CN110343757A - 一种短串联重复序列通用探针及其设计方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种用于同时检测基因组多个位点的通用探针和引物设计方法及其应用试剂盒。所述通用探针采用短串联重复序列作为骨架序列，解决了拷贝数浓度放大的反应体系内探针数量过多，易于形成非特异性扩增及合成成本高昂的问题。通过在待测染色体单拷贝基因片段通用探针位置的两侧设计多对引物，实现了染色体拷贝数浓度的等比例放大，尤其适用于某些极低浓度样品的检测(例如无创检测染色体拷贝数是否发生变异)。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种短串联重复序列通用探针及其设计方法和应用。
背景技术
20世纪80年代后期，Marshfield医学研究基金会的James和俄勒冈健康科学大学的Wis等人分离出来一种比小卫星DNA具有更短重复单元的卫星DNA，被称作微卫星DNA(Microsatellite DNA)、短串联重复(Short Tandem Repeats,STRs)或简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSRs)，每个重复单元长度在1～6bp之间。STR符合孟德尔遗传模式，共显性表达，广泛分布于真核生物的基因组中。按照重复基序可以分为3种类型：单一型(如(AC)n)、复合型(如(AC)m (AG)n)和间断型(如(AC)m T(AG)n)。按照重复的碱基数，又可以分为单碱基重复(如(A)n)，双碱基重复(如(AC)n)，三碱基重复(如(ATC) n)，多碱基重复(如((ATCT)n、(ACATG)n、(ATGATG)n等)。
无创产前基因检测(NIPT)是利用新一代高通量测序(NGS)检测胎儿染色体异常的检测技术。通过采集孕妇外周血，对母体外周血中的游离DNA片段 (包括胎儿游离DNA)进行测序，结合生物信息分析，计算胎儿患染色体非整倍体的风险。该技术比传统的血清学筛查更准确，比容易造成流产的羊水穿刺更安全。然而，基于NGS的无创产前检测技术存在着检测周期长、技术门槛高、检测费用高等不足，阻碍了其成为普查项目。
数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。其核心是基于泊松分布的原理，将核酸样品分散到几万个微孔的芯片中或者包被于液滴中，分散成纳升级的扩增体系，通过大规模单分子扩增实现拷贝数的绝对定量。该技术避免了传统荧光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)的相对定量步骤，直接获知目标核酸分子的拷贝数浓度，提高了检测灵敏度和准确度。数字PCR技术用于无创产前基因检测，单一位点的拷贝数很低，难以达到最佳的检测范围，因此需要进行多个位点检测后取总拷贝数进行分析。目前的数字PCR探针设计需要考虑碱基序列的因素，比较复杂而且成本高昂。因此，急需发明一种新型的可应用于无创检测染色体拷贝数是否发生变异的数字PCR通用探针。
发明内容
本发明公开了一种新型的用于数字PCR的通用探针，具有设计简单、制备成本低等优点。具体技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种用于数字PCR的探针，所述探针的序列采用短串联重复序列作为骨架序列，所述短串联重复序列按照重复基序区分，包括单一型(用结构式(X)n表示)、复合型(用结构式(X)n(Y)m表示)和间断型 (用结构式(X)n Z(Y)m表示)，其中X为A、C、G、T四种碱基中的一种或 2-6个碱基组合，Y为A、C、G、T四种碱基中不同于X的一种或2-6个碱基组合， Z为A、C、G、T四种碱基中不同于X和Y的一种或多个碱基的组合，n和m为重复的单元数。
优选的，所述探针的长度为8-40bp；探针的5’端标记荧光报告基团，探针的 3’端标记荧光淬灭基团。
更优选的，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX或CY5，所述荧光淬灭基团为MGB。
应当理解，本发明的荧光报告基团并不限于FAM、VIC、ROX或CY5，本发明的荧光淬灭基团并不限于MGB，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的荧光报告基团和荧光淬灭基团来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
所述探针序列可优先但不限于表1中序列中的一种或任意组合。
表1
更优选的，所述探针1、探针2、探针3和探针4的荧光报告基团分别为FAM、 VIC、CY5和CY5。
本发明第二个方面公开了一种可同时检测基因组多个位点的试剂盒，所述试剂盒包括上述的探针。
优选的，所述试剂盒还包括引物组和PCR反应液。
优选的，所述引物组的序列设计于短串联重复序列的上下游，引物组长度为 12-40bp，GC含量为30-80％。更优选的，扩增子长度为70-200bp。
优选的，所述引物组的核苷酸序列分别如SEQ NO：5和SEQ NO：6，或SEQ NO：7和SEQNO：8，或SEQ NO：9和SEQ NO：10，或SEQ NO：11和SEQ NO： 12，或SEQ NO：13和SEQ NO：14，或SEQ NO：15和SEQ NO：16所示。
具体的，所述探针1对应的引物组的核苷酸序列分别如SEQ NO：5和SEQ NO：6所示；所述探针2对应的引物组的核苷酸序列分别如SEQ NO：7和SEQ NO： 8，或SEQ NO：15和SEQNO：16所示；所述探针3对应的引物组的核苷酸序列分别如SEQ NO：9和SEQ NO：10，或SEQNO：11和SEQ NO：12，或SEQ NO： 13和SEQ NO：14所示；所述探针4对应的引物组的核苷酸序列分别如SEQ NO： 5和SEQ NO：6，或SEQ NO：15和SEQ NO：16所示。上述引物组的核苷酸序列见表2。
表2
| 序号 | 引物序列 |
| 1 | CGCTTGCTGTTGTCTGG(SEQ NO：5) |
| 2 | CATTTAATCCTGTTAGCAGCCCA(SEQ NO：6) |
| 3 | CGGAAAGGTAACCCAGGTAAA(SEQ NO：7) |
| 4 | ATTACTCTTAACTTTTAAGCCGGGAG(SEQ NO：8) |
| 5 | CCATCTTCTGACATACCATTTATTTTATGTCTTG(SEQ NO：9) |
| 6 | CCCGGCTGCATGACATT(SEQ NO：10) |
| 7 | GAATGAGGAGGATGAAGAACAGAAG(SEQ NO：11) |
| 8 | GCCATCTGCTTTCTGTCTTTCTAT(SEQ NO：12) |
| 9 | GCTGGACTTTAGAGTTCATTCACATC(SEQ NO：13) |
| 10 | GCCATCTGCTTTCTGTCTTTCTAT(SEQ NO：14) |
| 11 | CTTGCTTCTGAGGTATCTGCC(SEQ NO：15) |
| 12 | GGGAAACACCACCTCCTT(SEQ NO:16) |
应当理解，本发明所述引物组的核苷酸序列并不限于以上12种，本领域技术人员根据需要能够选择任何合适的引物组来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
优选的，所述PCR反应液包括水、三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸和DNA聚合酶。更优选的，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
本发明第三个方面公开了上述探针或上述试剂盒在无创检测染色体是否发生变异中的应用，优选的，可应用与检测胎儿染色体是否发生拷贝数变异。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
1.通过采用串列重复序列作为核心序列来设计探针，解决了以往运用数字 PCR检测基因拷贝数多重放大时，由于探针数量过多，而易于形成非特异性扩增及合成成本高昂的问题。
2.实施例中1-7中，一个FAM通用探针位点，一个VIC通用探针位点，作为组合与一个、两个、三个CY5通用探针位点进行不同组合检测都得到了预期结果。待测染色体单拷贝基因片段通用探针位置的两侧设计多对引物，实现了该条染色体拷贝数浓度的等比例放大，尤其适用于样品浓度偏低的检测(例如无创产前诊断染色体拷贝数异常)；
3.不同类型的通用探针能够完成多重扩增，而且互不干扰，准确度高；
4.采用MGB探针，使得探针的设计长度大大缩短，同时具有很高的退火温度和检测的特异性。
附图说明
图1为本发明实施例1中FAM-CY5的数字PCR散点图；
图2为本发明实施例1中VIC-CY5的数字PCR散点图；
图3为本发明实施例2中FAM-CY5的数字PCR散点图；
图4为本发明实施例2中VIC-CY5的数字PCR散点图；
图5为本发明实施例3中FAM-CY5的数字PCR散点图；
图6为本发明实施例3中VIC-CY5的数字PCR散点图；
图7为本发明实施例4中FAM-CY5的数字PCR散点图；
图8为本发明实施例4中VIC-CY5的数字PCR散点图；
图9为本发明实施例5中FAM-CY5的数字PCR散点图；
图10为本发明实施例5中VIC-CY5的数字PCR散点图；
图11为本发明实施例6中FAM-CY5的数字PCR散点图；
图12为本发明实施例6中VIC-CY5的数字PCR散点图；
图13为本发明实施例7中FAM-CY5的数字PCR散点图；
图14为本发明实施例7中VIC-CY5的数字PCR散点图；
图15为本发明实施例8中FAM-CY5的数字PCR散点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的主要技术方案如下：
首先采用串列重复序列作为核心序列来设计探针，通用探针1、探针2、探针3和探针4的编号分别为：FAM-P、VIC-P、CY5-P1和CY5-P2，具体核苷酸序列如表1所示。
表1
| 编号 | 序列 | GC％ | 碱基个数 |
| FAM-P | FAM-tctctctcacacacac-MGB(SEQ NO：1) | 50％ | 16 |
| VIC-P | VIC-acacacactctctctc-MGB(SEQ NO：2) | 50％ | 16 |
| CY5-P1 | CY5-agagagagacacacac-MGB(SEQ NO：3) | 50％ | 16 |
| CY5-P2 | CY5-acacacacacacacac-MGB(SEQ NO：4) | 50％ | 16 |
接着设计如表2所示的通用探针对应的引物：
表2
| 编号 | 序列 | GC％ | 碱基个数 |
| F1 | cgcttgctgttgtctgg(SEQ NO：5) | 59％ | 17 |
| R1 | catttaatcctgttagcagccca(SEQ NO：6) | 43％ | 23 |
| F2 | cggaaaggtaacccaggtaaa(SEQ NO：7) | 48％ | 21 |
| R2 | attactcttaacttttaagccgggag(SEQ NO：8) | 38％ | 26 |
| F3 | ccatcttctgacataccatttattttatgtcttg(SEQ NO：9) | 32％ | 34 |
| R3 | cccggctgcatgacatt(SEQ NO：10) | 59％ | 17 |
| F4 | gaatgaggaggatgaagaacagaag(SEQ NO：11) | 44％ | 25 |
| R4 | gccatctgctttctgtctttctat(SEQ NO：12) | 42％ | 24 |
| F5 | gctggactttagagttcattcacatc(SEQ NO：13) | 42％ | 26 |
| R5 | gccatctgctttctgtctttctat(SEQ NO：14) | 42％ | 24 |
| F6 | cttgcttctgaggtatctgcc(SEQ NO：15) | 52％ | 21 |
| R6 | gggaaacaccacctcctt(SEQ NO:16) | 56％ | 18 |
上述探针对应的靶标区域位置(染色体上对应的位置)如下：
(1)FAM通用探针对应的序列F位点：
chr21(21号染色体):43938035-43938186
CGCTTGCTGTTGTCTGGTGGGAGGGCTGCATTTCTCCTCTCTCCCCCACTTT CTCTCTCTCTCTCTC TCTCACACACACACAGACACACACACACACACACAC ACACTCACACTCACTGTTGGGTTTCTTGGGCTGCTAACAGGATTAAATG
(2)VIC通用探针对应的序列V位点：
chr1:246088180-246088344
CGGAAAGGTAACCCAGGTAAAAGCGCATCAAAACAAGGACACACACACACTCTCTCTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCCTTCTTTCTCTTTCTTTCT CTCTCTCTCTATTCAGGAGTTCTCAATTTCCCATTTCTCCCGGCTTAAAAGT TAAGAGTAAT
(3)CY5-P1通用探针对应的序列C1位点：
chr1:8317407-8317483
CCATCTTCTGACATACCATTTATTTTATGTCTTGTTTAATGTGTGTGTGTCTCTCTCTTAAATGTCATGCAGCCGGG
(4)CY5-P1通用探针对应的序列C2位点：
chr1:34482668-34482734
GAATGAGGAGGATGAAGAACAGAAGTAGAGAGAGACACACACCATAGAA AGACAGAAAGCAGATGGC
(5)CY5-P1通用探针对应的序列C3位点：
chr1:75981405-75981478
GCTGGACTTTAGAGTTCATTCACATCCTGTGTGTGTCTCTCTCTGTTTTTGTTTCTTTGACGAGAAAAGCAGAC
(6)CY5-P2通用探针对应的序列C4位点：
chr1:204660492-204660670
CTTGCTTCTGAGGTATCTGCCTTGTGTCCTCTACTTTCTCCCTTCTCCCCGC CTTACACAGACACAC ACACACACACACACACACACACTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCACTTCGTCTTAGAGCCTCTTGGGCTGCTCTTCTGCCTGGCTGTG CGTGTGAAGGAGGTGGTGTTTCCC
下面采用具体实施例进行描述。
1.设置实施例体系，如表3所示。
表3
2.样品来源
采用口腔拭子采集男性口腔脱落细胞。采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304，天根生化)抽提细胞基因组DNA。
3.实施例中的数字PCR检测条件如表4所示。
将样品进行PCR扩增，检测体系如表4所示。
表4
| 试剂 | 终浓度 | 备注 |
| 2Xmix | 1X | |
| 单条引物 | 1000nM | |
| 探针 | 250nM | |
| ROX | 1X | |
| DNA | 10ng | 口腔脱落细胞抽提基因组DNA |
扩增条件：
95℃10min；[95℃15s,55℃60s]*50。
4.数字PCR的结果
PCR结束后，采用生物芯片分析仪(iScanner5)分析芯片结果，得到FAM、 VIC和CY5的浓度数值(拷贝/μL)，结果如表5所示。
表5
5.数字PCR的散点图
实施例1-8的数字PCR散点图分别如图1-图15所示，图中左下表示背景信号，右下表示FAM或者VIC信号，左上表示CY5信号，右上表示FAM和CY5或者VIC 和CY5的双阳性信号。从表5和图1-图15的结果可以得出，8个实施例图像上都能正常分区，比值上也都符合预期，能够区分0.33和0.5，具有很好的区分度；而且，多个不同类型的探针能够完成多重扩增，互相不干扰。本发明首次采用串联重复序列作为骨架序列来构建MGB荧光探针，未来有望应用于无创产前染色体拷贝数异常诊断上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 一种短串联重复序列通用探针及其设计方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctctctcac acacac 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acacacactc tctctc 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagagagac acacac 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acacacacac acacac 16
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcttgctgt tgtctgg 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catttaatcc tgttagcagc cca 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggaaaggta acccaggtaa a 21
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attactctta acttttaagc cgggag 26
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccatcttctg acataccatt tattttatgt cttg 34
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccggctgca tgacatt 17
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaatgaggag gatgaagaac agaag 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccatctgct ttctgtcttt ctat 24
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctggacttt agagttcatt cacatc 26
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccatctgct ttctgtcttt ctat 24
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttgcttctg aggtatctgc c 21
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggaaacacc acctcctt 18
Claims (10)
1.一种用于数字PCR的探针，其特征在于，所述探针的序列采用短串联重复序列作为骨架序列，所述短串联重复序列按照重复基序区分，包括单一型(用结构式(X)n表示)、复合型(用结构式(X)n(Y)m表示)和间断型(用结构式(X)n Z(Y)m表示)，其中X为A、C、G、T四种碱基中的一种或2-6个碱基组合，Y为A、C、G、T四种碱基中不同于X的一种或2-6个碱基组合，Z为A、C、G、T四种碱基中不同于X和Y的一种或多个碱基的组合，n和m为重复的单元数。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针的长度为8-40bp；探针的5’端标记荧光报告基团，探针的3’端标记荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX或CY5，所述荧光淬灭基团为MGB。
4.根据权利要求1所述的探针，所述探针为探针1、探针2、探针3或探针4，其核苷酸序列分别为SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ NO：3和SEQ NO：4所示。
5.一种可同时检测基因组多个位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任意一项所述的探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括引物组和PCR反应液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组的序列设计于短串联重复序列的上下游，引物组长度为12-40bp，GC含量为30-80％。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列分别如SEQNO：5和SEQ NO：6，或SEQ NO：7和SEQ NO：8，或SEQ NO：9和SEQ NO：10，或SEQ NO：11和SEQNO：12，或SEQ NO：13和SEQ NO：14，或SEQ NO：15和SEQ NO：16所示。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括水、三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁、脱氧核糖核苷三磷酸和DNA聚合酶。
10.权利要求1-4中任意一项所述探针或权利要求5-9中任意一项所述试剂盒在无创检测染色体拷贝数是否发生变异中的应用。
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