CN107002132A - 循环无细胞rna用于诊断和/或监测癌症的用途 - Google Patents

循环无细胞rna用于诊断和/或监测癌症的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于使用无细胞RNA改良对可用于诊断和/或监测癌症的罕见细胞和/或种类的检测的组合物、方法和系统。本发明还提供用于对癌症疗法具有抗性和/或正产生抗性的细胞的早期检测的组合物、方法和系统。

Description

循环无细胞RNA用于诊断和/或监测癌症的用途
相关申请案的交叉参考
本申请主张2014年11月14日申请的美国临时专利申请案62/080,022、2015年9月4日申请的申请案62/214,756和2015年9月28日申请的申请案62/233,935的权益，所述申请的内容是全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及无细胞核酸、具体来说无细胞RNA用于诊断和/或监测各种类型的癌症的用途。
背景技术
自从1940年代末就已知并研究无细胞(cf)核酸(DNA和RNA)在人类血液中的存在。但这些分子被释放到血流中的机制仍未完全明确。这可能是不同组织的细胞凋亡和细胞坏死的结果，或者在RNA情形中，核酸可含于分泌到血液中的囊泡中并免受RNase侵袭。最近已有力地证实了无细胞DNA(cfDNA)在诊断癌症和监测癌症治疗反应二者的能力中的效用。最近在基于PCR的定序技术(例如次世代定序)中的发展已使得可能检测cfDNA中的突变并且由此鉴别癌症倾向突变以及癌症驱动突变。习用肿瘤组织生检通常由于逻辑或医学原因而无法获得。在无法获得来自转移癌症患者的肿瘤组织样本时，液体生检(例如，血液)提供可快速实施的替代品并且没有对转移病灶中的一个进行生检产生的疼痛、风险和费用(贝塔古德C(Bettegowda C)等人，早期和晚期人类恶性病中循环肿瘤DNA的检测(Detection ofCirculating Tumor DNA in Early-and Late-Stage Human Malignancies).科学转化医学(Sci Transl Med)2014；6,(224))。现在，获得血样与肿瘤组织生检相比相对便捷，使得可能容易地对肿瘤DNA进行连续分析，并且使得可能在肿瘤适应初始治疗并开始复发时追踪抗药性克隆的出现。那么对患者cfDNA的重新分析可能鉴别已经出现的新的癌症驱动突变，从而使得可设计新的导向疗法。
一个挑战是cfDNA分析的灵敏度–在多种情形中，由于无法检测cfDNA，无法在血液中发现存于肿瘤组织中的突变。因此，要解决的一个问题是改良检测方法，使得可检测低水平的无细胞核酸(例如无细胞RNA(cfRNA))，特别对于在所测试生物样品中占总体细胞群一小部分的罕见细胞群。实现增加对罕见细胞类型的灵敏度的解决方案特别可用于诊断和/或监测抗性细胞，例如那些在正产生对一或多种癌症药物的抗性的患有癌症的个体中发现的细胞。
另一个挑战是可用标准量的血浆完成的对罕见种类的灵敏检测通常是从患者收集。具有可检测cfDNA的患者的分率代表目前从所收集的量的血浆可获得的最大值。在低分泌情形中，可能会尝试使用越来越多的血浆来分离可检测cfDNA，然而，这种方法并不实用。因此，用于突变检测的方法的改良可容许分析更大百分比的肿瘤。
此外，目前，肿瘤是使用肿瘤生检来取样，这产生关于一个肿瘤位点的静态信息。一个肿瘤位点可能无法指示个体对癌症疗法的抗性状态。类似地，一个实时静态快照可能无法指示对癌症疗法的抗性的现有状态或其发展为所述抗性的可能性。需要对肿瘤进行取样的非侵入性方式，使得增加检测罕见种类的灵敏度。此外，这种方式还应该能在肿瘤演变到针对癌症疗法的潜在抗性阶段时提供关于所述肿瘤的动态信息。本说明书中描述的本发明提供上述所有益处并且还提供其它益处。
在说明书通篇中，引用多个出版物、专利、专利申请案和其它参考文献。出于所有目的，所有这些出版物、专利、专利申请案和其它参考文献都是全文以引用方式并入。
发明内容
本发明尤其提供用于改良对无细胞核酸、特别无细胞RNA(cfRNA)的检测的组合物、方法和系统，其用于鉴别可用于诊断和/或监测各种类型的癌症的罕见种类。
因此，在一方面中，本发明提供用于在来自患有或怀疑患有癌症的个体的生物样品中鉴别一或多种与癌症相关的生物标记物的方法，所述方法包含：(a)使用固体载体从所述生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；(b)在RNA位于所述固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；(c)从所述固体载体洗脱RNA至少一次；(d)将所述RNA逆转录为cDNA；(e)使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与癌症相关的生物标记物的引物反应；和(f)测定所述生物样品中是否存在一或多种生物标记物，其中所述生物标记物的存在鉴别该个体是否具有一或多种与癌症相关的生物标记物。在一些实施例中，使步骤(c)的洗脱物通过相同柱进行双重洗脱。在其它实施例中，生物样品是来自患有癌症或怀疑患有癌症的个体的血浆。在其它实施例中，血浆在与RNA稳定剂相互作用的7天内进行处理。在其它实施例中，在步骤(d)使用随机六聚体将RNA逆转录为cDNA。在其它实施例中，生物标记物是选自由以下组成的群组的基因或融合转录物或基因表达中的突变：PD-L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c-Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2、PIK3CA、KIT、GNAQ和GNA11。在其它实施例中，癌症选自由以下组成的群组：癌症、肺癌、黑色素瘤、胃癌、食管癌、乳癌、卵巢癌、肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、胃肠质瘤(GIST)和胰脏癌。
在其它方面中，本发明提供增加在来自患有癌症或怀疑患有癌症的个体的生物样品中检测无细胞RNA(cfRNA)中的一或多种与对化学疗法的抗性相关的体细胞突变的灵敏度的方法，所述方法包含：(a)使用固体载体从所述生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；(b)在RNA位于所述固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；(c)从所述固体载体洗脱RNA至少一次；(d)将所述RNA逆转录为cDNA；(e)使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与抗性相关的体细胞突变的引物反应；和(f)测定一或多种体细胞突变是否存在于所述生物样品中，其中所述体细胞突变的存在鉴别所述个体是否具有一或多种与对化学疗法的抗性相关的体细胞突变。
在其它方面中，本发明提供测定个体患有癌症或怀疑患有癌症的可能性，所述方法包含：(a)从来自所述个体的生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；(b)在RNA位于所述固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；(c)从所述固体载体洗脱RNA至少一次；(d)将所述RNA逆转录为cDNA；(e)使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与癌症相关的生物标记物的引物反应；和(f)检测一或多种与癌症相关的生物标记物是否存在于所述生物样品中，其中所述生物标记物的存在测定所述个体患有癌症的可能性。
在其它方面中，本发明提供帮助诊断个体患有癌症或怀疑患有癌症的可能性的方法，所述方法包含：(a)从来自所述个体的生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；(b)在RNA位于所述固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；(c)从所述固体载体洗脱RNA至少一次；(d)将所述RNA逆转录为cDNA；(e)使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与癌症相关的生物标记物的引物反应；和(f)检测一或多种与癌症相关的生物标记物是否存在于所述生物样品中，其中所述生物标记物的存在帮助诊断所述个体患有癌症的可能性。
在任一实施例中，使步骤(c)的洗脱物通过相同柱进行双重洗脱。在任一实施例中，所述生物样品是来自患有癌症或怀疑患有癌症的所述个体的血浆。在其它实施例中，血浆在与RNA稳定剂相互作用的7天内进行处理。在任一实施例中，在步骤(d)中使用随机六聚体将所述RNA逆转录为cDNA。在任一实施例中，体细胞突变是选自由以下组成的群组的基因或融合转录物或基因表达：PD-L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2、PIK3CA、KIT、GNAQ和GNA11。在任一实施例中，生物标记物是选自由以下组成的群组的基因或融合转录物或基因表达中的突变：PDLAR-V7、-1、PD-L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c-Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2、PIK3CA、KIT、GNAQ和GNA11。在任一实施例中，癌症选自由以下组成的群组：癌症、肺癌、黑色素瘤、胃癌、食管癌、乳癌、卵巢癌、肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、胃肠基质瘤(GIST)和胰脏癌。
附图说明
图1显示来自从结肠癌患者血浆提取的无细胞RNA的ERCC1和KRAS相对于β肌动蛋白的相对表达。
图2显示来自结肠癌患者血浆的ERCC1表达。
图3显示在KRAS的预期频率和拷贝数分析中对G12D和G12V KRAS突变的各种等位基因分率的DNA分析。
图4显示对患者的KRAS G12D突变的分析。从无细胞DNA测定的特定KRAS突变反映于来自相同患者的RNA中。
图5显示使用数字PCR对患者的KRAS G12D突变的分析。使用不同平台再次验证G12D KRAS突变。图中按顺时针顺序从左上描绘若干个群体：(1)KRAS G12D突变体PCR扩增，(2)KRAS G12D突变体和野生型PCR扩增，(3)KRAS野生型PCR扩增，和(4)无PCR扩增。
图6显示RNA与DNA之间的信号的联系。发现来自从结肠癌患者血浆提取的逆转录mRNA(cDNA)的中值PCR信号比相应DNA高大约7倍。
图7显示使用柱cDNA提纯方法的结果。RNA信号相对于DNA进一步增强。RNA的产率比DNA高约60倍。
图8显示在非小细胞肺癌(NSCLC)患者与健康对照组之间相对PD-L1表达的结果。
图9显示在NSCLC患者与健康对照组之间相对ERCC1表达的结果。
图10显示来自NSCLC患者和健康对照组的总核酸(来自通过中值归一化的β-肌动蛋白CT的ctRNA)的结果。
图11显示DNA与mRNA之间的信号的联系。中值DNA信号为59.63ng/5mL(在5.88–2016.0ng/5mL范围内)。中值mRNA信号为608.49ng/5mL(在111.1–6312.02ng/mL范围内)。
图12显示特定患者中相对KRAS G12D表达的结果。表达是使用β-肌动蛋白作为参照，通过对KRAS G12D的PCR分析来测量。
图13A显示在治疗前在高反应和无反应患者中对于无细胞RNA(cfRNA)的治疗前PD-L1表达。图13B显示在有反应的患者中在疗程期间cfRNA中PD-L1表达的预期降低。
图14A显示在结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌专利(NSCLC)和健康个体中，PD-L1基因表达的相对频率，17.4％的CRC患者、50％的NSCLC患者和0％的健康个体的PD-L1表达相对增加。图14B显示，相对PD-L1基因表达水平在PD-L1阳性CRC患者与NSCLC患者之间类似。
图15A显示在用瑞格菲尼(Regorafenib)/西妥昔单抗(Cetuximab)治疗结肠直肠癌的整个治疗期间，监测KRAS G12V的cfDNA的等位基因分率的增加。图15B显示，在用瑞格菲尼/西妥昔单抗治疗结肠直肠癌期间，在疗程中，cfRNA中PD-L1的相对表达随时间而降低。图15C显示在用瑞格菲尼/西妥昔单抗治疗结肠直肠癌期间，ERCC1随时间的相对表达。
图16显示在用克唑替尼(crizotinib)和FOLFOX治疗期间，对于PD-L1、ERCC1和KRAS G12D，来自结肠直肠癌患者的cfRNA的相对基因表达。
图17显示在用FOLFIRI/贝伐珠单抗(Bevacizumab)和瑞格菲尼/西妥昔单抗治疗期间，对于ERCC1和KRAS G12D，来自结肠直肠癌患者的cfRNA的相对基因表达。
图18显示在具有KRAS(红色)、NRAS(绿色)、BRAF(黄色)或无(蓝色)突变的患者中，ERCC1的相对表达。
图19显示在患有胃癌的患者中，在无细胞RNA中监测的PD-L1和HER2的相对表达。
具体实施方式
本发明尤其提供用于改良对无细胞核酸、特别无细胞RNA(cfRNA)的检测的组合物、方法和系统，其用于鉴别可用于诊断和/或监测各种类型的癌症的罕见种类。出于在本文中进一步详述的原因，在多个实施例中，RNA种类可比DNA种类更佳地用于诊断和/或监测各种类型的癌症。检测RNA的主要种类的能力通常众所周知。然而，以增加的灵敏度检测RNA的次要(或罕见)种类的能力是迄今尚未有效解决的问题。
通常，公认RNA难以用于临床和实验室环境中。多个参考文献记载了RNA降解问题和处理加工RNA的挑战。本文揭示的本发明克服这些现有挑战并提供多种以灵敏、快速、准确的方式检测罕见RNA种类的方式，并且提供关于动态诊断和/或监测(而不是静态诊断和/或监测)的有用信息。
一般技术
除非另外指明，否则本发明的实践将采用分子生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的习用技术，这些技术为所属领域技术人员所熟知。所述技术全面解释于文献中，例如分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第4版(桑布鲁克(Sambrook)等人，2012)和分子克隆：实验室手册，第3版(桑布鲁克和拉塞尔(Russel),2001)，(在本文中合称为“桑布鲁克”)；分子生物学现行规范(CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人，(编辑).,1987，包括2014年的增刊)；PCR：聚合酶链式反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)(穆利斯(Mullis)等人，(编辑).,1994)；抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(格林菲尔德(Greenfield)(编辑).,2014)，博卡吉(Beaucage)等人(编辑).,核酸化学现行规范(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry),约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)，纽约,2000,(包括2014年的增刊)以及哺乳动物细胞中的基因转移和表达(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells)(马克里德斯(Makrides)(编辑).,爱思唯尔科学B.V.(Elsevier Sciences B.V.),阿姆斯特丹,2003).
定义
在本文中除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域技术人员一般所理解相同的含义。
如本文所用术语“生物样品”涵盖从个体(例如，患者)取得的任何样品。生物样品的实例包括但不限于血液、血浆、组织样品、血清和体液。
如本文所用术语“蛋白质”包括多肽、肽、多肽片段和融合多肽。
除非上下文另外明确指明，否则如本文所用单数术语“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括复数参照。
在本说明书通篇中给出的每个最大数字限值打算包括每个较低数字限值，如同所述较低数字限值明确书写于本文中一般。在本说明书通篇中给出的每个最小数字限值将包括每个较高数字限值，如同所述较高数字限值明确书写于本文中一般。在本说明书通篇中给出的每个数字范围将包括落在所述较宽数字范围内的每个较窄数字范围，如同所述较窄数字范围都明确书写于本文中一般。在列举数字范围时，则也打算包括落在所述范围内的数字，如同每个个别数字都明确书写于本文中一般。
用于增加RNA检测的组合物和方法
最初认为RNA非常不稳定，容易降解，并且因此在保护性细胞环境之外不可能稳定或可检测。尽管DNA含有一拷贝(或在扩增事件中若干个拷贝)的基因拷贝，但基因的转录可能产生所述基因的呈mRNA形式的多个拷贝。mRNA含有与DNA的转录区中相同的遗传信息，因此在两种分子中必然存在相同突变。那么理论上，如果基因转录100次，那么检测那个突变基因的灵敏度应该也增加100倍。cfRNA分析成功的一个决定子是血液中是否存在足够的肿瘤来源的cfRNA用于诊断分析，以及其是否可被容易并且顺利地分离。因此，根据本文所述的方法，可能获得结果，其中从循环核酸检测到的RNA比DNA多高达30-60倍。这可用于多种用途，一种用途是可在所得cDNA中检测肿瘤特异性突变。
如实例1中所例示，所属领域技术人员可根据以下方法检测无细胞RNA，特别是次要或罕见RNA种类。所属领域技术人员应该能够理解，可使用多种仍在本发明的范围内的取代和微小偏差。从患有癌症或怀疑患有癌症的个体获得生物样品(例如，血液)。在一些实施例中，患有癌症或怀疑患有癌症的个体是在一或多个医师照护下的患者。将生物样品与RNA稳定剂混合、接触、相互作用和/或用RNA稳定剂处理生物样品。可使用多种实例性RNA稳定剂。多种RNA稳定剂可用于本发明的组合物和方法中。可使用的一种用于样品收集、稳定化和无细胞血浆RNA转运的实例性标准化方法是来自斯特莱克(Streck)的无细胞RNA可使用的其它RNA稳定剂包括但不限于Biomatrica RNA Guard(拜耳马卡(Biomatrica))<http://www.biomatrica.com/rnagardblood_tube.php>；Paxgene血液RNA管(碧迪医疗(Becton Dickinson))<http://www.preanalytix.com/products/blood/RNA/paxgene-blood-rna-tube>；Tempus血液RNA管(生命技术(Life Tech))<http://www.lifetechnologies.com/order/，目录号/product/4342792>；以及用于血液/骨/骨髓的RNA/DNA稳定化试剂(罗氏(Roche))<http://lifescience.roche.com/shop/products/rna-dna-stabilization-reagent-for-blood-bone-ma rrow>。
可通过所属领域技术人员已知的多种方法(例如，离心、旋转等)将血浆与其它血液层分离。在一个实施例中，将血浆层从血沉棕黄层移除。分离的定时可在从个体抽取血液起的短时间段内。在一些实施例中，所述时间段在约1分钟、2分钟、3、4、5、6、7、8、9或10分钟内。在其它实施例中，所述时间段在约10-15分钟、15-30分钟、30-45分钟、45分钟–1小时、1-24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天内。其它血浆可冷冻并根据需要在不同时间使用。
在一些实施例中，在与RNA稳定剂相互作用的约1分钟、2分钟、3、4、5、6、7、8、9或10分钟内处理血浆。在其它实施例中，所述时间段在约10-15分钟、15-30分钟、30-45分钟、45分钟–1小时、1-24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天内。
然后从生物样品(例如血浆)提取核酸(例如，RNA)。可使用多种方法来提取RNA。可使用实例1中的实例性方案。可使用其它市售试剂盒来提取RNA。在一个实施例中，所述提取使用固体载体，例如柱。在一个实施例中，DNA可在柱上通过使用DNAse消化来消化。洗脱可通过所属领域技术人员已知的标准技术来进行。实例性方案可参见实例1。在一个实施例中，使来自柱的相同洗脱物再次通过相同柱以进行双重洗脱步骤。在另一实施例中，所述方法具有以下步骤的组合：使血液与RNA稳定剂接触、在从血液分离的3天内处理血浆、使用柱上DNAse消化和从柱洗脱RNA两次(或更多次)。
可通过所属领域技术人员已知的标准方法将所得RNA逆转录为cDNA。实例性方案可参见实例1。可使用随机六聚体。可在RNA转化为cDNA时进行RNA的进一步扩增，尤其任选地使用夹紧序列(例如ZIP核酸)，所述夹紧序列可添加到逆转录酶引物，以通过降低由于核酸的多阴离子性质所致的静电排斥，进一步增加寡核苷酸对其靶的亲和性。
所得cDNA可提纯并用于分析。可使用PCR和其它扩增技术来检测肿瘤和癌症专有的生物标记物、与肿瘤和癌症相关的基因和/或在癌症和肿瘤中见到的融合转录物。还可检测并量化与癌症相关的某些基因的基因表达，并用于预测、测定、诊断或帮助诊断癌症和肿瘤。
有多种重要的融合转录物是特定化学治疗剂的靶。这些融合转录物包括EML4-ALK、RET和ROS1的融合配偶体。基于血液的分析通过PCR测量DNA无法检测转录融合物。血液中mRNA的检测将增强监测患者的融合物检测(因为其对应于药物敏感性)和这些融合物中可产生对初始化学治疗方案的抗性以及对另一种方案的敏感性的特定突变的出现的能力。
可使用多种算法通过与内部对照(例如，β肌动蛋白、管家基因)比较来量化RNA的产率。在一个实施例中，可通过所关注基因的PCR循环阈值(Ct)(使用所述基因的特异性引物)减去稳定表达的管家基因(例如β肌动蛋白)的PCR循环阈值的差来测定所关注基因的相对表达。这种量化方法称为相对量化的δδCt方法。针对内源参照并相对于校准物归一化的靶的量是通过2-δ,δCt来给出。ABI用户公报(ABI User Bulletin)2期：ABI7700序列检测系统(ABI 7700Sequence Detection System)1997年12月11日(10/2001更新)<http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_040980.pdf.>例如，EML4-ALK融合物mRNA的相对表达可表示为常数(K)x2-(Ct(EML40ALK)-Ct(β肌动蛋白)
乘法器常数K设定为生成多个肺癌样品之间每个EML4-ALK融合物相对表达水平(2-(Ct(EML40ALK)-Ct(β肌动蛋白))的中值的整数。未知样品中EML4-ALK融合物的相对表达可通过比较未知样品与具有表达设定值的已知对照样品的结果来测定。如果将已知样品值设定为10并将K任意地设定为100，那么未知样品的相对表达X是根据下式来计算：
10＝K x 2-(Ct(EML40ALK)-Ct(β肌动蛋白)(已知δCt)
X＝K x 2-(Ct(EML40ALK)-Ct(β肌动蛋白)(未知δCt)
未知样品的相对表达＝×10x 2-未知δCt/2-已知δCt
对于每一PCR板运行，可调整乘法器K的值以针对已知样品的相对表达的PCR板间差异加以校对，使得已知样品的值严格保持在设定点10。
在另一实施例中，可使用采用将已知量的EML4-ALK融合物DNA片段掺入恒量的不含融合物的DNA中的PCR产物的标准曲线用作对照来比较未知样品的相对表达与具有已知EML4-ALK表达的对照。Y轴上已知样品的Ct相对于X轴上已知EML4-ALK对照的log10相对表达的曲线将生成通过以下方程描述的线性曲线：
Ct EML4-ALK＝斜率x X(Eml4-ALK的相对表达)+Y截距
针对X求解(未知样品的相对表达)
X＝相对表达未知样品＝(Ct未知样品–标准曲线的Y截距)/标准曲线的斜率
次要或罕见种类的量化
在本发明之一些方面中，本文所述的组合物和方法可用于量化无细胞核酸，特别是无细胞RNA。可针对RNA的主要以及次要种类实现量化。准确诊断所面对的挑战是检测RNA的次要(或罕见)种类，其可预测、诊断和/或帮助诊断对癌症疗法的抗性和/或指示突变体或抗性细胞的出现。在本发明之一些方面中，可检测的RNA的次要种类以野生型RNA的约0.01％至60％存在。在一些实施例中，可检测的RNA的次要种类以野生型RNA的至少约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％存在。在其它实施例中，可检测的RNA的次要种类以野生型RNA的至少约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％存在。在其它实施例中，可检测的RNA的次要种类以野生型RNA的至少约21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％存在。在其它实施例中，可检测的RNA的次要种类以野生型RNA的至少约31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％或40％存在。在其它实施例中，可检测的RNA的次要种类以野生型RNA的至少约41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％存在。在其它实施例中，可检测的RNA的次要种类以野生型RNA的至少约51％、52％53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％存在。在上文任何实施例中，可检测的RNA的次要种类以至多约为上文所指示的百分比中的任一者并且也在包括来自上文所指示的百分比中的任一者的下限与上限的组合的范围中存在。
使用无细胞RNA诊断和/或监测肿瘤
本文描述用于使用无细胞核酸、特别是无细胞RNA诊断和/或监测各种类型的癌症的组合物、系统和方法。cfRNA可用于诊断患有癌症或怀疑患有癌症的个体(例如，在医师照护下的患者)以测定其患有何种类型的癌症，和/或测定其是否具有任何与癌症相关的突变(即，癌症生物标记物)，和/或测定其是否具有(或正在产生)针对癌症疗法的抗性表型或抗性基因型。另外，本文所揭示的组合物、系统和方法可用于随时间(例如，纵贯性过程)监测个体以在抗性表型或抗性基因型出现时快速检测。诊断和/或监测的准确度和特异性可通过使用cfRNA来实现，其不易使用cfDNA实现。如本文中进一步描述，在患有癌症的个体与健康个体之间的cfRNA测量中所见的表达范围无重叠的统计学显著差异为检测(包括早期检测)癌症和监测癌症复发提供优势。根据需要，医师可采取适当步骤来解决出现的对癌症治疗药物或化合物的抗性。
血液DNA中突变检测的特异性可接近100％，也就是说，在血液DNA中发现的突变几乎总是反映从实际肿瘤组织获得的DNA中的突变。然而，一个问题在于，当前cfDNA分析的灵敏度通常小于100％；也就是说在多种情形中，由于检测不到cfDNA而无法在血液中发现肿瘤组织中存在的突变。例如，在一个研究中，cfDNA在>75％的患有晚期胰脏癌、卵巢癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胃食管癌、乳癌、黑色素瘤、肝细胞癌和头颈癌的患者中可检测，但在少于50％的原发性脑癌、肾癌、前列腺癌或甲状腺癌中可检测，而在患有局部肿瘤的患者中，分别在73％、57％、48％和50％的患有结肠直肠癌、胃食管癌、胰脏癌和乳腺癌的患者中检测到cfDNA(贝塔古德，2012)。
不受限于理论，cfDNA检测的缺乏可由于以下非限制性原因所致：1)一些癌症不分泌任何DNA到血流中，或2)所有肿瘤都分泌某种cfDNA，但一些肿瘤散发的DNA的量过小而无法被当前的技术所检测。不受限于理论，后一可能性可能是因为肿瘤的特征在于细胞快速周转，与其形成一样快地死亡，由此解释癌症患者血液中通常较高的核酸水平。此外，已知肿瘤的cfDNA分泌在极宽范围中变化。一个使用特殊设计的灵敏检测方法的研究在所有18名结肠直肠癌患者中发现cfDNA，其介于1.3到23,000个突变体模板/样品范围内(中值99个突变体模板/样品；在第10与第90百分位之间的范围，3-2,837)。这个研究得出结论，“大多数先前研究都没有使用足够灵敏的技术来检测在当前研究中评估的多个受试者中发现的低水平的cfDNA”(迪尔F(Diehl F)等人，用于评价肿瘤动力学的循环突变体DNA(Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics).自然医学(Nat Med.)2008；14:985–990)。
如本文所述，使用cfRNA提供机会来评价从DNA分析无法获得的潜在的有价值并且有用的信息。而mRNA表达在正常细胞中是高度调节的，其在朝向癌症的进展中变得逐渐失调。因此，不受限于理论，应该有多种在正常组织中不会大量表达的基因在肿瘤中大量表达。较早期研究显示，可在癌症患者的血清中检测到高水平的酪氨酸酶mRNA，但在非癌性个体中未检测到高水平的酪氨酸酶mRNA(库普斯基MS(Kopreski MS)等人患有恶性黑色素瘤 的患者的血清中肿瘤信使RNA的检测(Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma).临床癌症研究(Clin Cancer Res.)1999；8:1961-5)。与酪氨酸酶mRNA类似，其它肿瘤mRNA应该可在其它恶性病的血清和血浆中可显示。在另一研究中，通过定量PCR在来自88名患者和26名对照的血浆中测量胸腺嘧啶核苷酸合酶(TS)表达。在47％的患者的血浆中检测到TS mRNA，显示与健康对照的显著差异。值得注意，血浆中含有TS mRNA的患者比血浆中不含TS mRNA的患者在肿瘤组织中具有更高水平的TS。
因此，在一方面中，使用cfRNA的mRNA(基因表达)测量可用于检测一或多种癌症相关基因和/或等位基因和/或突变的异常表达。所述检测可用于诊断疾病的存在(或不存在)，或评价癌症的状态。在一个实施例中，无细胞mRNA水平与DNA相比较高。
“液体生检”使用末梢血获得关于实体恶性病中的遗传信息的及时信息，其含有来自所有癌症位点的动态DNA和RNA信息并且不仅限于生检区域。
在另一实施例中，基因表达还可用于监测化学疗法的过程。尽管DNA在变化方面主要是静态分子(也就是说，DNA中可需要长时间才出现新突变)，但基因表达中的变化可快速出现，大约在数天或甚至数小时内出现，并且可由此提供快速且灵敏的评价肿瘤中变化(例如由药物的效应带来的那些变化)的手段。罕见或异常转录物相对于正常或野生型转录物的相对表达值(增加、减少或静态水平)的连续性可在来自个体(例如，患者)的血浆中随时间测量。表达的向上或向下趋势可与特定化学治疗方案的患者结果相关联。
化学治疗方案可依癌症类型、阶段和患者遗传学而不同。化学疗法可针对特定肿瘤表型来调整。本发明方法可用于监测在治疗前、整个治疗期间和治疗后对特定化学治疗方案的反应。实例性化学治疗方案包括但不限于用尼沃鲁单抗(nivolumab)治疗PD-L1阳性癌症；用瑞格菲尼(Regorafenib)/西妥昔单抗(Cetuximab)治疗CRC；克唑替尼；FOLFOX；FOLFORI/贝伐珠单抗；和瑞格菲尼/西妥昔单抗。
在另一实施例中，本发明提供定量测定药物反应决定子基因的表达，其可预测药物的有效性并因此可用于作出治疗决定。例如，近期研究显示，晚期HER2阳性乳房肿瘤表达可变量的HER-2并且具有最高表达水平的患者从获得比具有较低表达的患者显著更佳的存活益处(巴泽多J(Baselga J)等人，在曲妥珠单抗艾坦辛(T-DM1)于HER2阳性转移乳癌中的III期研究EMILIA中肿瘤生物标记物与效能之间的关系(Relationshipbetween tumor biomarkers and efficacy in EMILIA,a phase III study oftrastuzumab emtansine(T-DM1)in HER2-positive metastatic breast cancer)，AACR2013；摘要LB-63)。此外，PIK3CA中的激活突变钝化抗HER-2药物(例如拉帕替尼(lapatinib))的效应，其对使用的疗法无影响。如果这些乳癌患者的HER-2的组织表达水平反映于其cfRNA中，那么可使用抽血而不是组织生检来获得关于HER-2表达以及PIK3突变状态的信息；(4)对于一些癌症相关生物标记物和/或基因(例如，Her-2)，拷贝数可变。这种变异仅可使用RNA来检测；和(5)DNA分析的另一问题在于，一些化学治疗剂靶向基因融合物的情形，其仅可从RNA分析并且无法在DNA中测量。这些靶的非限制性实例是基因融合物(例如，EML4-ALK、ROS1、RET)。根据另一实例，对于那些具有二次变化(如T790M介导的对EGFR抑制剂的抗性)的患者，不可逆酪氨酸激酶抑制剂(TKI)似乎是有前景的替代品。
来自正在进行治疗的患者的血浆的这些基因中每种变体或出现的抗性突变的表达的测量可对于最佳患者照护至关重要。仅在这些基因中的某些融合物或突变中具有活性的特异性药物可用于帮助患者快速准确地诊断这些基因融合物。对正在进行治疗的患者的重新生检对这些患者来说不实用。这可使用如本文中所述的cfRNA方法来实现。
因此，可根据本文所述方法测量的与对化学疗法的反应相关的基因的非限制性实例包括：EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、JAK2、ALK、PDGFRA、IDH1、IDH2和KIT。在本发明之一些方面中，生物标记物是选自由以下组成的群组的基因或融合转录物中的突变：PD-L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c-Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2、PIK3CA、KIT、GNAQ和GNA11。
在本发明之一些实施例中，个体患有或怀疑患有结肠直肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、黑色素瘤、胃癌、食管癌、乳癌、卵巢癌、肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、胃肠基质瘤(GIST)和胰脏癌。在其它实施例中，所检测和/或量化的基因列示于下表1中。
在其它实施例中，所检测和/或量化的基因和/或突变列示于下表2中。
肿瘤释放到血流中的无细胞DNA(cfDNA)容许非侵入性地鉴别初始肿瘤特异性突变。然而，并非肿瘤中的所有分子变化都涉及DNA突变；在多种情形中，特定基因的量(例如，基因表达)也很重要。在实施例中，使用释放到血液中的无细胞RNA(cfRNA)以监测癌症患者中的基因表达。在特定实施例中，PD-1/PD-L1路径是有前景的治疗靶，并且抗-L1药剂已在多种肿瘤类型中显示令人鼓舞的活性。
为评价特定基因(例如PD-L1)的细胞RNA数量，可将血浆从患者收集的血液分级分离。分级分离血液的方法为业内已知并且作为非限制性实例包括通过科恩(Cohn)方法(例如冷乙醇分级分离)、色谱或其组合分级分离。定量RT-PCR可与基因特异性引物一起用于量化特定基因。可将所关注基因的基因数量与健康志愿者相比较。如上文所述的持家基因(例如，β-肌动蛋白)可用作代表总RNA的分母基因。
所属领域技术人员可使用本文所述的揭示内容测量某些基因的表达用于检测和/或诊断癌症。如本文进一步所详述，一些癌症生物标记物在患有癌症的个体与健康个体之间显示cfRNA测量的统计学显著差异。患有癌症的个体与健康个体之间的表达范围无重叠容许多种用途，例如用于检测(包括早期检测)癌症和用于监测癌症的复发。
组合物、试剂盒和系统
本发明还提供用于实现高灵敏度检测的组合物，使得可检测出现的抗性突变。在一方面中，提供一种系统，其不仅包括用于分离生物样品(例如血浆)的试剂、RNA稳定剂、提取柱、洗脱溶液，还包括逆转录所需的试剂和对肿瘤/癌症生物标记物具有特异性的引物/探针。在一些实施例中，所述系统是包括方法说明的试剂盒。视情况，系统包括计算突变体、融合转录物和其它罕见转录物相对于正常或野生型转录物的RNA产率的说明。
以下实例仅出于说明性目的来提供，并且并且不打算以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1
下文阐述在一些实施例中采用的用于无细胞RNA提取、逆转录和PCR扩增程序的实例性方案。下文所述方案包括发明人所做的修改，所述修改未阐述于市售试剂盒和/或试剂附带的制造商说明书中。
1)从患者抽取血液于斯特莱克RNA BCT管(含RNA稳定剂)中
2)在从患者抽血7天内离心并分离无细胞RNA血浆与其它血液层。
3)通过谨慎地吸移顶层从血沉棕黄层移除血浆层
4)在血浆旋转下降时提取约1-3ml血浆。
·在分离血浆与全RNA稳定化血液后立即通过提取回收最大量的RNA。
5)将过量血浆以1ml等份冷冻于-80摄氏度下。
6)如下进行核酸的提取：
a.使用循环核酸试剂盒
i.制备试剂盒中所含的缓冲液：ACB、ACW1和缓冲液ACW2，其具有待分离的样品数所需的体积
ii.以试剂盒中所述的每反应体积将载剂RNA(1ug)添加到缓冲液ACL
iii.将蛋白酶K和血浆在60摄氏度下培育1小时
iv.将缓冲液ACB添加到裂解物
v.在冰上培育5分钟
vi.将混合物施加到QIAamp微型柱并用真空抽吸液体。
vii.将600ul缓冲液ACW1施加到QIAamp微型柱。用真空泵将液体抽吸经过柱
viii.将750ul缓冲液ACW2施加到QiaAmp微型柱。使用真空抽吸液体
ix.通过将60ul无RNAse的DNAse直接添加到柱中心并在柱上在室温下培育15分钟，在柱上进行DNA的DNAse消化。
b.使用2.5ul DNase原液、10ul RDD缓冲液、87.7ul水(无Rnase)制备无RNAse的DNAse(Qiagen目录号79254)。
i.重复上文(6)(a)中的步骤vii和vii
a.将600ul缓冲液ACW1施加到QIAamp微型柱。用真空泵将液体抽吸经过柱
b.将750ul缓冲液ACW2施加到QiaAmp微型柱。使用真空抽吸液体
ii.其它步骤：
1.将750ul乙醇(96-100％)施加到QIAamp微型柱。用真空抽吸乙醇。
2.在洁净2ml管中离心微型柱以通过离心干燥
3.通过将柱在56摄氏度下加热10分钟进一步干燥
iii.洗脱步骤
1.制造商建议，通过将30至150ul缓冲液AVE置于QIAamp微型膜中心，在室温下培育3min并以2,000x g离心1min来进行洗脱，以洗脱核酸。
2.制造商还建议，在洗脱物溶液中使用无DNAse的RNAse消化DNA，并且使用RNeasy提纯柱进一步提纯。结果：发现这个程序不成功并且产生极少至无RNA或所得cDNA。
3.制造商强烈建议，柱上DNAse处理会不起作用。发明人按照制造商的简易尝试另一种市售产品：Quantitect逆转录试剂盒，其在溶液中逆转录并消化DNA。结果：在用β肌动蛋白引物/探针进行PCR扩增时，这种Quantitect逆转录试剂盒产生极少至无所得cDNA信号。
4.发明人用相同缓冲液洗脱两次并且随后
a.将60ul缓冲液AVE置于QIAamp微型膜中心，在室温下培育3min，以20,000x g离心1min，从收集管移除洗脱物，将其再次放置回QIAmp微型膜上，再培育3min并离心以洗脱。
b.因为在柱上消化DNA，所以不需要提纯。
5.之后，使用VILO逆转录酶试剂盒(生命技术)和随机六聚体引物将RNA逆转录为cDNA，随后在室温下经10分钟进行随机六聚体的bBinding，在42摄氏度下延长60分钟，在85摄氏度下将酶热灭活15分钟。
a.使用ZYMO ssDNA和RNA提纯柱根据制造商说明书纯化所得cDNA。这在一些实施例中可实施。
b.使用β-肌动蛋白引物/探针进行的cDNA的PCR用于测定RNA的相对量。RNA浓度的QUBIT读数给出无RNA的表象。
6.在可能时，通过跨越内含子用经研发以扩增RNA序列而不是DNA的引物/探针对所得cDNA进行PCR扩增。
7.不运行RT对照(未逆转录的RNA)来排除样品中可扩增DNA的存在。
8.在另一实施例中，使用机器人提取技术从患者血浆分离RNA。
关于RNA的稳定性和如何处理RNA，与制造商和当前最先进技术教示的相反，RNA提取程序利用以下的组合：RNA稳定化抽血管、柱上DNAse消化、RNA的双重洗脱(将第一洗脱物再次通过柱以增加产率)和立即处理从BCT稳定化血液分离的血浆。即使在冷冻条件下，RNA在血浆中也不稳定。来自斯特莱克的BCT RNA稳定化管似乎不能防止RNA在冷冻后降解。
研发算法以通过以下方式测定RNA(逆转录cDNA)的产率：比较从使用β-肌动蛋白引物/探针和随机六聚体的来自血浆的cDNA与来自已知浓度对照(例如来自安捷伦(Agilent)的普通人类参照(UHR)RNA)的cDNA的PCR获得的CT。通常，将已知对照cDNA的值设定为包括在未知样品的每一PCR运行中，以测定未知样品的相对表达。使用阐述于00033段中的δ-δCt方法计算相对表达。对于每一所关注基因，对照可为购买的细胞系RNA(例如UHR)或可将cDNA的合成片段掺入野生型或正常对照cDNA中。
利用引物和探针扩增从使用随机六聚体的逆转录获得的cDNA链。
实例2
将来自结肠癌患者的血液抽到含有RNA稳定剂的管中(RNA BCT管，来自斯特莱克)并在室温下储存过夜。通过离心分离血浆并使用Qiagen循环核酸核酸试剂盒提取RNA。使用即时Taqman平台(ABI 7900)用对ERCC1、KRAS WT和β肌动蛋白具有特异性的引物测定相对基因表达。使用δCT方法分别在标准持家基因、β肌动蛋白的PCR产物与来自ERCC1和KRAS WT特异性引物的PCR产物的水平之间进行计算。结果显示于图1中，其显示来自从结肠癌患者血浆提取的无细胞RNA的ERCC1和KRAS相对于β肌动蛋白的相对表达。图18显示具有KRAS(红色)、NRAS(绿色)、BRAF(黄色)或无(蓝色)突变的患者中的ERCC1表达。
实例3
此实例中阐述的实验评价可从在DNAse消化后留在血浆中的残留DNA产生ERCC1信号的可能性。图2的顶部部分显示使用已逆转录为cDNA的RNA的PCR表达图。下图显示使用未逆转录RNA扩增样品的阴性结果。会有助于顶部图上的表达分析的残留DNA的任何扩增会使用未逆转录RNA产生信号。PCR信号具有RNA特异性并且进一步显示，未逆转录RNA(未RT)不生成背景PCR信号。
实例4
此实例中阐述的实验评价用于测量基因表达的样品DNA中的KRAS突变状态。如图3中所示，生成此数据以显示，研究中的样品通常反映结肠癌中KRAS的遗传突变频率。在这组样品中以及KRAS参照野生型基因水平的表象中发现预期频率KRAS突变变体。结肠癌中最频繁的KRAS突变变体是KRAS G12D，其次是G12V，并且较不频繁的是G13D。统计学上，G12D和G12V突变体应已在此少数患者中鉴别，而较大数目的患者将需要鉴别G13D突变。KRAS参照DNA是使用无突变的基因区域进行PCR扩增。所有患者样品都应含有KRAS参照DNA序列。
实例5
在此实例中以及如图4中所绘示，从无细胞DNA测定的特定KRAS突变反映于同一患者的RNA中。无细胞DNA从肿瘤渗出到血流中。此实例确认如下假设：如果无细胞RNA反映来自肿瘤的无细胞DNA，那么基因的突变状态在这两种核酸中应一致。对结肠癌患者1037的分析就是如此。
对患者1037中KRAS G12D突变的存在的进一步分析可使用数字PCR技术作为第二平台来进行。
实例6
在此实例中并且如图5所绘示，能评价KRAS突变体等位基因相对于野生型等位基因的百分比。出于此研究的目的，使用第二平台和第二分析验证G12D KRAS突变在这个患者样品中的存在。
图12显示在DNA和cDNA/RNA中每mL血浆的KRAS G12D的相对量。
使用具有或不具有野生型阻断剂引物的等位基因特异性PCR引物探针评价来自结肠直肠癌患者血浆样品的KRAS的突变状态。获得相同结果。在测量从RNA逆转录的cDNA中的突变时，使用等位基因特异性PCR引物探针。另外，设计并使用进一步增强来自RNA/cDNA的PCR扩增的信号灵敏度的野生型阻断剂引物。
增加的灵敏度和特异性可从RNA相对于DNA增加的信号获得。由于从DNA转录多个RNA片段，可预期来自从RNA逆转录的cDNA的PCR分析的信号相对于基因体DNA较高。在图6中，显示RNA与DNA的信号之间的关系。来自从结肠癌患者血浆提取的逆转录mRNA(cDNA)的中值PCR信号比相应DNA高约7倍。未逆转录mRNA背景可忽略。
实例7
使用柱cDNA提纯方法相对于DNA进一步增强RNA信号。不受限于理论，提纯方法通过减少逆转录反应中的抑制性物质增强RNA信号并浓缩cDNA。如图7中所示，RNA的产率比DNA高最多60倍。从相同患者血浆提取通过相对于DNA每比例体积的cDNA(RNA)的相对β-肌动蛋白CT测量的产率。调节循环参数和逆转录酶提纯反应以增加RNA信号。
实例8
肿瘤释放到血流中的无细胞DNA(cfDNA)容许非侵入性地鉴别初始肿瘤特异性突变。然而，并非肿瘤中的所有分子变化都涉及DNA突变；在多种情形中，特定基因的量(即，基因表达)也很重要。测量释放到血液中的无细胞RNA(cfRNA)以监测NSCLC患者中的PD-L1基因表达。PD-1/PD-L1路径是有前景的治疗靶，并且抗-L1药剂已在多种肿瘤类型中显示令人鼓舞的活性。
在治疗期间的不同时间从NSCLC患者收集血样。另外，从健康志愿者获得无癌症血样(“对照组”)。从血样分级分离血浆并提取核酸。使用随机引物将RNA逆转录为cDNA，并且之后通过定量RT-PCR使用适当基因特异性引物加以分析。量化癌症患者和对照组二者中的PD-L1的cDNA。还量化ERCC1表达作为非肿瘤特异性基因的实例。使用β-肌动蛋白表达作为代表总RNA的分母基因。
在70％(7/10血浆样品)的NSCLC患者的ctRNA中检测到PD-L1表达，但在来自对照组的任何样品中都未检测到(0/9)，(p＝0.0031，费雪精确性测试(Fisher’s Exact Test))(图8)。在100％(10/10)的NSCLC患者和67％(6/9)的对照组中检测到ERCC1表达，并且在所检测的那些的相对表达中未观察到显著差异(p＝0.2328，魏克生等级和(Wilcoxon RankSum))(图9)。癌症患者和对照组中的中值相对β-肌动蛋白表达分别为15.52(0.54–94.91)和0.53(0–1.03)(p＝0.0008，魏克生等级和)(图10)。
这些数据显示使用来自血液的cfRNA测量基因表达用于检测癌症和其复发和用于选择并监测治疗的潜在价值。PD-L1cfRNA在血液中的存在可为癌症的特异性指示物，但其癌症检测的灵敏度小于100％，这是因为它并非在所有癌症患者中都有表达。ERCC1表达例示表达水平在癌症患者与健康个体之间无显著差异的基因。癌症患者与健康个体之间中值总cfRNA的极大(约30倍)差异表明，总cfRNA可用作癌症的存在的灵敏初步指示物并且可用于复发监测。图14A显示PD-L1基因表达在结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌专利(NSCLC)和健康个体中的相对频率，17.4％的CRC患者、50％的NSCLC患者和0％的健康个体的PD-L1表达相对增加。图14B显示，相对PD-L1基因表达水平在PD-L1阳性CRC患者与NSCLC患者之间类似。
实例9
在非小细胞肺癌(NSCLC)中，已鉴别若干种对靶向治疗方法具有临床后果的遗传变化。关于EGFR突变，突变对于一线以上治疗已有多种选择。对于那些具有二次变化(如T790M介导的对EGFR抑制剂的抗性)的患者，不可逆酪氨酸激酶抑制剂(TKI)似乎是有前景的替代品。然而，这些选择可受限于所述变化的丢失的证据，如同进展肿瘤负荷患者可易受使用所需侵入性程序的较高死亡率影响。所谓的“液体生检”使用末梢血获得关于实体恶性病中的遗传信息的及时信息，其似乎是这个问题迫切需要的解决方案。需要保持快速周转和广泛可用性的前景的方法。
来自血清的突变检测结果的关联与可用肿瘤样本的测量显著相关。此外，预期的频率与公开的遗传变化的发生率一致。然而，存在潜在偏倚，因为T790M突变高于预期，这可能是由于癌症中心特异性患者选择所致。这些结果与所测试的新鲜血样一致。新鲜样品的周转为三(3)天。
从末梢血进行突变检测是可行的，其具有快速周转以及高灵敏度和特异性。另外，样品可新鲜使用或用作储存的血清探针。这将容许更快的治疗决定，并且由于开始治疗之前的间隔更短，使患者满意度更高。本文所述用于从液体(例如，血清或血液)检测突变的方法是分析组织样品的明确且医学上需要的替代。尤其是在全身性疗法期间肿瘤出现二次变化的情形中，这种方法将至关重要。
实例10
在此实例中，本发明方法用于在疾病进展和治疗之间动态测试。图13B显示在有反应的患者中在疗程期间cfRNA中PD-L1表达的预期降低。
图15A显示在用瑞格菲尼/西妥昔单抗治疗结肠直肠癌的整个治疗期间，监测KRASG12V的cfDNA的等位基因分率的增加。图15B显示，在用瑞格菲尼/西妥昔单抗治疗结肠直肠癌期间，在疗程中，cfRNA中PD-L1的相对表达随时间而降低。图15C显示在用瑞格菲尼/西妥昔单抗治疗结肠直肠癌期间，ERCC1随时间的相对表达。
图16显示在用克唑替尼和FOLFOX治疗期间，对于PD-L1、ERCC1和KRAS G12D，来自结肠直肠癌患者的cfRNA的相对基因表达。
图17显示在用FOLFIRI/贝伐珠单抗和瑞格菲尼/西妥昔单抗治疗期间，对于ERCC1和KRAS G12D，来自结肠直肠癌患者的cfRNA的相对基因表达。
本发明方法提供在治疗之前、整个治疗期间和治疗之后的时间点监测疾病进展或治疗反应的非侵入性或低侵入性方式。
此外，所述方法可用于在其它治疗靶的探索中评价相对基因表达。例如，图19显示在患有胃癌的患者中，在无细胞RNA中监测的PD-L1和HER2的相对表达。数据指示，PD-L1和HER2表达在初始监测后增加，呈现另外两个治疗靶。

Claims (17)

1.一种鉴别来自患有癌症或怀疑患有癌症的个体的生物样品中一或多种与癌症相关的生物标记物的方法，所述方法包含：
a.使用固体载体从所述生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；
b.在RNA位于所述固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；
c.从所述固体载体洗脱RNA至少一次；
d.将所述RNA逆转录为cDNA；
e.使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与癌症相关的生物标记物的引物反应；和
f.测定在所述生物样品中是否存在一或多种生物标记物，其中所述生物标记物的所述存在鉴别所述个体是否具有一或多种与癌症相关的生物标记物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使步骤(c)的洗脱物通过相同柱进行双重洗脱。
3.根据权利要求1或2中任一权利要求所述的方法，其中所述生物样品是来自患有癌症或怀疑患有癌症的所述个体的血浆。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述血浆在与所述RNA稳定剂相互作用的7天内进行处理。
5.根据权利要求1、2、3或4中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(d)中使用随机六聚体将所述RNA逆转录为cDNA。
6.根据权利要求1、2、3、4或5中任一权利要求所述的方法，其中所述生物标记物是选自由以下组成的群组的基因或融合转录物或基因表达中的突变：PD-L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c-Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2、PIK3CA、KIT、GNAQ和GNA11。
7.根据权利要求1、2、3、4、5或6中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：癌症、肺癌、黑色素瘤、胃癌、食管癌、乳癌、卵巢癌、肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、胃肠基质瘤GIST和胰脏癌。
8.一种增加在来自患有癌症或怀疑患有癌症的个体的生物样品中检测无细胞RNAcfRNA中的一或多种与对化学疗法的抗性相关的体细胞突变的灵敏度的方法，所述方法包含：
a.使用固体载体从所述生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；
b.在RNA位于所述固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；
c.从所述固体载体洗脱RNA至少一次；
d.将所述RNA逆转录为cDNA；
e.使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与抗性相关的体细胞突变的引物反应；和
f.测定所述生物样品中是否存在一或多种体细胞突变，其中所述体细胞突变的所述存在鉴别所述个体是否具有一或多种与对化学疗法的抗性相关的体细胞突变。
9.一种测定个体患有癌症或怀疑患有癌症的可能性的方法，所述方法包含：
a.从来自所述个体的生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；
b.在RNA位于固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；
c.从所述固体载体洗脱RNA至少一次；
d.将所述RNA逆转录为cDNA；
e.使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与癌症相关的生物标记物的引物反应；和
f.检测所述生物样品中是否存在一或多种与癌症相关的生物标记物，其中所述生物标记物的所述存在测定所述个体患有癌症的可能性。
10.一种帮助诊断个体患有癌症或怀疑患有癌症的可能性的方法，所述方法包含：
a.从来自所述个体的生物样品分离RNA，其中所述生物样品已与RNA稳定剂相互作用；
b.在RNA位于固体载体上的同时从所述生物样品消化存在的DNA；
c.从所述固体载体洗脱RNA至少一次；
d.将所述RNA逆转录为cDNA；
e.使所述cDNA与至少一种专用于检测一或多种与癌症相关的生物标记物的引物反应；和
f.检测所述生物样品中是否存在一或多种与癌症相关的生物标记物，其中所述生物标记物的所述存在帮助诊断所述个体患有癌症的可能性。
11.根据权利要求8、9或10中任一权利要求所述的方法，其中使步骤(c)的洗脱物通过相同柱进行双重洗脱。
12.根据权利要求8、9、10或11中任一权利要求所述的方法，其中所述生物样品是来自患有癌症或怀疑患有癌症的所述个体的血浆。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述血浆在与所述RNA稳定剂相互作用的7天内进行处理。
14.根据权利要求8、9、10、11、12或13中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(d)中使用随机六聚体将所述RNA逆转录为cDNA。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述体细胞突变是选自由以下组成的群组的基因或融合转录物或基因表达：PD-L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c-Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2、PIK3CA、KIT、GNAQ和GNA11。
16.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述生物标记物是选自由以下组成的群组的基因或融合转录物或基因表达中的突变：PD-L1、ERCC1、EGFR、TS、AREG、EREG、VEGFR2、EML4ALK、ROS1、RET、c-Met、FGFR1、KRAS、BRAF、NRAS、Her-2、PIK3CA、KIT、GNAQ和GNA11。
17.根据权利要求8、9或10中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：癌症、肺癌、黑色素瘤、胃癌、食管癌、乳癌、卵巢癌、肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、胃肠基质瘤GIST和胰脏癌。
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