增30个常染色体STR位点，1个C类基因座D4S2366，1个Y-Indel位点；所述30个常染色体STR位点分别为：Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、PentaD、Penta E、D12S391、D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435。
2.根据权利要求1所述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，其特征在于，32对扩增引物包括如下所示的序列：
D3S1358上下游引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
TH01上下游引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
D21S11上下游引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
D18S51上下游引物序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；
Penta E上下游引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示；
Y-indel上下游引物序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
D19S253上下游引物序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示；
D12S391上下游引物序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；
D6S1043上下游引物序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示；
D2S1338上下游引物序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示；
D15S659上下游引物序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；
D6S477上下游引物序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；
Amelogenin上下游引物序列如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示；
D5S818上下游引物序列如SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示；
D13S317上下游引物序列如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示；
D7S820引物对序列为上下游引物序列如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示；
D19S433上下游引物序列如SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34所示；
CSF1PO上下游引物序列如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示；
Penta D上下游引物序列如SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38所示；
D2S441上下游引物序列如SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40所示；
VWA上下游引物序列如SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示；
D8S1179上下游引物序列如SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示；
TPOX上下游引物序列如SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示；
FGA上下游引物序列如SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示；
D4S2366上下游引物序列如SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示；
D3S3045上下游引物序列如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示；
D16S539上下游引物序列如SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示；
D22S1045上下游引物序列如SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56所示；
D8S1132上下游引物序列如SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58所示；
D1S1656上下游引物序列如SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示；
D10S1248上下游引物序列如SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62所示；
D10S1435上下游引物序列如SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64所示。
3.根据权利要求1所述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，其特征在于，所述荧光复合扩增体系中的32对引物的5’端分别由5种不同的荧光素进行标记，相同的荧光素标记视为同一组，五组组合分别为：
第一组D3S1358、TH01、D21S11、D18S51和Penta E；
第二组Y-indel、D19S253、D12S391、D6S1043、D2S1338、D15S659和D6S477；
第三组Amelogenin、D5S818、D13S317、D7S820、D19S433、CSF1PO和Penta D；
第四组D2S441、VWA、D8S1179、TPOX、FGA和D4S2366；
第五组D3S3045、D16S539、D22S1045、D8S1132、D1S1656、D10S1248和D10S1435。
4.根据权利要求3所述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，其特征在于，荧光素为FAM、HEX、TAMRA、ROX和AF549中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，其特征在于，还包括一组荧光分子量内标SIZE-500，所述分子量内标的片段大小：75、87、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475和500。
6.根据权利要求5所述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，其特征在于，分子量内标的荧光素标记采用AF633染料。
7.根据权利要求1所述的一种32个短串联重复序列的荧光复合扩增体系，其特征在于，还包括等位基因分型标准物Allelic Ladder。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7所述的荧光复合扩增体系。
9.一种如权利要求8所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：
S1、利用Chelex法、磁珠提取法和硅珠提取法提取的人基因组DNA，或采用免提取的血斑采集卡和口腔细胞采集卡来获得扩增模版；
S2、对获取的DNA进行扩增；
S3、将试剂盒中的分子量内标和去离子甲酰胺混合配制成上样混合物，再将上样混合物和扩增产物或试剂盒中的32个基因座的等位基因分型标准物通过遗传分析仪进行电泳检测；
S4、对结果进行分析。
10.权利要求1-7所述的荧光复合扩增体系，或权利要求9所述的试剂盒在拐卖/失踪儿童信息系统中的应用。
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CN116083595A (zh) * 2022-09-30 2023-05-09 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及方法
CN116083595B (zh) * 2022-09-30 2023-11-14 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种含打拐基因座的33个短串联重复序列复合扩增检测试剂盒及方法

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