JP2019162102A - 末梢血中で、がんによって変化したｒｎａを検出するシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

【課題】末梢血ＲＮＡ分布を解析して患者のがんの状態を決定する方法の提供。【解決手段】人におけるがんの存在および前がん性細胞の存在についてアッセイする方法であって、がんを有する疑いのある患者由来の生体試料を準備するステップと、該生体試料中のホルミルペプチド受容体遺伝子由来の核酸の循環遊離レベルを測定するステップと、該ホルミルペプチド受容体遺伝子の該測定レベルを、健康な人における該遺伝子の既知のレベルと比較するステップとを含み、レベルの増大が該患者におけるがんの存在を示す方法。【選択図】図２Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１２年１月６日に出願され、ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ ＲＮＡＳ ＡＬＴＥＲＥＤ ＢＹ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮ ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＬ ＢＬＯＯＤという表題の米国仮特許出願第６１／５８４，０９７号の優先権を主張するものである。

患者血液からの抽出物をアッセイすることによってがんを検出するためのシステムおよび方法が提供される。特に、ある特定のがんを有する患者に高度に特異的である循環遊離ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）のレベルおよび関係を検出するための方法が提供される。

がんは、米国内で、かつ国際的に主要な健康リスクである。治療は存在するが、疾患が、治効が損なわれる時点に進行するまで患者に投与されないことが多い。

がん治療における主要課題は、患者を、その疾患の過程の早期に特定することである。これは、早期がん性または前がん性細胞集団は、無症候性であり得、生検によってアクセスすることが困難である領域に位置する場合があるので、現在の方法下では困難である。したがって、無症候性であり得る早期を含めた、疾患のすべての病期を同定するのに使用することができる、ロバストな最小限に侵襲性のアッセイは、がんの治療に実質的な利益があるはずである。

本明細書に開示のシステム、デバイス、キット、および方法はそれぞれ、いくつかの特徴を有し、これらのうちのどの単一のものも、これらの望ましい属性に単独で関与しない。請求の範囲を限定することなく、次に、いくつかの顕著な特徴を簡単に論じる。より少ない、追加の、かつ／または異なるコンポーネント、ステップ、特徴、目的、利益、および利点を有する実施形態を含めた、多数の他の実施形態も企図されている。コンポーネント、態様、およびステップはまた、異なって配置および配列することができる。本考察を考慮した後、特に、「発明を実施するための形態」という表題のセクションを読んだ後、本明細書に開示のデバイスおよび方法の特徴が、他の公知のデバイスおよび方法に対してどのように利点をもたらすかが理解されるであろう。

一つの実施形態は、患者から採取される試料中の１種または複数のＲＮＡ分子を検出するための方法である。この実施形態では、血液または血漿などの血液成分が、肺がんまたは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有すると疑われる患者から単離される。血漿は、分析されて、１種または複数の遺伝子由来の循環遊離ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）のレベルが測定される。いくつかの実施形態では、測定されるＲＮＡは、患者の血漿中のｃｆＲＮＡの集団内由来のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）などのｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、循環遊離アクチンβ（ＡＣＴＢ）ＲＮＡのレベルが測定される。いくつかの実施形態では、循環遊離ＨＮＲＮＰＡ１ ＲＮＡのレベルが測定される。いくつかの実施形態では、循環遊離ホルミルペプチド受容体遺伝子（ＦＰＲ１）ＲＮＡのレベルが測定される。いくつかの実施形態では、ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１由来のｃｆＲＮＡレベルと比較した場合のＦＰＲ１由来のｃｆＲＮＡのレベルが、以下に論じるように比較されて、患者が肺がんまたはＮＳＣＬＣを有するリスクにあるか否かが判定される。いくつかの実施形態では、アッセイされるＮＳＣＬＣは、病期Ｉ ＮＳＣＬＣである。

いくつかの実施形態では、１種または複数のＲＮＡの少なくとも１つのサブセット（サブセット＃２）が、比較的一定量でがんのない個体の血漿中に存在することが公知であり、乳がん、大腸がん、または肺がんなどのがんを有する個体において、この一般に一定レベルと異なるレベルで存在することが公知である。例えば、レベルは、例えば、病期Ｉ ＮＳＣＬＣなどの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する患者において、一貫してより低い場合がある。いくつかの実施形態では、レベルはがん、例えば、病期Ｉ 非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）などのＮＳＣＬＣを有する患者において、一貫してより高い場合がある。いくつかの実施形態では、前記個体の肺がんは、リンパ節への転移を示さない。いくつかの実施形態では、サブセット＃１について選択されるＲＮＡ（複数可）は、ヌクレアーゼ活性に起因してより低いレベルで存在する場合があり、いくつかの実施形態では、アッセイされるＲＮＡまたはＲＮＡの領域は、ＲＮａｓｅによって優先的に切断されるヌクレアーゼ切断部位の存在または二次構造（すなわち、二本鎖対一本鎖）の存在に起因して、ヌクレアーゼに高感度であり得る。いくつかの実施形態では、サブセット＃１について選択されるＲＮＡは、肺がん患者などのある特定のがん患者において、より高いレベルで代表され得る。いくつかの実施形態では、サブセット＃１中のＲＮＡ蓄積のレベルの変化は、他の非悪性組織上の腫瘍に近接した範囲内のがんまたは免疫細胞によって分泌される分子の効果に起因し得る。

いくつかの実施形態では、サブセット＃１中のＲＮＡは、１）血液中への細胞からの優先的な放出、２）腫瘍細胞内の存在量の増大、３）腫瘍付近の細胞（すなわち、反応細胞または間質）内の存在量の増大、４）分泌されるシグナルによって媒介される、腫瘍付近にない細胞からの存在量の増大の１つまたは複数に起因して、がん患者において増大したレベルで血液中に放出される。

１種または複数のＲＮＡの別のサブセット（サブセット＃２）は、がん状態にかかわらず、すべての個体において安定に発現されることが分かっている場合がある。いくつかの実施形態では、サブセット＃２中のＲＮＡは、リボヌクレアーゼに対する感受性がより低い。

いくつかの実施形態では、サブセット＃１およびサブセット＃２のマーカーの相対的存在量が、がん性細胞、腫瘍、またはがん性となる潜在性が高まった細胞の存在を示す場合があり、他の実施形態では、サブセット＃１単独中のマーカーの蓄積レベルが、がん性細胞、腫瘍、またはがん性となる潜在性が高まった細胞を示す場合がある。いくつかの実施形態では、サブセット＃２の１つまたは複数のメンバーのＲＮＡレベルは、サブセット＃１の１つまたは複数のメンバーのレベルとは逆に変化する場合があり、その結果、レベルの比は、がん状態を示す。

いくつかの実施形態では、デジタルＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲが、ＲＮＡマーカーの存在または蓄積レベルを判定するための検出法として使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列決定を、ＲＮＡマーカーの量を求めるための検出法として使用することができる。他の実施形態では、検出は、分子バーコード技術、例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇまたはｎＣｏｕｎｔｅｒなどによって行うことができる。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡコピー数の結果が分析されて、結果間の統計的距離に少なくとも部分的に基づいて、アッセイ結果（すなわち、陽性または陰性の結果）が判定される。いくつかの態様では、本明細書に開示のマーカーの相対的存在量の分析に少なくとも部分的に基づいて、患者を異なるリスク群に分類することができる。正規分布、二項分布および／もしくはポアソン分布の累積分布関数、または同様の関数を、ＲＮＡの相対的存在量を求めるのに使用することができる。いくつかの実施形態では、患者中に存在するがんのタイプは、ＲＮＡ発現の結果に対して少なくとも部分的に予測することができる。

図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、正常な個体、および１種または複数の腫瘍を有することが分かっている個体から採取した血漿由来の、それぞれマーカーＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１の蓄積レベルのボックスプロットを表す図である。ｙ軸は、自然対数で表した、ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ中で測定した蓄積レベルに対して正規化した、アッセイした血漿１ｍＬ当たりの転写物蓄積レベルを示す。ボックスプロットの標準的な慣習によれば、各カラム中の中央の水平線は、中央値を表し、ボックスは、２５％〜７５％の四分位数を表し、エラーバーは、最端の観察結果（異常値を除く）を示す。すべての単位は、ＡｇｉｌｅｎｔのユニバーサルヒトＲＮＡ １ｎｇから得られた同様の転写物の蓄積レベルと比べた、アッセイした血漿１ｍＬ当たりの転写物蓄積レベルの比である。 図２Ａおよび図２Ｂは、ＦＰＲ１値に対して正規化した、ＡＣＴＢ値およびＨＮＲＮＰＡ１値の比の二次元散布図を表す図である。各試料について、ｘ軸は、ＦＰＲ１／ＡＣＴＢの比であり、ｙ軸は、ＦＰＲ１／ＨＮＲＮＰＡ１の比である。 図２Ａは、ＦＰＲ１値に対して正規化した、ＡＣＴＢ値およびＨＮＲＮＰＡ１値の比の二次元散布図を表し、試料値は細胞株対照から得たＲＮＡから求めた値に対して正規化されている。点線Ａは、正常な患者から得た値の大部分を分離する。点線Ｂは、ＮＳＣＬＣ患者から得た値の大部分を分離する。点線ＡとＢの間の値は、最高正常値と最低ＮＳＣＬＣ値との間の最小程度の重なりを表す。 図２Ｂは、ＦＰＲ１値に対して正規化した、ＡＣＴＢ値およびＨＮＲＮＰＡ１値の比の二次元散布図を表し、試料値は合成標準物質から得たＲＮＡから求めた値に対して正規化されている。点（０．１，１０）、（１，１）、および（１０，０．１）を通過する点線の対角線は、主にＮＳＣＬＣ試料（黒塗円）の集団から正常試料（白塗円）の集団を分離する。

一つの実施形態は、血液中の循環核酸を分析することによって、がんのリスクのある患者が疾患を有し得るか否かを判定するためのシステムおよび方法に関する。がんを有し得る患者の判定は、ＲＮＡ蓄積レベルをアッセイするために血液に由来する検体で行うことができ、このような分析は、発現マイクロアレイ、配列決定、ｎＣｏｕｎｔｅｒ、またはリアルタイムＰＣＲによって行うことができる。いくつかの実施形態では、対照核酸の第１のサブセットの発現レベルが、がんを有する患者において増大することが分かっている核酸の第２のサブセットの発現レベルと比較される。対照核酸の第１のサブセットは、多くの無疾患患者由来の血漿を分析し、これらの患者内で、安定レベルで発現される遺伝子を選択することによって見つけることができる。サブセットは、複数の組織型（すなわち、大腸、肺、腎臓、肝臓など）から採取した固体組織検体を分析し、患者の血液中で、安定レベルで循環遊離核酸として発現される遺伝子を選択することによって見つけることもできる。

いくつかの実施形態では、サブセット＃１は、転写物蓄積レベルが血漿中、または固形腫瘍検体中で増大する遺伝子を分析することによって選択することができる。

いくつかの実施形態では、サブセット＃１は、循環遊離核酸レベルが、がんに罹患している個体から採取した血漿中、または固形腫瘍検体中で減少する遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、サブセット＃１は、転写物蓄積レベルが、がん患者と比較して、正常な個体において変化しない遺伝子を含む。これらの実施形態では、サブセット＃２は、蓄積レベルが血漿中、または固形腫瘍検体中で増大するサブセット＃１の１種または複数の遺伝子と組み合わせて選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の態様は、ホルミルペプチド受容体遺伝子（ＦＰＲ１）ＲＮＡの循環遊離ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）レベルが、がんに罹患している患者において変化するという発見に関する。例えば、ＦＰＲ１のｃｆＲＮＡレベルは、以下に記載するように、肺がんを有する患者において増大することが判明した。さらに、ＦＰＲ１のｃｆＲＮＡレベルは、ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１などの他の遺伝子、またはサブセット＃２に列挙される他の転写物のｃｆＲＮＡレベルと比較して増大することが示された。

図１Ａに示し、実施例１を参照して記載したように、図１Ａは、正常細胞（すなわち、推定的にがんがない）および腫瘍細胞（すなわち、既知の腫瘍細胞を有する）として、がん状態を有すると分類された患者から採取した血漿から測定した試料中の遺伝子ＦＰＲ１の転写物蓄積レベルを表す。ｙ軸の対数値は、ＦＰＲ１転写物が、正常な患者と比較して腫瘍細胞患者において平均で、約１００倍多いレベルで蓄積することを示す。

図１Ｂおよび図１Ｃは、正常細胞（すなわち、推定的にがんがない）および腫瘍細胞（すなわち、既知の腫瘍細胞を有する）として、がん状態を有すると分類された患者から採取した血漿から測定した試料中の、それぞれ遺伝子ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１の転写物蓄積レベルを表す。ｙ軸の対数値は、ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１転写物が、平均で、正常な患者および腫瘍細胞患者において同等であるレベルで蓄積することを示す。

いくつかの実施形態では、サブセット＃１が分かった後、サブセット＃２は、複数の検体から多数の候補を分析し、サブセット＃２とサブセット＃１との差異ががん患者の血漿中で最大であるものを選択することによって選択することができる。いくつかの実施形態では、サブセット＃２は、多くの遺伝子の転写物蓄積レベルを調査し、どれが最低の変動性を有するかを見つけることによって選択することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、これらの個体蓄積レベルに基づかず、がんにおけるこれらの相対的な蓄積レベルの変化の欠如に基づいて選択される。

図１Ａ〜Ｃは、ＦＰＲ１およびＡＣＴＢ、ＦＰＲ１およびＨＮＲＮＰＡ１、またはＦＰＲ１およびＡＣＴＢとＨＮＲＮＰＡ１の両方が、本明細書に開示の方法にとって適当なサブセット＃１およびサブセット＃２の遺伝子の組合せであることを示すが、本発明の実施形態は、これらの遺伝子のみに限定されない。

サブセット＃１（およびいくつかの実施形態では、サブセット＃２）が所与のがんタイプ内で分かった後、がん患者、およびがんがアッセイされる患者から採取した血漿中で、発現プロファイルを測定することができる。標準的な採血よりも大きなリスクをもたらすことなく、多くのかかりつけの医師のオフィス内で血漿を収集および調製することができるので、いくつかの実施形態におけるサブセット＃１とサブセット＃２との間の相対的ｃｆＲＮＡ蓄積レベルは、有益ながんバイオマーカーであり得る。さらに、いくつかの実施形態におけるサブセット＃１およびサブセット＃２が確実にアッセイすることができる場合、これらは、現在のがんアッセイに対していくつかの利点を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、発症の早期におけるがん、わずかな症状を呈するがん、良性状態と区別することが困難であるがん、または従来の生検アッセイにとってアクセス可能でない場合のある体の範囲内で発症している恐れのあるがんを検出することができる。

ＲＮａｓｅ活性の増大が腫瘍内で存在することが多い。このＲＮａｓｅ活性は、腫瘍増殖を阻害することができ、がんに対する免疫系の応答の一部であり得る。細胞毒性Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γを介してがん細胞のアポトーシスをもたらすことができ、このアポトーシスは、ＲＮａｓｅ ＬなどのＲＮａｓｅを活性化することができる。腫瘍増殖に起因する低酸素によって引き起こされる場合のあるネクローシスを介した細胞の死も、ＲＮａｓｅの放出に寄与することができる。肺がん患者の血漿は、ＲＮａｓｅ活性が増大していることが公知である（Ｍａｒａｂｅｌｌａら、（１９７６）「Ｓｅｒｕｍ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、８（６）：５０１〜５０５；Ｒｅｄｄｉら、（１９７６）「Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｓｅｒｕｍ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３（７）：２３０８〜２３１０）。肺細胞は、血漿中に見出されるものと同様のＲＮａｓｅを含有することも公知である（Ｎｅｕｗｅｌｔら、（１９７８）「Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ ｂｙ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３８：８８〜９３）。

より高いレベルのＲＮａｓｅが血漿中に存在する場合、任意の遊離ＲＮＡは、より急速な分解に感受性である。したがって、血漿ＲＮＡ配合物中で検出可能なＲＮＡがより少ない場合がある。すべてのＲＮＡは、減少したレベルで存在し得るが、遺伝子の通常の変動が低い場合のみ、任意のレベルの精度でこの差異を検出することが可能である。例えば、遺伝子の発現の正常範囲が１０〜１００単位の間である場合、１単位の減少を正確に検出することは困難となり得る。しかし、遺伝子の発現が通常、１０〜１１単位の間である場合、１単位の減少は、容易に検出可能である（すなわち、１０単位より下の任意の数値は、減少を示唆するはずである）。

ＦＰＲ１は、肺およびがんにおいて複数の役割を果たす。ＦＰＲ１は、肺線維芽細胞内で発現され（ＶａｎＣｏｍｐｅｒｎｏｌｌｅら（２００３）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１（４）：２０５０〜６）、肺における創傷修復に必要である（Ｓｈａｏ（２０１１）、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、４４：２６４〜２６９）。線維芽細胞は、腫瘍と闘う免疫細胞の誘引（Ｇｅｍｐｅｒｌｅ（２０１２）、ＰＬＯＳＯｎｅ、７（１１）：１〜７、ｅ５０１９５）、および腫瘍を保護する間質の創製（Ｗａｎｇ（２００９）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１５（２１）６６３０〜６６３８）の両方において重要であることが公知である。ＦＰＲ１は、腫瘍における他の発癌遺伝子の活性を悪化させる場合もある（Ｈｕａｎｇ（２００７）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６７（１２）：５９０６〜５９１３）。これが肺がんにおいて過剰発現される証拠はまったくないが、ＦＰＲ１は、ＲＮＡ安定化によって制御されることが公知である（Ｍａｎｄａｌ（２００７）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７８：２５４２〜２５４８、Ｍａｎｄａｌ（２００５）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７５：６０８５〜６０９１）。これらの役割を考慮すると、ＦＰＲ１ ＲＮＡは、腫瘍増殖を増強する（すなわち、増殖の創傷−修復システムを活性化し、もしくは保護間質を増殖させることによって）腫瘍細胞、または免疫応答を増強する（すなわち、追加の免疫細胞の誘引）免疫細胞によって意図的に分泌させることが可能である。

いくつかの実施形態では、この方法は、患者の試料からｃｆＲＮＡを抽出し、抽出したｃｆＲＮＡをアッセイすることによって始めることができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、Ｌ．ら、（２００８）「Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ．」、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、５：９４〜１０４を参照。いくつかの実施形態では、データの信頼性を保証するために血漿またはＲＮＡの他の源からｃｆＲＮＡを単離するのに、一貫した繰り返し可能な方法が使用される。血液からｃｆＲＮＡを得るために、以下に列挙されるプロトコールを使用することができるが、他の方法も企図されている。

例えば、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ＱＩＡａｍｐ循環核酸キットを使用して、ｃｆＲＮＡ分子を血漿または他の試料から精製することができる。このキット中のプロトコールは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、文献「ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２版、２０１１年１月に記載されている。このプロトコールは、血漿１ｍＬから循環全核酸を精製するための方法の実施形態を提供する。簡単に説明すると、溶解試薬およびプロテアーゼが不活性な担体ＲＮＡとともに添加される。全核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）がカラムに結合され、カラムが複数回洗浄され、次いでカラムから溶出される。

例えば、このプロトコールは、諸ステップを以下の通り実行することによって実施することができる。ＱＩＡＧＥＮプロテイナーゼＫ １００μｌ、２００μｌ、または３００μｌを、５０ｍｌの遠心管内にピペットで移す。血清または血漿１ｍｌ、２ｍｌ、または３ｍｌを５０ｍｌのチューブに添加する。緩衝液ＡＣＬ（担体ＲＮＡ １．０μｇを含有する）０．８ｍｌ、１．６ｍｌ、または２．４ｍｌを添加する。キャップを閉じ、チューブ内で目に見える渦が形成するのを確認して、３０秒間パルスボルテックスすることによって混合する。効率的な溶解を保証するために、試料および緩衝液ＡＣＬを完全に混合して均一溶液を得る。この手順は、この時遮られるべきでない。

溶解インキュベーションを開始するために、６０℃で３０分間インキュベートする。チューブを実験台上に戻し、緩衝液ＡＣＢ １．８ｍｌ、３．６ｍｌ、または５．４ｍｌをチューブ内の溶解産物に添加する。キャップを閉じ、１５〜３０秒間バルスボルテックスすることによって完全に混合する。チューブ内の溶解産物−緩衝液ＡＣＢ混合物を氷上で５分間インキュベートする。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎｉカラムをＱＩＡｖａｃ ２４ Ｐｌｕｓ上のＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒ内に挿入する。２０ｍｌのチューブエクステンダーを開いているＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラム内に挿入する。試料の漏れを回避するために、チューブエクステンダーがＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラム内にしっかりと挿入されていることを確認する。

乾燥スピン用の収集チューブを下に保持する。溶解産物−緩衝液ＡＣＢ混合物をＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムのチューブエクステンダー内に慎重に加える。真空ポンプのスイッチを入れる。すべての溶解産物が完全にカラムから引き出されたとき、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。チューブエクステンダーを慎重に取り出し、廃棄する。大きい試料溶解産物体積（試料３ｍｌで開始するとき約１１ｍＬ）は、真空力によってＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ膜を通過するのに最大１０分を必要とする場合があることに留意されたい。真空圧を速く好都合に解放するために、真空レギュレーターが使用されるべきである（ＱＩＡｖａｃ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍの一部）。交差汚染を回避するために、隣接するＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムの上にチューブエクステンダーを移動させないように注意されたい。

緩衝液ＡＣＷ１ ６００μｌをＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムに加える。カラムの蓋を開けたままにして、真空ポンプのスイッチを入れる。緩衝液ＡＣＷ１のすべてがＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムから引き出された後、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムに緩衝液ＡＣＷ２ ７５０μｌを加える。カラムの蓋を開けたままにして、真空ポンプのスイッチを入れる。緩衝液ＡＣＷ２のすべてがＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムから引き出された後、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムにエタノール（９６〜１００％）７５０μｌを加える。カラムの蓋を開けたままにして、真空ポンプのスイッチを入れる。エタノールのすべてがスピンカラムから引き出された後、真空ポンプのスイッチを切り、圧力を０ｍｂａｒに解放する。ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムの蓋を閉じる。これを真空マニホールドから取り出し、ＶａｃＣｏｎｎｅｃｔｏｒを廃棄する。ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムを清潔な２ｍｌの収集チューブ内に入れ、全速力（２０，０００×ｇ；１４，０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離する。

ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムを新しい２ｍｌの収集チューブ内に入れる。蓋を開け、アセンブリーを５６℃で１０分間インキュベートして膜を完全に乾燥させる。ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムを清潔な１．５ｍｌの溶出チューブ（提供された）内に入れ、ステップ１４からの２ｍｌの収集チューブを廃棄する。緩衝液ＡＶＥ ２０〜１５０μｌをＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ膜の中心に慎重に加える。蓋を閉じ、室温で３分間インキュベートする。溶出緩衝液ＡＶＥが室温（１５〜２５℃）に平衡化されているのを保証する。溶出が小体積（５０μｌ未満）で行われる場合、溶出緩衝液は、結合したＤＮＡを完全に溶出するために、膜の中心上に供給されなければならない。溶出体積は、融通性があり、下流のアプリケーションの要求事項によって適合させることができる。回収される溶出液の体積は、ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムに加えた溶出体積未満で最大５μｌとなる。全速力（２０，０００×ｇ；１４，０００ｒｐｍ）で、微量遠心機で１分間遠心分離して核酸を溶出する。上記例のＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ １／２０１１は、当業者の知識を表し、限定的ではなく例示的である。上記方法の変形、またはｃｆＲＮＡ精製への別個の手法を含めた代替の実施形態は、本明細書に企図されており、本明細書に開示の方法および組成物は、いずれの特定のｃｆＲＮＡ精製法にも限定されない。

本方法によって生成される試料は、高度に純粋で、ＰＣＲ阻害剤を含まない場合があり、例えば、様々なタイプのがんのアッセイとして、ｃｆＲＮＡの相対的発現をアッセイするためのいくつかの実施形態で使用されるｑＰＣＲに適していることができる。

いくつかの実施形態では、本方法は、単位複製配列を生成するために、ＰＣＲまたはｑＰＣＲを実施するステップを含む。多数の異なるＰＣＲおよびｑＰＣＲプロトコールが当技術分野で公知であり、以下で本明細書に例示されており、〜を検出および／または同定するのに本記載の組成物を使用する用途に直接適用し、または適合させることができる。

いくつかの実施形態は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる）を含む方法を提供する。ｑＰＣＲは、定量的な測定をもたらすことができ、時間および汚染の低減という利益ももたらすことができる。本明細書において、「定量的ＰＣＲ」（「ｑＰＣＲ」、またはより具体的には「リアルタイムｑＰＣＲ」）は、反応生成物のサンプリングを繰り返す必要なく、ＰＣＲ増幅が行われている際にその進行を直接監視することを指す。ｑＰＣＲでは、反応生成物は、これらが、シグナルがバックグラウンドレベルを超えて上昇する後であるが、反応がプラトーに到達する前に生成および追跡される際に、シグナル伝達機構（例えば、蛍光）を介して監視することができる。蛍光の検出可能な、または「閾値」レベル（サイクル閾値または「ＣＴ」と本明細書で呼ぶ）を実現するのに必要とされるサイクルの数は、シグナル強度の尺度が、リアルタイムで試料中の標的核酸の量の尺度をもたらすことを可能にするＰＣＲプロセスの開始時に増幅可能な標的の濃度とともに直接変化する。

ＰＣＲおよびｑＰＣＲを設定するための方法は、当業者に周知である。反応混合物は、適当な緩衝液、塩などと組み合わせて、鋳型核酸（例えば、以下に記載する陰性対照の場合を除いて、検査試料中に存在するような）、ならびにオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブ、ならびに適切な濃度の核酸ポリメラーゼを最小限に含む。本明細書において、「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。一般に、この酵素は、標的配列にアニールされたプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終わるまで、鋳型に沿って５’〜３’方向に進む。適切な濃度には、本記載の方法でこの反応を触媒するものが含まれる。本明細書に開示の方法で有用な公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＡＳＴＳＴＡＲＴ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＰＴＡＴＡＱ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫＬＥＮＴＡＱ１（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｃ．）、ＨＯＴＧＯＬＤＳＴＡＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ＫＡＰＡＴＡＱ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ２Ｇ（商標）Ｆａｓｔ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓｓ）、ＰＨＵＳＩＯＮ（商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）などがある。

上記コンポーネントに加えて、本方法の反応混合物は、プライマー、プローブ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。

通常、反応混合物は、４つの天然に存在するヌクレオシド塩基、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰに対応する４つの異なるタイプのｄＮＴＰをさらに含むことになる。いくつかの実施形態では、各ｄＮＴＰは一般に、約１０〜５０００μＭ、通常、約２０〜１０００μＭ、約１００〜８００μＭ、または約３００〜６００μＭの範囲の量で存在することになる。

反応混合物は、一価イオンの源、二価陽イオンの源、および緩衝剤を含む水性緩衝媒体をさらに含むことができる。一価イオンの任意の好都合な源、例えば、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどを使用することができる。二価陽イオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛などとすることができ、この場合、陽イオンは一般に、マグネシウムとなる。塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムなどを含めた、マグネシウム陽イオンの任意の好都合な源を使用することができる。緩衝液中に存在するマグネシウムの量は、０．５〜１０ｍＭの範囲となり得、約１〜約６ｍＭ、または約３〜約５ｍＭの範囲とすることができる。緩衝液中に存在し得る代表的な緩衝剤または塩としては、トリス、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなどがあり、緩衝剤の量は一般に、約５〜１５０ｍＭ、通常、約１０〜１００ｍＭ、より通常には、約２０〜５０ｍＭの範囲となり、この場合、ある特定の好適な実施形態では、緩衝剤は、約６．０〜９．５の範囲のｐＨ、例えば、ｐＨ約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、または９．５をもたらすのに十分な量で存在することになる。緩衝媒体中に存在し得る他の作用物質には、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが含まれる。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＢＳＡなどを含むことができる。さらに、いくつかの実施形態では、反応物は、特に試薬が、経時的に貯蔵することができるマスターミックスとして提供される場合、トレハロースなどの凍結保護物質を含むことができる。

反応混合物の調製において、様々な構成コンポーネントを、任意の好都合な順序で組み合わせることができる。例えば、緩衝液は、プライマー、ポリメラーゼと組み合わせ、次いで鋳型核酸と組み合わせることができ、または様々な構成コンポーネントのすべてを同時に組み合わせて反応混合物を生成してもよい。

代わりに、例えば、Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ ＰＣＲミックス（Ｑｉａｇｅｎ）、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＯＭＮＩＭＩＸ（登録商標）もしくはＳＭＡＲＴＭＩＸ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ）、ＩＱ＆＃８４８２；Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔ（Ｒｏｃｈｅ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、またはＢＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）ＱＰＣＲ マスターミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含めた、市販のプレミックス試薬を、製造者の指示に従って本明細書に開示の方法で利用し、または反応条件を改善するように改変することができる（例えば、必要に応じて、緩衝液濃度、陽イオン濃度、またはｄＮＴＰ濃度の改変）。

反応混合物を、プライマー伸長反応条件（「ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件」）、すなわち、鋳型として鋳型鎖を使用して、プライマー分子の末端にヌクレオチドを付加することによってポリメラーゼ媒介プライマー伸長を可能にする条件に付すことができる。多くの実施形態では、プライマー伸長反応条件は、増幅条件であり、この条件は、複数の反応サイクルを含み、各反応サイクルは、（１）変性ステップ、（２）アニーリングステップ、および（３）重合ステップを含む。以下で論じるように、いくつかの実施形態では、増幅プロトコールは、アニーリング専用の特定の時間を含まず、代わりに、変性および伸長専用の特定の時間のみを含む。反応サイクルの数は、実施されるアプリケーションに応じて変化することになるが、通常、少なくとも１５、より通常には、少なくとも２０となり、６０以上もの多くとなる場合があり、異なるサイクルの数は一般に、約２０〜４０の範囲となる。約２５超、通常、約３０超のサイクルが実施される方法については、酵素的プライマー伸長に適した条件が維持されるように、追加のポリメラーゼを反応混合物中に導入することが好都合であり、または望ましい場合がある。

変性ステップは、反応混合物を高温に加熱すること、および反応混合物中に存在する任意の二本鎖核酸またはハイブリダイズした核酸が解離するのに十分な時間、混合物を高温で維持することを含む。変性に関して、反応混合物の温度は、通常、約８５〜１００℃、通常、約９０〜９８℃、より通常には約９３〜９６℃の範囲の温度に上昇され、約３〜１２０秒、通常、約３秒の範囲の時間、その温度で維持される。

変性の後、反応混合物を、混合物中に存在する鋳型核酸（存在する場合）にプライマーをアニーリングするのに、かつプライマーが、鋳型としてハイブリダイズされる核酸を使用して５’から３’方向に伸長される様式で、プライマー末端にヌクレオチドを重合するのに十分な条件、すなわち、プライマー伸長産物の酵素的産生に十分な条件に付すことができる。いくつかの実施形態では、アニーリングおよび伸長プロセスは、同じステップ内で行われる。これらの条件を実現するために反応混合物が下げられる温度は、通常、最適な効率および特異性をもたらすように選ばれることになり、一般に、約５０〜８５℃、通常、約５５〜７０℃、より通常には、約６０〜６８℃の範囲となる。いくつかの実施形態では、アニーリング条件は、約１５秒〜３０分、通常、約２０秒〜５分、または約３０秒〜１分、または約３０秒の範囲の時間、維持することができる。

このステップは、各ステップについて温度および時間の長さのバリエーションおよび最適化を伴って、アニーリングステップおよび伸長ステップのそれぞれの１つを任意選択により含むことができる。２ステップのアニーリングおよび伸長では、アニーリングステップは、上記の通り進められる。プライマーを鋳型核酸にアニーリングした後、反応混合物は、上記の通り、ヌクレオチドをプライマー末端に重合するのに十分な条件にさらに付される。重合条件を実現するために、反応混合物の温度は一般に、約６５〜７５℃、通常、約６７〜７３℃の範囲の温度に上昇または維持され、約１５秒〜２０分、通常、約３０秒〜５分の範囲の時間維持される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、分離したアニーリングおよび伸長ステップを含まない。逆に、本方法は、特にアニーリングに専用のいずれのステップも含まない、変性ステップおよび伸長ステップを含む。

変性、アニーリング、および伸長の上記サイクルは、一般に、サーマルサイクラーとして公知の自動デバイスを使用して実施することができる。使用することができるサーマルサイクラーは、本明細書の他の箇所で、かつ米国特許第５，６１２，４７３号、同第５，６０２，７５６号、同第５，５３８，８７１号、および同第５，４７５，６１０号に記載されており、これらの特許の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書に記載の方法は、標的核酸配列を検出するための非ＰＣＲベースアプリケーションで使用することもでき、この場合、このような標的は、固体支持体上に固定化することができる。固体支持体上に核酸配列を固定化する方法は、当技術分野で公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）、ならびに製造者、例えば、膜についてＰａｌｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ａｍｐ；Ｓｃｈｕｅｌｌ；磁気ビーズについて：Ｄｙｎａｌ；培養プレートについて：Ｃｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ；ビーズアレイプラットフォームについて：Ｌｕｍｉｎｅｘ、およびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ならびに本明細書に提供される実施形態によって有用な他の支持体について、ＣＰＧ、Ｉｎｃ．によって提供されるプロトコールに記載されている。

同様の増幅または検出／定量化結果をもたらす、様々な試薬の正確な量、およびＰＣＲまたは他の適当な増幅手順についての条件（例えば、緩衝液条件、サイクリング時間など）に対するバリエーションは、当業者に公知であり、等価であるとみなされる。一つの実施形態では、対象のｑＰＣＲ検出は、試料中の標的核酸の５０コピー未満（好ましくは、２５コピー未満、より好ましくは、１５コピー未満、さらにより好ましくは、１０コピー未満、例えば、５、４、３、２、または１コピー）を検出する感度を有する。

いくつかの実施形態では、本方法は、ｃｆＲＮＡ鋳型ＲＮＡのＰＣＲ増幅を伴う場合がある。ＲＮＡ試料からＤＮＡ汚染物質を除去するために、ＤＮａｓｅ処理を行ってもよい。ｃｆＲＮＡは、逆転写酵素でｃＤＮＡに変換することができ、このステップは、ＰＣＲ反応内で使用される同じプライマーの１種または複数を使用することができる。標的ｃＤＮＡは、例えば、血漿由来のｃＤＮＡまたは他のｃＤＮＡを増幅するための一貫した、繰り返し可能な方法によって増幅することができる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ中の１種または複数の標的を、Ｔａｑｍａｎ化学を介して増幅および定量化することができる。このプロトコールは、ｃｆＲＮＡ量を検出するための唯一の適当なプロトコールでない場合がある。しかし、プロトコールのバリエーションは、最終結果に対して大きな効果を有し得るので、ｃＤＮＡを合成および増幅するのに一貫したプロトコールを使用することが重要で有り得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）のためのアッセイを伴う場合がある。いくつかの実施形態では、アッセイは、サブセット＃２を構成する以下の遺伝子：ＰＬＧＬＢ２、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＮＡＣＡ、ＥＩＦ１、ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＣＤ８１、ＴＭＢＩＭ６、ＭＹＬ１２Ｂ、ＡＣＴＢ、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＣＬＤＮ１８、ＲＡＭＰ２、ＭＦＡＰ４、ＦＡＢＰ４、ＭＡＲＣＯ、ＲＧＬ１、ＺＢＴＢ１６、Ｃ１０ｏｒｆ１１６、ＧＲＫ５、ＡＧＥＲ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＨＢＢ、ＴＣＦ２１、ＧＭＦＧ、ＨＹＡＬ１、ＴＥＫ、ＧＮＧ１１、ＡＤＨ１Ａ、ＴＧＦＢＲ３、ＩＮＰＰ１、ＡＤＨ１Ｂの１種または複数、およびサブセット＃１を構成する以下の遺伝子：ＣＴＳＳ、ＦＰＲ１、ＦＰＲ２、ＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２、ＣＸＣＲ２、ＮＣＦ２の１種または複数を伴うことができる。

独自のＲ１ｂアッセイを使用することができる。この実施形態では、アッセイは、ＡＣＴＢ、ＨＮＲＮＰＡ１、およびＦＰＲ１の相対的存在量を検出する３プレックスｑＰＣＲアッセイであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１は、サブセット＃２の基準を満たすことができ、ＦＰＲ１は、サブセット＃１の基準を満たすことができる。

いくつかの実施形態では、サブセット＃２は、ＡＣＴＢからなり得、サブセット＃１は、ＦＰＲ１からなり得る。いくつかの実施形態では、サブセット＃２は、ＨＮＲＮＰＡ１からなり得る。いくつかの実施形態では、サブセット＃２は、ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１からなり得る。いくつかの実施形態では、サブセット＃２は、ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１の少なくとも１種を含むことができる。いくつかの実施形態では、サブセット＃１は、ＦＰＲ１であり、サブセット＃２は、ＡＣＴＢ、もしくはＨＮＲＮＰ１、またはＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰ１の両方である。いくつかの実施形態では、製造者のプロトコールに従って提供されるプライマー／プローブを使用して、Ｑｉａｇｅｎアッセイ＃ＱＦ００１１９６０２をｑＰＣＲのために使用することができる。ＡｇｉｌｅｎｔのユニバーサルＲＮＡをｑＰＣＲにおける標準物質として使用することができる。別の実施形態では、以下のプライマー／プローブからなるＲ１ｂアッセイは、表１における以下の通りとすることができる。

ＲＮＡ標準物質は、複数の実行にわたる結果を標準化するのに使用することができる。この標準物質は、異なる希釈で実行することができる。いくつかの実施形態では、合成標準物質を使用することができる。例えば、１種または複数のマーカーの正常範囲およびカットオフを検査することができ、合成標準物質を、直接に得、使用し、またはこれらがマーカーの予測レベルなどの予測レベルと同様のレベルであるように希釈し、もしくは組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、合成標準物質は、患者試料中の予測レベルであり、またはその一桁の範囲内（すなわち、１０倍高い、または１０分の１低い）であるレベルで存在する。いくつかの実施形態では、合成標準物質は、患者試料について予測されるレベルで、またはそれより５倍の差異の範囲内（すなわち、５倍高い、または５分の１低い）で存在する。いくつかの実施形態では、合成標準物質は、患者試料について予測されるレベルで、またはそれより２倍の差異の範囲内（すなわち、２倍高い、または２分の１低い）で存在する。

合成標準物質中の各合成ＲＮＡの適切なレベルを求めるのに、多くの方法を使用することができる。一つの実施形態では、いくつかの数のこれらを代表する試料を実行し、結果（すなわち、標準物質に対するＣｔ値またはフィット値）を記録することができる。次いで各合成ＲＮＡを、同じアッセイで実行することができ、結果を、試料と同じスケール（すなわち、標準物質に対するＣｔスコアまたはフィット値）で測定することができる。検査した後、どの標準物質が使用されなければならないかを判定することができる。例えば、５０試料を実行することができ、３３〜３８の範囲のＣｔスコアが、所与の遺伝子について得られる。１μＬ当たり１０^７、１０^６、１０^５、１０^４、１０^３、１０^２コピーの標準物質は、２４、２８、３２、３６、４０、または４４のＣｔスコアを生じ得る。したがって、１０^５の標準物質を使用し、アッセイのセットアップの間に１０^４および１０^３への希釈を行うことを決定してもよい。このストラテジーを使用すると、将来の試料をカバーするのに元の標準物質および２つの希釈液しか必要でない。同様の方法を、同じマルチプレックス内の他の標準物質の適切な濃度を選択するのに使用することができる。この方法を使用して、アッセイされる各転写物について、異なる濃度を使用することができ、したがって、マルチプレックス中の異なる遺伝子間で大きな食い違いがあっても、単一の標準物質を使用することができる。本明細書に開示の方法を使用することによって、広く及ぶ蓄積レベルの転写物を、標準鋳型に対する増幅反応の数を低減してアッセイすることができる。

例えば、遺伝子Ａが１００〜１０，０００コピー／μｌの範囲内であり、遺伝子Ｂが１，０００，０００〜１００，０００，０００コピーの範囲内であることを期待する場合、１０，０００コピーの遺伝子Ａおよび１００，０００，０００コピーの遺伝子Ｂの混合合成標準物質を創製することができ、それによって、一試料について予期される全範囲をカバーするのに、１０倍希釈系列で３種の標準物質しか必要としない。このような合成標準物質を使用すると、いくつかの実施形態では、遺伝子ａおよび遺伝子Ｂの両方の予期される範囲をカバーする検量線を生成するのにｑＰＣＲ反応プレート内で実行される必要がある標準物質または対照試料の数を劇的に低減することができる。この方法はまた、連続希釈の間の配合からのピペット操作によって導入される小さな誤差のリスクを最小限にすることになる。

結果が標準単位で表されるように、回帰を使用することによって、患者試料から生成されるデータ点を標準物質にフィッティングすることができる。いくつかの実施形態では、標準物質は、１種または複数の細胞株から創製されるＲＮＡからなる。いくつかの実施形態では、標準物質は、合成ＲＮＡからなり得る。標準物質内の各ＲＮＡの断片の数は、分かっている場合があり、標準化された単位は、各標的について存在するＲＮＡ分子の数とすることができる。いくつかの実施形態では、標準物質は、以下の合成ＲＮＡからなり得る：

アッセイは、異なる配列のコンポーネントもしくは同様の領域を標的にした異なる検出可能標識を有するコンポーネント、同じ遺伝子の異なる領域を標的にしたコンポーネント、または上記Ｒ１ａアッセイで列挙したもの以外の遺伝子の領域を標的にするコンポーネントを伴うことができる。

Ｒ１ａ試験の結果は、Ｖｉｏｍｉｃｓ’ＮＳＣＬＣ試験などの、がんについてのＶｉｏｍｉｃｓ試験の決定規則を使用して評価することができる。一方の軸がＦＰＲ１とＡＣＴＢの比であり、他方の軸がＦＰＲ１とＨＮＲＮＰＡ１の比であるプロットを作ることができる。このようなプロットの例は、図２Ａ〜Ｂに示されている。図２Ａ中のプロットは、細胞株対照を使用する初期データであり、図２Ｂ中のプロットは、合成標準物質を使用する独立したデータセットである。

細胞株対照が使用される場合、ＮＳＣＬＣおよび正常試料の結果は、互いに有意に異なる。いくらかの重なりが存在するにもかかわらず、ＮＳＣＬＣ試料は、細胞株対照にフィッティングしたとき、非がん試料より有意に大きい、ＡＣＴＢとＦＰＲ１の比およびＨＮＲＮＰＡ１とＦＰＲ１の比を一貫して示す。

細胞株対照ではなく合成ＲＮＡ標準物質が使用される場合、同様の結果が得られるが、重なりの程度は、実質的に減少している。この重なりの減少は、連続希釈液の数の低減（６〜３）から生じる標準物質中の変動性の減少に起因する。連続希釈の各ステップは、誤差を導入し得る。図２Ｂでは、単純な線を引いて、ＮＳＣＬＣ結果のすべてから、正常な合成標準物質の結果の比の１つを除くすべてを分離することができる。

結果は、タイプ＃１マーカーの線形結合と、タイプ＃２マーカーの線形結合との間の単一の比として解釈することもできる。決定規則により、所与の閾値を超える任意のスコアは、がんを示し、一方、閾値未満のスコアは、がんがないことを示すと言明することができる。合成標準物質は、各マーカーの係数が１であり、スコアが、スコア＝ＦＲＰ１／（ＡＣＴＢ＋ＨＮＲＮＰＡ１）として計算されるように設計することができる。

例えば、上記リストから選択される遺伝子の転写物蓄積値を、試料から求め、一般に得られる値の範囲に及ぶ一連の合成標準物質（すなわち、連続希釈系列での）から求められるレベルと比較することができる。各遺伝子について、患者試料から求められる転写物蓄積レベルは、合成標準鋳型に対して回帰分析を実施して、各遺伝子の蓄積レベル値にフィッティングすることによって求められる転写物蓄積レベルと比較される。回帰値およびフィット値は、各遺伝子について個々に得られる。追加の分析（すなわち、比の計算）は、フィット値が得られた後、行うことができる。

これらのスコアは、閾値値と比較することができ、その結果、閾値を超えるスコアは、患者試料によって示される場合、肺がんのリスクの高まりを示す。

この計算が１／２の閾値を用いて使用される場合、それは、図２Ｂ中に引いた線を使用することと同じであることが容易に分かる。各標準物質の正確な濃度、係数、および閾値は、がん患者およびがんのない患者の両方から小セットの試料に対するデータを収集し、次いで線形モデルを使用してこれらを分離することによって求めることができる。線形モデルは、統計的方法、例えば、ロジスティック回帰、もしくは、線形カーネル関数を用いるサポートベクターマシンなどを介して生成することができ、または線形モデルは、検査によって生成することができる。

排他的な基準を施行することができ、その結果、排他的な基準を満たすいずれの試料も結果が報告されない。これらの排他的な基準は、記載した実施形態の１つの前または後に実施される他の試験を含むことができる。排他的な基準は、試験自体の結果に基づく場合もある。例えば、いくつかの実施形態では、非常に低い量のマーカーは、劣化した試料を示し、ＡＣＴＢとＨＮＲＮＰＡ１のものなどの２つの蓄積レベル間の予想外に大きい比は、例えば、汚染物質が存在することを示し得る。いくつかの実施形態では、ＡＣＴＢとＨＮＲＮＰＡ１の比が、遺伝子の蓄積レベルの中央値の比と比較して１０、５、４、３、または２倍超異なる場合、試料は除外される。もっともらしい汚染源の一例は、血漿試料中のリンパ球のものである。

いくつかの実施形態では、本方法は、統計的距離の決定をする場合がある。がん細胞由来のｃｆＲＮＡは、高度に希釈されている場合があるので、相対的存在量の有意な変化を判定するための方法が必要とされ得る。この理由で、いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＯＣ曲線によってのみ求められる固定カットオフとは対照的に、結果間の統計的距離に基づいてアッセイ結果（すなわち、陽性または陰性の結果）を判定する。

特異性に基づいて、結果を群（高信頼度、低信頼度など）に分けることができる。この数値は、信頼度に関する数値スコアを作るために、いくつかの単純な式によって変換することもできる。

いくつかの実施形態では、本方法は、人口統計学的な、または生活様式の属性（複数可）と組み合わせて、ＲＮＡ発現の結果に基づいて患者に存在するがんのタイプを予測するためのモデルおよびデリベーションを伴う場合がある。

いくつかの実施形態では、ｃｆＲＮＡレベルは、配列決定技術を使用してアッセイすることができる。配列決定技術の例としては、それだけに限らないが、１種または複数の技術、例えば、ピロシーケンシング、例えば、「４５４」法（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（２００５）、Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ ｒｅａｃｔｏｒｓ．、Ｎａｔｕｒｅ、４３７：３７６〜３８０；Ｒｏｎａｇｈｉら（１９９６）、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４２：８４〜８９）、「Ｓｏｌｅｘａ」またはＩｌｌｕｍｉｎａ型配列決定（Ｆｅｄｕｒｃｏら（２００６）、ＢＴＡ，ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｇｌａｓｓ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｃｏｌｏｎｉｅｓ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４、ｅ２２；Ｔｕｒｃａｔｔｉら（２００８）、Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３６、ｅ２５）、ＳＯＬｉＤ配列決定技術（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．ら（２００５）、Ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｏｎｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅｖｏｌｖｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９、１７２８〜１７３２；ＭｃＫｅｒｎａｎ，Ｋ．ら（２００６）、Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．、米国特許出願第２００８０００３５７１号）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ技術（Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｄ．ら（２００８）、Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０、１０６〜１０９）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（Ｒｏｔｈｂｅｒｇら（２０１１）、Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｄｅｖｉｃｅ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｎｏｎ−ｏｐｔｉｃａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．、Ｎａｔｕｒｅ、４７５、３４８〜３５２）、ＳＭＲＴ配列決定技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＧｒｉｄＩＯＮ ｎａｎｏｐｏｒｅ−ｂａｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｔｈｅ−ｇｒｉｄｉｏｎ−ｓｙｓｔｅｍ／ｔｈｅ−ｇｒｉｄｉｏｎ−ｓｙｓｔｅｍ）などがある。いくつかの実施形態では、ＳｈｅｎｄｕｒｅおよびＪｉ、「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２６（１０）：１１３５〜１１４５（２００８）に記載された、または当業者に利用可能な他の当技術分野における任意の数のいわゆる「次世代」ＤＮＡ配列決定法を使用することができる。ＤＮＡ配列を決定するための他の方法も当技術分野で公知であり、本明細書に開示の実施形態は、任意の他の方法を除外して、特定の遺伝子座における塩基同一性を判定する任意の特定の方法に限定されない。

いくつかの実施形態では、ｃｆＲＮＡレベルは、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、ｎＣｏｕｎｔｅｒ、または同様のものを介してアッセイすることができる。例えば、差次的発現試験において一般に使用されるアレイの一クラスとしては、マイクロアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイがある。これらのアレイは、基板上に直接合成される多数のプローブを利用し、相補的ハイブリダイゼーションの原理に基づいて、複雑なＲＮＡまたはメッセージ集団を調べるのに使用される。一般に、これらのマイクロアレイは、対象とする遺伝子またはヌクレオチド配列の選択された領域に及ぶ比較的小さい長さ（２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒ）の１６〜２０のオリゴヌクレオチドプローブ対のセットを提供する。オリゴヌクレオチドアレイ中で使用されるプローブ対は、同じＲＮＡまたはメッセージ鎖にハイブリダイズするように設計されたパーフェクトマッチおよびミスマッチプローブも含み得る。パーフェクトマッチプローブは、対象とするメッセージと完全に相補的である公知の配列を含有し、一方、ミスマッチプローブは、これがパーフェクトマッチプローブと異なる少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含有することを除いて、その配列に関してパーフェクトマッチプローブと同様である。発現分析の間に、試料ヌクレオチド集団由来のメッセージのハイブリダイゼーション効率が、多くのメッセージの発現レベルを同時に確証および定量化するために、パーフェクトマッチおよびミスマッチプローブに関して評価される。いくつかの実施形態では、遺伝子アレイ全体が、マイクロアレイにプリントされる。いくつかの実施形態では、ＦＰＲ１、ならびにＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１の少なくとも１つを含む遺伝子のサブセットがマイクロアレイ上に含まれる。いくつかの実施形態では、マイクロアレイは、少なくともＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１を含む。

Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供されるｎＣｏｕｎｔｅｒなどのデバイスを、例えば、分析を促進するのに使用することができる。ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システムは、完全自動分取ステーション、デジタル分析器、ＣｏｄｅＳｅｔ（分子バーコード）、ならびに分析を実施するのに必要とされる試薬および消耗品のすべてを備える総合システムである。ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムでの分析は、溶液内ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後処理、デジタルデータ取得、および１つの単純なワークフローにおける正規化からなる。いくつかの実施形態では、プロセスは、自動化されている。いくつかの実施形態では、バーコードプローブの受託開発セットまたは予め設計されたセットを、前記分析の一部として、システム制御の包括的なセットと予め混合することができる。

本方法を実施するのに必要なｃｆＲＮＡ転写物蓄積レベルデータを得るため、および本明細書に開示の組成物およびキットを用いて使用するためのいくつかの方法およびデバイス、ならびにどの単一のデータ蓄積法またはデバイスも、限定的であると見られるべきでない。

実施例１
非小細胞肺がん（「ＮＳＣＬＣ」）を有することが分かっている患者、およびいずれの既知の肺がんも有さない患者（推定的に「がんのない」個体）から血漿を収集した。いずれの既知の肺がんも有さない患者が、実際には、他に未検出のがんを有し得るいくらかの可能性がある。これらの患者の存在は、この試験についての偽陽性率の過大評価をもたらすことになる（「健康な個体」からの「偽陽性」は、実際に、これらの個体におけるがんの存在を代表し得るため）。橙色または濁度などの明らかな問題を有していた血漿を除去した後、２５のがんのない血漿試料および２６のＮＳＣＬＣ血漿試料が残った。２６人のＮＳＣＬＣ患者から、がんの以下の病期が存在した：８人の病期Ｉ、６人の病期ＩＩ、５人の病期ＩＩＩ、および７人の未知の病期。血漿は、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ ＃５５１１４）で抽出した。定量的Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲを行うために、Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＃２０４４８４）を、ＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１の先に記載したプライマーおよびプローブとともに使用した。ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＃７４００００）を標準物質として使用し、回帰を使用して、試料中の各遺伝子の量を推定した（図２Ａ）。７５超のＡＣＴＢ／ＨＮＲＮＰＡ１の比を有する試料を最終結果から排除し、「結果なし」の結果を割り当てた。以下の結果が得られた。ｘ軸は、ＦＰＲ１／ＡＣＴＢの比であり、Ｙ軸は、ＦＰＲ１／ＨＮＲＮＰＡ１の比であることに留意されたい。

図１Ａに示したように、ユニバーサルヒト参照ＲＮＡ内で測定した蓄積レベルに対して正規化したＦＰＲ１の中央値蓄積レベルは、正常患者集団と腫瘍患者集団との間で約１００倍異なった。同様に、正常な患者集団の２５％の四分位値の上限は、腫瘍患者集団についての測定値の７５％の四分位値の下限より計れる程度に下であった。最高の最も希有な、極端な、正常な測定値は、場合によっては、腫瘍患者の中央値と同じ高さであったが、それより高くはなかった。

この結果は、ＦＰＲ１の循環遊離ＲＮＡレベルを測定すると、患者におけるがんの存在を予測することが可能になることを示す。

図１Ｂに示したように、ＡＣＴＢの中央値蓄積レベルは、正常患者集団と腫瘍患者集団との間で有意に異ならなかった。２５％〜７５％の四分位値範囲において、および正常患者集団と腫瘍患者集団との間の蓄積レベルの極端な異常値の中で実質的な重なりもあった。

同様に、図１Ｃにおいて、ＨＮＲＮＰＡ１の中央値蓄積レベルは、正常患者集団と腫瘍患者集団との間で有意に異ならなかった。２５％〜７５％の四分位値範囲において、および正常患者集団と腫瘍患者集団との間の蓄積レベルの極端な異常値の中で実質的な重なりもあった。

この結果は、サブセット＃２構成要素としての、または参照標準としてのＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１の適性を実証する。

図２Ａに示したように、細胞株対照を使用したとき、腫瘍試料および正常試料の結果は、互いに有意に異なっていた。いくらかの重なりの存在にもかかわらず、ＮＳＣＬＣ試料は、一般に、細胞株対照について得られる対応する値より有意に大きいＦＰＲ１とＡＣＴＢ比およびＦＰＲ１とＨＮＲＮＰＡ１の比を一貫して示した。

この実験は、ＦＰＲ１の循環遊離ＲＮＡレベルを、ＨＮＲＮＰＡ１またはＡＣＴＢの循環遊離ＲＮＡレベルと比較すると、患者におけるがんの存在を予測することが可能になることを示す。

実施例２
６つのＮＳＣＬＣ患者試料および７つの正常患者試料の第２のセットを、実施例１で論じたものと同様のプロトコールを使用してアッセイした。２つの技術的改変を行った：血漿を、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＤＳＰ Ｖｉｒｕｓ／Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ９３７０５５）を介して抽出し、上述した合成標準物質を使用した。曇りまたは変色などの明らかな問題についてスクリーニングした後、追加の試料を除外した。各遺伝子のフィット値の比を求めた。これらを図２Ｂに示す。Ｘ軸およびＹ軸は、先に記載したのと同じ比である。

図２Ｂに示したように、合成標準物質を使用したとき、ＮＳＣＬＣ試料および正常試料の結果は、互いに有意に異なっていた。ＮＳＣＬＣ試料は、がんのない個体から得られる血漿について得られる対応する値より有意に大きいＡＣＴＢとＦＰＲ１の比およびＨＮＲＮＰＡ１とＦＰＲ１の比を一貫して示した。単純な線を引いて、ＮＳＣＬＣ結果のすべてから、正常な合成標準物質結果の比の１つを除くすべてを分離することができる。

ＮＳＣＬＣ群とがんのない群との間により広いギャップが存在するように最初に思われ得るが、これは、より少ない数の点に起因し得る。存在する点がより少ないので、極端な値の可能性はより低い。変動性のいくらかの低減は、合成標準物質の創製において使用したより少ない数の希釈にも起因し得る。これは、標準物質中で各遺伝子の濃度を個々に微調整する能力によって可能になる。

実施例３
肺がんを有すると疑われる患者から血漿を収集した。前記患者のｃｆＲＮＡ集団中のＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１転写物の蓄積レベルを、上述したように、患者の血漿から求めた。患者のＦＰＲ１蓄積レベルを、健康な個体およびがんを有する個体と対応することが知られているレベル、例えば、図１Ａに示した蓄積レベルと比較した。健康な個体およびがん陽性個体のｃｆＲＮＡ中のＦＰＲ１蓄積の他の参照尺度も使用することができる。１００の任意値を各遺伝子の標準物質の完全濃度に割り当て、検量線を作るのに使用した２つの追加の希釈液は、１０および１の任意単位であった。試料１７１は、ＮＳＣＬＣを有することが分かっている患者から収集した。１８．１４、２６．６４、および５．３８の値が、それぞれ、ＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１について得られた。スコアは、１８．１４／（２６．６４＋５．３８）＝０．５６７が得られたと計算された。この値は、０．５より大きいので、ＮＳＣＬＣについての陽性結果が得られた。

がんの証拠をまったく有さない患者１６４から血漿を収集した。ＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１の転写物蓄積レベルを上記のように得た。３．５３、１２．２、および２．８７の値が、それぞれ、ＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１について得られた。スコアは、３．５３／（１２．２＋２．８７）＝０．２３４が得られたと計算されている。この値は、０．５より小さいので、ＮＳＣＬＣについての陰性結果が得られた。

この実験は、ＦＰＲ１、ＡＣＴＢ、およびＨＮＲＮＰＡ１の循環遊離ＲＮＡレベルを判定すると、患者におけるがん、特に肺がんの存在を予測することが可能になることを示す。

実施例４
肺がんを有すると疑われる患者から血漿を収集する。前記患者のｃｆＲＮＡ集団中のＦＰＲ１転写物の蓄積レベルを、上述したように、患者の血漿から判定する。患者のＦＰＲ１蓄積レベルを、健康な個体およびがんを有する個体と対応することが知られているレベル、例えば、図１Ａに示した蓄積レベルと比較する。健康な個体およびがん陽性個体のｃｆＲＮＡ中のＦＰＲ１蓄積の他の参照尺度も使用することができる。レベルは、１ｍＬ当たり６０，０００ＦＰＲ１分子であることが判明し、これは、腫瘍患者について観察される中央値蓄積レベルに対応するが、正常な患者についての極端な最高測定値以上である。

このＦＰＲ１蓄積レベルは、ＮＳＣＬＣ細胞集団が患者中に存在するという高い信頼度を示す。

肺がんを有すると疑われる第２の患者から血漿を収集する。前記患者のｃｆＲＮＡ集団中のＦＰＲ１転写物蓄積レベルを、上記のように判定および比較する。レベルは、１ｍＬ当たり６００ＦＰＲ１分子であることが判明し、これは、正常患者について観察される中央値蓄積レベルに対応するが、腫瘍患者についての極端な最低測定値以下である。このＦＰＲ１蓄積レベルは、患者は、本方法によって検出可能ながん性または前がん性細胞集団がないということを高い信頼度で示す。

この実験は、ＦＰＲ１の循環遊離ＲＮＡレベルを判定すると、患者におけるがんの存在を予測することが可能になることを示す。

Claims (29)

1. 人におけるがんの存在および前がん性細胞の存在についてアッセイする方法であって、
   がんを有する疑いのある患者由来の生体試料を準備するステップと、
   該生体試料中のホルミルペプチド受容体遺伝子由来の核酸の循環遊離レベルを測定するステップと、
   該ホルミルペプチド受容体遺伝子の該測定レベルを、健康な人における該遺伝子の既知のレベルと比較するステップとを含み、レベルの増大が該患者におけるがんの存在を示す方法。
2. 前記ホルミルペプチド受容体遺伝子がＦＰＲ１である、請求項１に記載の方法。
3. 前記比較ステップが、前記遺伝子の前記循環遊離レベルを反映するコンピューター値中で電子的に比較することを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記試料が血液成分を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記血液成分が血漿を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記測定ステップが、標準物質に対して前記転写物蓄積レベルを正規化することを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記標準物質が合成標準物質である、請求項６に記載の方法。
8. 前記標準物質が、標準細胞株から抽出されたＲＮＡを含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記測定ステップが、前記遺伝子レベルを、がん状態と独立して安定レベルで存在することが分かっている第２の集団の核酸の循環遊離レベルと比較することを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記がんが肺がんである、請求項１に記載の方法。
11. 前記がんが非小細胞肺がんである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記循環遊離核酸が循環遊離リボ核酸を含む、請求項９に記載の方法。
13. 前記循環遊離核酸が、循環遊離メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 患者におけるがんの存在を判定するためのキットであって、
    生体試料由来のホルミルペプチド受容体遺伝子（ＦＰＲ１）遺伝子に対応する循環遊離ＲＮＡを増幅するための増幅プライマーを含む容器を含むキット。
15. 前記増幅プライマーが、順方向プライマー：5’ TGACGGTGAGAGGCATCA 3’(配列番号1)逆方向プライマー：5’ GGTGGCAATAAGCCCATAACTG 3’(配列番号3)の核酸配列を有する、請求項１４に記載のキット。
16. 人におけるがんの存在および前がん性細胞の存在についてアッセイするための方法であって、
    肺がんを有すると疑われる患者由来の血液または血液成分を含む試料を準備するステップと、
    該試料中のホルミルペプチド受容体遺伝子由来の核酸の循環遊離レベルを測定するステップと、
    該ホルミルペプチド受容体遺伝子の該測定レベルを、第２の遺伝子の少なくとも１種の参照循環遊離核酸と比較するステップであって、循環遊離ホルミルペプチド受容体遺伝子のレベルと該参照遺伝子のレベルの比が、該患者における肺がんの存在を示すステップとを含む方法。
17. 前記試料が血漿を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ホルミルペプチド受容体遺伝子がＦＰＲ１である、請求項１６に記載の方法。
19. 前記第２の遺伝子の前記参照循環遊離核酸が、アクチンＢ（ＡＣＴＢ）由来の循環遊離ＲＮＡレベルを含む、請求項１６に記載の方法。
20. 前記第２の遺伝子の前記参照循環遊離核酸が、ＨＮＲＮＰＡ１の循環遊離ＲＮＡレベルを含む、請求項１６に記載の方法。
21. 前記参照循環遊離核酸が、ＡＣＴＢおよびＨＮＲＮＰＡ１の両方の循環遊離ＲＮＡレベルを含む、請求項１６に記載の方法。
22. 前記核酸蓄積レベルが、合成参照標準物質に対して正規化される、請求項１６に記載の方法。
23. 前記合成参照標準物質が、患者試料中の予期される蓄積レベルの一桁以内の濃度で鋳型核酸を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記合成核酸が、患者試料中のアッセイされる少なくとも２種の転写物に対応する鋳型核酸を含み、それぞれの前記参照核酸集団が、患者試料中の対応する転写物の予期される蓄積レベルの一桁以内の濃度で存在する、請求項２３に記載の方法。
25. 人における状態の存在についてアッセイするための方法であって、
    肺がんを有すると疑われる患者由来の血液または血液成分を含む試料を準備するステップと、
    該試料中のＨＮＲＮＰＡ１由来の核酸の循環遊離レベルを測定するステップと、
    ＨＮＲＮＰＡ１の該測定レベルを、第２の転写物由来の核酸の循環遊離レベルと比較するステップであって、該第２の循環遊離転写物のレベルが該状態を示すステップとを含む方法。
26. 前記状態が、前記患者におけるがんの存在または前がん性細胞の存在である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記第２の転写物がＦＰＲ１である、請求項２６に記載の方法。
28. 発現分析のための標準物質を創製するための方法であって、
    第１の合成ＲＮＡ鋳型配列を選択するステップと、
    第２の合成ＲＮＡ鋳型配列を選択するステップと、
    生体試料中の該第１の合成ＲＮＡ鋳型配列を含む転写物および該第２の合成ＲＮＡ鋳型配列を含む転写物の予期される濃度の推定値を得るステップと、
    組成物中の該第１の鋳型配列および該第２の鋳型配列を合わせ、その結果、それぞれの該鋳型配列の濃度が、未知の試料中のそれぞれの該配列の予期される濃度に対応するステップとを含む方法。
29. 血漿に由来する核酸試料の品質を評価するための方法であって、
    該試料中のＡＣＴＢ転写物蓄積レベルを測定するステップと、
    該試料中のＨＮＲＮＰＡ１レベルを測定するステップと、
    該ＡＣＴＢ蓄積レベルと該ＨＮＲＮＰＡ１蓄積レベルを比較するステップと、
    該蓄積レベルが、該遺伝子間の中央値比より５倍超異なる場合、該試料を廃棄するステップとを含む方法。

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