CN107557475B - 用于人的23个str位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种用于人的23个STR位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途，同时扩增23个基因座D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y‑indel和Y‑GATA‑H4，既能够满足中华民族遗传多态性又兼容国外核心位点，具有高多态性、高稳定性，信息量大、准确性高的特点，能够很好地用于个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析和/或构建人类DNA数据库中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人类基因组中具有多态性的遗传标记基因的检测技术，特别涉及用聚合酶链式反应在一个复合扩增系统中同时扩增23个基因座的系统、检测试剂盒及其用途。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是一类广泛存在于真核生物基因组中的分子遗传标记。其信息量大，约占整个基因组的10％。一般由2～6个碱基构成核心重复单元，核心单元重复次数在不同个体间存在差异，具有较高的多态性并遵循孟德尔遗传定律。此外，STR片段较小，约在70～500bp左右，易于扩增，适用于一些微量或降解检材。因此，基于STR的扩增检测技术被广泛应用于法医个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析及构建人类DNA数据库等。
目前，STR复合扩增因其包含信息量大、灵敏度高、检测速率快等优点已成为法医学个体识别、亲权鉴定及群体遗传分析的主要技术手段，被广泛应用于全球各地实验室的DNA分析鉴定，尤其在一些刑侦案件中，相关部门通过构建犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，并通过DNA数据的比对和排查就能够为一些特殊刑事案件的侦破提供有力证据，如一些连环案及串并案。
早期的STR复合扩增包含的位点太少，一般在10个STR位点左右，无法满足在个体识别和亲权鉴定中需要的遗传信息量。为此，国内外厂家纷纷增加位点数目，从而提高相关试剂盒的个体识别及非父排除率，如国外ABI公司的IdentifilerTM、SinofilerTM、GlobalFilerTM以及Promega公司的PowerPlex 16和PowerPlex 21；国内基点认知公司的Goldeneye 25A，阅微基因公司的MicroReaderTM 21D，中德美联公司的AGCU Expressmarker22，宁波海尔施基因科技有限公司的STRtyper-21G等。
然而，这些商用试剂盒大多都是在美国CODIS标准规定的13个核心位点(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX)的基础上增加其他位点，但13个核心位点是针对西方人群的，其中部分位点在中国人群中多态性低，如位点TPOX和TH01。其中，TPOX在中华民族中主要以8、9和11三个等位基因为主，其多态性远低于南非人群；TH01在中华民族中则主要以6、7和9三个等位基因为主。且TPOX和TH01两个位点的个体识别率(DP)、排除率(EP)、杂合度(He)以及多态信息量(PIC)等法医学参数也低于其他位点。另外，部分位点在中华民族群体中的突变率过高，如位点D18S51、CSF1PO、D8S1179、VWA和FGA5。这些位点在中华民族群体中易出现错误及丢峰的情况，突变率也高于其他位点。其中FGA的突变率为0.25％。因此，上述13个CODIS位点并不完全适合用于中华民族群体。
随着全球各种族的交流愈来愈频繁，STR复合扩增试剂盒在应用终端的应用越来越广泛，应用终端对试剂盒的信息量、兼容性、准确性及灵敏度要求越来越高。
因此，选取既满足中华民族遗传多态性又部分兼容国外核心位点的高多态性、高稳定性的合适位点，增加位点数目等对提高试剂盒的信息量、准确性及兼容性具有重要的意义。
发明内容
本发明提供一种用于人的23个STR位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途，满足中华民族遗传多态性又兼容国外核心位点，具有高多态性、高稳定性，信息量大、准确性高。
根据第一方面，一种实施例中提供一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，同时扩增如下23个基因座：D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y-indel和Y-GATA-H4。
进一步地，上述基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光素标记。
进一步地，上述复合扩增系统包括如下23对引物：
用于扩增D10S1248的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示；
用于扩增D5S818的上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示；
用于扩增D21S11的上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQ ID NO：6所示；
用于扩增D18S1364的上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ ID NO：8所示；
用于扩增D1S1656的上游引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO：10所示；
用于扩增D6S1043的上游引物如SEQ ID NO：11所示，下游引物如SEQ ID NO：12所示；
用于扩增D3S1358的上游引物如SEQ ID NO：13所示，下游引物如SEQ ID NO：14所示；
用于扩增D13S317的上游引物如SEQ ID NO：15所示，下游引物如SEQ ID NO：16所示；
用于扩增D7S820的上游引物如SEQ ID NO：17所示，下游引物如SEQ ID NO：18所示；
用于扩增D16S539的上游引物如SEQ ID NO：19所示，下游引物如SEQ ID NO：20所示；
用于扩增SE33的上游引物如SEQ ID NO：21所示，下游引物如SEQ ID NO：22所示；
用于扩增D19S433的上游引物如SEQ ID NO：23所示，下游引物如SEQ ID NO：24所示；
用于扩增D22S1045的上游引物如SEQ ID NO：25所示，下游引物如SEQ ID NO：26所示；
用于扩增Y-GATA-H4的上游引物如SEQ ID NO：27所示，下游引物如SEQ ID NO：28所示；
用于扩增D11S2368的上游引物如SEQ ID NO：29所示，下游引物如SEQ ID NO：30所示；
用于扩增Penta E的上游引物如SEQ ID NO：31所示，下游引物如SEQ ID NO：32所示；
用于扩增D2S441的上游引物如SEQ ID NO：33所示，下游引物如SEQ ID NO：34所示；
用于扩增D12S391的上游引物如SEQ ID NO：35所示，下游引物如SEQ ID NO：36所示；
用于扩增D2S1338的上游引物如SEQ ID NO：37所示，下游引物如SEQ ID NO：38所示；
用于扩增D13S325的上游引物如SEQ ID NO：39所示，下游引物如SEQ ID NO：40所示；
用于扩增Penta D的上游引物如SEQ ID NO：41所示，下游引物如SEQ ID NO：42所示；
用于扩增Y-indel的上游引物如SEQ ID NO：43所示，下游引物如SEQ ID NO：44所示；
用于扩增AMEL的上游引物如SEQ ID NO：45所示，下游引物如SEQ ID NO：46所示。
进一步地，上述基因座分为下述四种组合：第一组包含D10S1248、D5S818、D21S11、D18S1364、D1S1656和D6S1043；第二组包含AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和SE33；第三组包含Y-indel、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、D11S2368和Penta E；第四组包含D2S441、D12S391、D2S1338、D13S325和Penta D；上述四种组合的引物分别由四种不同的荧光素标记。
进一步地，上述四种不同的荧光素分别是蓝色、绿色、黄色和红色荧光素，上述蓝色荧光素是6’-FAM(6’-羧基荧光素)，上述绿色荧光素是HEX(六氯-6-甲基荧光素)，上述黄色荧光素是TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)，上述红色荧光素是ROX(羧基-X-罗丹明)。
进一步地，在一个复合扩增反应体系中同时扩增上述23个基因座；上述复合扩增反应体系中，用于扩增如下23个基因座D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y-indel和Y-GATA-H4的引物的终浓度依次分别是：0.67μM、1.36μM、1.21μM、0.60μM、0.86μM、0.71μM、1.31μM、0.81μM、1.30μM、2.14μM、1.14μM、1.42μM、1.26μM、0.90μM、2.53μM、1.47μM、1.30μM、0.63μM、1.30μM、0.54μM、2.23μM、0.97μM、0.55μM。
根据第二方面，一种实施例中提供一种同时分析DNA样品中多个STR基因座的方法，该方法采用第一方面的复合扩增系统检测DNA。
根据第三方面，一种实施例中提供一组用于第一方面的复合扩增系统的引物，包括SEQID NO：1至SEQ ID NO：46所示的23对引物。
根据第四方面，一种实施例中提供一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，其中基因座为如下23个基因座D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y-indel和Y-GATA-H4，上述试剂盒包含第三方面的23对引物。
根据第五方面，一种实施例中提供一种第一方面的复合扩增系统、第三方面的引物或第四方面的试剂盒在个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析和/或构建人类DNA数据库中的用途。
本发明的23个STR位点的复合扩增系统、引物及其试剂盒，既能够满足中华民族遗传多态性又兼容国外核心位点，具有高多态性、高稳定性，信息量大、准确性高的特点，能够很好地用于个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析和/或构建人类DNA数据库中。
附图说明
图1为本发明实施例中23个基因座在基因组上的分布示意图；
图2为本发明实施例2中本发明的试剂盒对样本1的分型图谱；
图3为本发明实施例2中HGT 21G试剂盒对样本1的分型图谱；
图4为本发明实施例3中本发明的试剂盒对样本A的分型图谱；
图5为本发明实施例3中阅微基因公司的试剂盒对样本A的分型图谱；
图6为本发明实施例3中本发明的试剂盒对样本B的分型图谱；
图7为本发明实施例3中阅微基因公司的试剂盒对样本B的分型图谱；
图8为本发明实施例3中本发明的试剂盒对样本C的分型图谱；
图9为本发明实施例3中阅微基因公司的试剂盒对样本C的分型图谱；
图10为本发明实施例4中本发明的试剂盒对样本3的分型图谱；
图11为本发明实施例4中Global Filer试剂盒对样本3的分型图谱；
图12为本发明实施例4中HGT 21G试剂盒对样本3的分型图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
为使本发明在适合中华民族群体的前提下也适合欧美人群，从而提高本发明的全球兼容性。本发明删除了旧CODIS位点中多态性差和突变率高的位点，同时增加新CODIS位点中适合中华民族群体的多态性高、稳定性相对较好的位点，建立复合扩增系统和对应的等位基因阶梯(ladder)，以及使用该系统进行个体识别和亲权鉴定的应用。
本发明一个实施例基于上述要求，建立了一种同时检测23个基因座的复合扩增系统，其中包含13个既适合中华民族群体也适合美国人群的新CODIS位点，7个既适合中华民族群体又适合欧洲人群的位点及额外的2个性别鉴定位点Y-indel和Y-GATA-H4，以及AMEL用于性别鉴定。本发明的23个STR基因座具体为：D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y-indel和Y-GATA-H4。这23个基因座在基因组上的分布如图1所示。
本发明的复合扩增系统具体可以包括复合扩增体系，这样的复合扩增体系可以包含引物混合物、反应缓冲液、DNA模板和热启动Taq DNA聚合酶等。
首先针对上述23个STR基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用PrimerPrimier5和Oligo7软件，每条引物退火温度在60℃左右，不能产生引物二聚体或者错配引起的其它非特异性产物，扩增产物长度在90-450bp之间。并用Blast对每对引物进行比对，保证序列的特异性。对每对引物进行PCR扩增测试，琼脂糖凝胶电泳检测并反复优化，直至得到清晰单一扩增条带。本发明得到了一组优化的引物序列，见下表1。
表1 复合扩增各基因座的引物序列
根据扩增产物片段大小分为四组，第一组：D10S1248、D5S818、D21S11、D18S1364、D1S1656和D6S1043；第二组：AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和SE33；第三组：Y-indel、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、D11S2368和Penta E；第四组：D2S441、D12S391、D2S1338、D13S325和Penta D，并采用四种不同荧光标记：6’-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、4-甲基-6-羧基-罗丹明(TAMRA)及羧基-X-罗丹明(ROX)分别对四组引物进行标记，标记在引物的5’端，同组引物采用同一荧光进行标记。其中，FAM为蓝色荧光素，HEX为绿色荧光素，TAMRA为黄色荧光素，ROX为红色荧光素。
每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，相邻两个基因座不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验，确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。
最后将4组23个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述23个基因座复合扩增。
本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：10mM DMSO，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl2，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP混合物。dNTP混合物是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
本发明中DNA模板是从人类的血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等中提取的DNA，提取方法为各种常规法，例如，磁珠法、树脂纯化法，酚氯仿法等。DNA模板量优选在0.05至5ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些位点检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。
本发明所需Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以。本发明的每个扩增体系(25μL)需要1U至2U的Taq DNA聚合酶。
扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)采用以下的温度循环条件可以得到较好的结果：91℃预变性1分钟；95℃变性3秒钟，58℃退火1分钟，70℃延伸20秒钟，该步骤重复28个循环；60℃继续延伸30分钟；4℃～12℃保存。
本发明采用荧光标记引物，在上述复合扩增体系按上述程序进行扩增后得到带有荧光标记的各位点扩增产物混合物，该荧光标记物在激光激发下可发出被遗传分析仪(ABI3130、3100、3500等)识别的光信号，因此上述扩增产物可通过遗传分析仪进行检测分析。
在利用遗传分析仪进行检测时复合扩增产物需要与甲酰胺、分子量内标按一定的比例进行混合变性后再进行毛细管电泳分离，其中分子量内标为荧光标记的多条已知片段大小的DNA片段混合物，以其为参照可计算复合扩增产物的片段大小并与等位基因阶梯进行比对，从而分析判断被检样本各位点的基因型。
电泳后的数据可以在GeneMapperIDx、GeneMarker等数据分析软件上分析得到STR基因分型图谱和数据。
下面通过具体案例的方式进一步说明本发明。下面的案例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。
实施例1
利用本发明23个STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒对一个二联体(父子)及三联体(父母女)家系血液样本(该样本已由海尔施HGT 21G试剂盒鉴定确证亲缘关系)进行检测。
家系血液样本由志愿者捐献，DNA采用chelex-100法提取(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，Humana Press，1998)，取3μL加抗凝剂的血液于1.5ml离心管中，振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μL 5％的chelex-100，振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟，煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟，小心吸出约150μL上清，转移至新的1.5ml离心管中。利用本发明的试剂盒及海尔施的HGT21G试剂盒同时对上述家系样本进行检测分析。
1.1 引物混合物配制
1)将引物干粉中加入定量灭菌超纯水，配成100μM母液；
2)将23个位点的46条引物按表1中终浓度要求混合，同一位点的正反向引物等量加入。
1.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增体系如下：
缓冲体系中包括：10mM DMSO，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mMMgCl2，0.1mg/ml BSA和各0.2mM的dNTP混合物；本实施例提取的DNA 5ng；Taq DNA聚合酶1U/25μL体系；本发明的46条引物按规定的终浓度。
按照表2的PCR热循环条件进行PCR扩增
表2 复合扩增热循环条件
1.3扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测，上述二联体家系的分型结果如表3所示。
表3 本发明的试剂盒对二联体家系的亲子鉴定检测结果
表3的分型结果表明父子之间无矛盾基因，本发明的试剂盒与海尔施HGT 21G试剂盒有14个相同位点，且分型结果完全一致，HGT 21G分型结果如表4。但与HGT 21G相较本发明的试剂盒CPI更高，具有更好的个体识别能力。
表4 HGT 21G对二联体家系的亲子鉴定检测结果
本发明的试剂盒及海尔施HGT 21G对三联体家系的分型结果分别如表5和表6。
表5 本发明的试剂盒对三联体家系的分型结果
表6 HGT 21G对三联体家系的分型结果
注*表中符号“/”表示该位点未出峰，无值。
表5的分型结果中父母女之间无矛盾基因，与HGT 21G试剂盒分型结果(表6)中相同位点比较也没有矛盾位点，HGT 21G试剂盒CPI为1.458182×1012，而本发明的试剂盒高达2.554609×1012，说明本发明的试剂盒在鉴定时具有更好的个体识别能力。
实施例2
对血液样本1进行复合扩增与分型，其中血液样本1由志愿者捐献，且使用现有的HGT 21G试剂盒无法对血液样本1的D1S1656的相邻等位基因进行正确分型。
DNA采用chelex-100法提取(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，HumanaPress，1998)，利用本发明的试剂盒与海尔施基因科技有限公司的HGT 21G试剂盒同时对该样本进行扩增检测。扩增反应在G1000热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用Gene
IDx软件。所用的试剂和材料如甲酰胺、内标等均为本领域技术人员常用的常规材料。
2.1 Chelex-100法提取DNA
2.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增
同实施例1。
2.3 扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测，最后利用Gene
IDx软件分析实验数据，本发明的试剂盒与宁波海尔施基因科技有限公司HGT21G对该样本的分型结果分别如表7与表8，具体分型图谱如图2和图3。
表7 本发明的试剂盒对样本1的分型结果
表8 HGT 21G试剂盒对样本1的分型结果
| 位点名称 | 分型结果 |
| D3S1358 | 16，17 |
| TH01 | 7，9 |
| D21S11 | 30，30 |
| D18S51 | 13，15 |
| Penta E | 15，16 |
| D5S818 | 9，11 |
| D13S317 | 8，11 |
| D7S820 | 9，11 |
| D16S539 | 11，11 |
| CSF1PO | 10，12 |
| Penta D | 9，12 |
| AMEL | X，X |
| vWA | 17，19 |
| D8S1179 | 14，14 |
| TPOX | 8，11 |
| FGA | 23，24 |
| D19S433 | 13，14 |
| D12S391 | 19，21 |
| D6S1043 | 10，18 |
| D2S1338 | 19，19 |
| D1S1656 | 15.3，15.3 |
本发明的试剂盒与海尔施基因科技有限公司HGT 21G有14个相同位点且对该样本1有13个位点分型结果一致，但对位点D1S1656海尔施HGT 21G分型结果为15.3和15.3，本发明的试剂盒分型结果为15.3和16，海尔施无法分辨位点D1S1656的两个相差1bp的相邻等位基因。因此，相较之下本发明的试剂盒具有更高的辨识度。
实施例3
对血液样本2(包含样本A、样本B、样本C)的3个位点进行复合扩增与分型。血液样本2由志愿者捐献，并且各血液样本2均含有常见微变异等位基因，使用现有的阅微基因公司的MR23sp试剂盒无法对该微变异等位基因进行正确分型。
DNA采用chelex-100法提取(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，HumanaPress，1998)，利用本发明的试剂盒、阅微基因公司的试剂盒MR23sp同时扩增上述样本2，扩增反应在G1000热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapperIDx软件。所用的试剂和材料诸如甲酰胺、内标等均为本领域技术人员常用的常规材料。
3.1 chelex100法提取DNA
3.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增
同实施例1。
3.3 扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测，电泳结果用GeneMapperIDx软件进行分析，本发明的试剂盒及阅微基因公司的试剂盒对这些样本的分型结果分别如表9和表10，具体分型结果如图4至图9所示，其中图4和图5分别为本发明的试剂盒与阅微基因公司的试剂盒对样本A的分型图，图6和图7分别为本发明的试剂盒与阅微基因公司的试剂盒对样本B的分型图，图8和图9分别为本发明的试剂盒与阅微基因公司的试剂盒对样本C的分型图。
表9 本发明的试剂盒对样本2的分型结果
表10 阅微基因MR23sp对样本2的分型结果
注*表中符号“OL”表示相应位点下的有未识别的峰。
本发明的试剂盒与阅微基因公司的MR23sp试剂盒有7个相同的位点，通过上述样本2对这2个试剂盒的分型结果进行比对，结果表明，除了含有微变异等位基因的位点D13S325分型结果不一致外，其他6个位点的分型结果相同。阅微基因公司的MR23sp试剂盒无法对位点D13S325的等位基因12.1及5.1进行正确分型，且等位基因5.1在分析过程中进入相邻位点D21S1270，从而导致21号染色体上3体综合症的误判。而本发明的试剂盒对此能进行正确的分型。
实施例4
血液样本3(由性别决定位点AMEL缺陷导致的男性Y缺失)的23个位点的复合扩增及其分型。
血液由志愿者捐献，DNA采用chelex-100法提取(具体方法参考《Forensic DNAProtocol》，Humana Press，1998)。分别利用本发明的试剂盒、Life科技公司的GlobelFilerTM及海尔施的HGT 21G同时对该样本进行扩增检测。扩增反应在G1000热循环仪上进行，电泳及检测在ABI3500遗传分析仪上进行，数据分析采用Gene
IDx软件。所用的试剂和材料诸如甲酰胺、内标等均为本领域技术人员常用的常规材料。
4.1 chelex-100法提取DNA
4.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增
同实施例1。
4.3 扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测,电泳结果用Gene
IDx软件进行分析，本发明的试剂盒、Life科技公司的Global Filer试剂盒及海尔施HGT 21G试剂盒对该样本3的分型结果分别如表11至表13所示，图谱具体分别如图10至图12所示。
表11 本发明的试剂盒对样本3的分型结果
表12 Global Filer试剂盒对样本3的分型结果
| 位点名称 | 分型结果 |
| D3S1358 | 16，16 |
| vWA | 16，18 |
| D16S539 | 11，12 |
| CSF1PO | 10，10 |
| TPOX | 8，11 |
| Y-indel | 2 |
| AMEL | X |
| D8S1179 | 10，13 |
| D21S11 | 29，31 |
| D18S51 | 13，16 |
| DYS391 | 10 |
| D2S441 | 9.1，14 |
| D19S433 | 13，13 |
| TH01 | 7，9 |
| FGA | 21，25 |
| D22S1045 | 16，16 |
| D5S818 | 9，9 |
| D13S317 | 9，11 |
| D7S820 | 9，11 |
| SE33 | 22.2，28.2 |
| D10S1248 | 15，17 |
| D1S1656 | 15，16 |
| D12S391 | 19，20 |
| D2S1338 | 20，22 |
表13 HGT 21G试剂盒对样本3的分型结果
上述表11至表13的结果显示，三个试剂盒对该样本相同位点的分型结果一致，但对该样本3的性别鉴定，本发明的试剂盒鉴定结果为男性，与Life科技公司的Global Filer试剂盒一致。而海尔施HGT 21G试剂盒无法给予准确的性别鉴定结果，容易误判为女性。曾有研究报道表明在7000名男性中就有6例AMEL位点Y缺失个体，在实际案例中如果仅利用AMEL位点进行性别鉴定容易造成性别误判。而海尔施的试剂盒HGT 21G就只利用了AMEL位点进行性别鉴定，这不仅容易造成性别误判，在一些刑侦事件中容易造成误导。为此，本发明的试剂盒增加位点Y-indel与Y-GATA-H4一起辅助AMEL共同用于性别鉴定，使鉴定结果更准确。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大法医科技有限公司
<120> 用于人的23个STR位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途
<130> 17I24181
<160> 46
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagtgagtta atgaattgaa caaat 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcttcatgc aactctggtt gtatt 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgtgtatccg tgattttcct ctttg 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgtgattcc ctttttagcc aag 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ataccaagtg tgagtcaatt cc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtaagattag tcaatgttct cc 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttacacttga gtctcaccag ggc 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcgcagacat aaagyctgca cc 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccaggtcagc ctgtgttgct c 21
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcggacggca tttcagagat tatgt 25
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctaatagtgt gccagagaga tagaagc 27
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gctacagctg ttctctttct tctgg 25
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgacagtatg attcccccac tg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgcaagcctg aaatcaacag ag 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atcaactgta cagaagtctg g 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gttggcagcc caaaaagaca ga 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcaccatgtt ggtcaggctg a 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacatttatc ctcattgaca ga 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acagagtgat tccattttta tacc 24
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtgccagatg ctcgttgtgc a 21
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctactagtaa ctctccccta ccgc 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggtgcacgtc tgtaattcca gctc 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
agcctgggca acagaataag a 21
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acccattacc cgaataaaaa tctt 24
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cacgtaaccc tatagaccct gg 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gttgagtgta aagtgctctc 20
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gtcaagccag gaatcatcat taaaatg 27
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gatagtattt tacatagccc ac 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gtactaacat gtatacgtcc ta 22
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aggcttgcac tagtggttat ctattc 26
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
agatgttatt gccgatgcag 20
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cgttactctc gattgataca tggaaaga 28
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgtcgttaaa ttggagctaa gtg 23
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cataagtctg tgagccagga 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tataacgtac aggatcaatg g 21
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gggactgtca tgagattttt cagc 24
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
aatcaacaga gacttcatgg tcctg 25
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ctattaaagg aatgagttat tcagtaag 28
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gccacttcag tcaccgcact gtgactag 28
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gaattcgaac tgtatagata ggccatgc 28
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gtaagtggcg aaggtcgaag ctg 23
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
agaaacacga attctttaat ctgg 24
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ctcaacatag tacacaaatc aactc 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gccttgtggc tgataccttt gtttc 25
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tatttaccct gggctctgta aag 23
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gacgaattca gagcttaaac tg 22
Claims (9)
1.一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于，所述复合扩增系统同时扩增如下23个基因座：D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y-indel和Y-GATA-H4；
所述复合扩增系统包括如下23对引物：
用于扩增D10S1248的上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示；
用于扩增D5S818的上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示；
用于扩增D21S11的上游引物如SEQ ID NO：5所示，下游引物如SEQ ID NO：6所示；
用于扩增D18S1364的上游引物如SEQ ID NO：7所示，下游引物如SEQ ID NO：8所示；
用于扩增D1S1656的上游引物如SEQ ID NO：9所示，下游引物如SEQ ID NO：10所示；
用于扩增D6S1043的上游引物如SEQ ID NO：11所示，下游引物如SEQ ID NO：12所示；
用于扩增D3S1358的上游引物如SEQ ID NO：13所示，下游引物如SEQ ID NO：14所示；
用于扩增D13S317的上游引物如SEQ ID NO：15所示，下游引物如SEQ ID NO：16所示；
用于扩增D7S820的上游引物如SEQ ID NO：17所示，下游引物如SEQ ID NO：18所示；
用于扩增D16S539的上游引物如SEQ ID NO：19所示，下游引物如SEQ ID NO：20所示；
用于扩增SE33的上游引物如SEQ ID NO：21所示，下游引物如SEQ ID NO：22所示；
用于扩增D19S433的上游引物如SEQ ID NO：23所示，下游引物如SEQ ID NO：24所示；
用于扩增D22S1045的上游引物如SEQ ID NO：25所示，下游引物如SEQ ID NO：26所示；
用于扩增Y-GATA-H4的上游引物如SEQ ID NO：27所示，下游引物如SEQ ID NO：28所示；
用于扩增D11S2368的上游引物如SEQ ID NO：29所示，下游引物如SEQ ID NO：30所示；
用于扩增Penta E的上游引物如SEQ ID NO：31所示，下游引物如SEQ ID NO：32所示；
用于扩增D2S441的上游引物如SEQ ID NO：33所示，下游引物如SEQ ID NO：34所示；
用于扩增D12S391的上游引物如SEQ ID NO：35所示，下游引物如SEQ ID NO：36所示；
用于扩增D2S1338的上游引物如SEQ ID NO：37所示，下游引物如SEQ ID NO：38所示；
用于扩增D13S325的上游引物如SEQ ID NO：39所示，下游引物如SEQ ID NO：40所示；
用于扩增Penta D的上游引物如SEQ ID NO：41所示，下游引物如SEQ ID NO：42所示；
用于扩增Y-indel的上游引物如SEQ ID NO：43所示，下游引物如SEQ ID NO：44所示；
用于扩增AMEL的上游引物如SEQ ID NO：45所示，下游引物如SEQ ID NO：46所示。
2.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，所述基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光素标记。
3.根据权利要求1或2所述的复合扩增系统，其特征在于，所述基因座分为下述四种组合：第一组包含D10S1248、D5S818、D21S11、D18S1364、D1S1656和D6S1043；第二组包含AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和SE33；第三组包含Y-indel、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、D11S2368和Penta E；第四组包含D2S441、D12S391、D2S1338、D13S325和Penta D；所述四种组合的引物分别由四种不同的荧光素标记。
4.根据权利要求3所述的复合扩增系统，其特征在于，所述四种不同的荧光素分别是蓝色、绿色、黄色和红色荧光素，所述蓝色荧光素是6’-FAM(6’-羧基荧光素)，所述绿色荧光素是HEX(六氯-6-甲基荧光素)，所述黄色荧光素是TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)，所述红色荧光素是ROX(羧基-X-罗丹明)。
5.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，所述复合扩增系统包括复合扩增反应体系，在所述复合扩增反应体系中同时扩增所述23个基因座；
所述复合扩增反应体系中，用于扩增如下23个基因座D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y-indel和Y-GATA-H4的引物的终浓度依次分别是：0.67μM、1.36μM、1.21μM、0.60μM、0.86μM、0.71μM、1.31μM、0.81μM、1.30μM、2.14μM、1.14μM、1.42μM、1.26μM、0.90μM、2.53μM、1.47μM、1.30μM、0.63μM、1.30μM、0.54μM、2.23μM、0.97μM、0.55μM。
6.一种同时分析DNA样品中多个STR基因座的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1-5任一项所述的复合扩增系统检测DNA。
7.一组用于权利要求1-5任一项所述的复合扩增系统的引物，其特征在于，所述引物包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：46所示的23对引物。
8.一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，其特征在于，所述基因座为如下23个基因座D10S1248、D5S818、D21S11、D1S1656、AMEL、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D19S433、D22S1045、D2S441、D12S391、D2S1338、D18S1364、SE33、Penta D、D11S2368、D13S325、D6S1043、Penta E、Y-indel和Y-GATA-H4，所述试剂盒包含权利要求7所述的引物。
9.权利要求1-5任一项所述的复合扩增系统、权利要求7所述的引物或权利要求8所述的试剂盒在个体识别、亲权鉴定、群体遗传学分析和/或构建人类DNA数据库中的用途。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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