CN102933723A - 用于诊断与缺氧有关的病状的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法、用于确定与缺氧相关的病状的严重程度的方法、用于确定对与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法以及用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗的方法，其中本发明的方法基于测量受试者中p53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平。本发明还涉及用于执行本发明的方法的试剂盒。

Description

用于诊断与缺氧有关的病状的方法和试剂盒
发明领域
本发明涉及用于检测与缺氧相关的病状，具体地是脑血管意外、胎儿窘迫和心血管疾病的方法。
发明背景
组织缺氧是一种组织细胞缺乏足够的氧供应的病理状态。当这种情况发生时，细胞中的正常生物过程受损从而代谢地适应于氧缺乏。氧剥夺导致与诸如血管形成和糖酵解的许多过程相关的基因的上调，包括促红细胞生成素和血管内皮生长因子。
局部缺血被定义为由于至局部区域的血管堵塞而造成的向该区域的血液供应(循环)不足。这继而导致组织缺氧或缺氧症(缺乏氧)。局部缺血总是导致缺氧；然而，缺氧可在不存在局部缺血的情况下发生，例如动脉血的氧含量随着贫血的发生而下降的情况。缺血性心脏病(IHD)或心肌缺血是一种以通常由冠状动脉疾病(冠状动脉的动脉粥样硬化)所导致的心肌缺血为特征的疾病。据估计在美国1400万人患有缺血性心脏病。在这些当中，多达400万有很少或没有症状并且未意识到他们有绞痛(心绞痛)或心脏病发作(心肌梗塞)的风险。
p53(也称为蛋白质53或肿瘤蛋白质53)，是一种肿瘤抑制蛋白质，其在人类中由TP53基因编码(Matlashewski G等，Embo J.(1984),3(13):3257-62)。p53在多细胞生物体中是重要的，其在多细胞生物体中调节细胞周期并因此用作参与预防癌症的肿瘤抑制子。p53基因的激活导致包括Apaf-1和p21的很多靶基因的转录升高，这些靶基因中的一些升高30至50倍(Kannan等，Oncogene(2001)20(26):3449-55；Kannan等，Oncogene,2001;20(18):2225-34)。
野生型p53蛋白质被称为具有类似监护人的作用，因为其负责监测细胞状态并通过引起细胞周期停滞或细胞凋亡来对应激进行响应。最近数据显示，虽然缺氧诱导的p53并不反式激活已知靶基因，例如Apaf-1或Perp，但其结合这些基因的启动子(Sumiyoshi Y等，ClinCancer Res,2006;12:5112-7)。其他研究显示p53的细胞水平在缺氧期间是稳定的(Hammond EM等，Clin Cancer Res(2006)12(17):5007-5009)。
此前的工作显示，并发有胎儿生长迟缓的妊娠(例如子痫前期)的胎盘相比于正常妊娠呈现增强的细胞凋亡和p53的上调(Levy等，AmJ Obstet Gynecol(2002)186(5):1056-61)。
Ferguson-Smith已经证明少数有核胎儿细胞例如胎儿滋养细胞以及无细胞胎儿DNA进入母体循环中。在子痫前期有核胎儿细胞和无细胞胎儿DNA的数目增加，后者甚至在临床症状之前即为明显的。胎儿DNA水平在妊娠期间增加并在分娩之后的约数小时内被清除(Ferguson-Smith,Proc Natl Acad Sci USA,2003;100(8):4360-2)。类似地，在母体循环中可检测到少量胎儿DNA(Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,Rai V，Sargent IL,Redman CW等，Lancet,1997;350:485-7)。
因此，循环核酸可见于血浆和血清中。所述核酸可为RNA、线粒体DNA或基因组DNA。DNA(1.8-35ng mL-1)和RNA(2.5ng mL-1)存在于健康个体的血浆和血清中并且它们的水平在患有各种癌症、创伤、心肌梗塞和中风的患者中上升。
Poon和同事已首次证明，使用两步逆转录酶(RT)-PCR测定，怀有男性胎儿的孕妇的血浆中来源于胎儿的男性特有mRNA的存在提供一种无创性产前诊断的方式(Poon等，Clin Chem,2000;46(11):1832-4)。
循环核酸也已显示可用作患有实体瘤形成的患者的预后或预测标记物(Goebel G，Dis Markers,2005;21(3):105-20)。Cheng T等报道循环型c-met是非小细胞肺癌的一个独立阴性预后指标(Chest,2005;128:1453-60)。
已报道测量血浆循环mRNA使得能够早期检测肝损伤(Kudo Y等，J Vet Med Sci,2008;70:993-5)。
关于血浆和血清中循环核酸的存在的早期研究主要涉及胎儿医学和肿瘤学领域。
迄今为止，循环核酸相关的研究涉及其他病理状态，包括创伤、败血症、心肌梗塞、中风、移植、糖尿病和血液系统病症(Butt和Swaminathan,Ann N YAcad Sci.2008;1137:236-42)。通过引入高灵敏度的一步实时定量逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)，可以容易地检测和定量通常仅以低浓度存在于血浆和血清中的循环游离RNA(Nancy B.Y等，Methods In Molecular Biology，2006年第336卷；第123-134页)。
Corrias MV等对患有成神经细胞瘤(NB)的儿童的无细胞RNA的检测和将其与全血细胞RNA的检测的比较进行了报道，并提出对于监测疾病状态而言，检测患有NB的患者的肿瘤特异性无细胞RNA并非全细胞RNA的可靠替代选择。(Pediatr Blood Cancer,2010;54:897-903)。
附图简述
本文仅以举例的方式并参照附图描述本发明。现在详细地具体参照附图，必须强调的是所示细节仅以举例的方式并旨在示例性讨论本发明的优选实施方案，并为了提供据信是本发明的原理和概念方面的最有用和最易于理解的说明而示出：
图1是示出正常妊娠对比缺氧妊娠中p21基因水平的图。对于每个样品示出的结果重复三次并归一化成β-肌动蛋白水平。
图2是示出正常妊娠(N)对比缺氧妊娠(H)中p21水平的图。在每个样品中示出的结果重复三次并归一化成β-肌动蛋白水平。
发明概述
在本发明的一个方面，本发明提供一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示受试者患有与缺氧相关的病状。
在本发明的另一个方面，本发明提供一种用于确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度的方法，包括确定得自受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和将所述p53诱导型基因的无细胞RNA的水平与预定范围进行比较，所述预定范围使所述至少一种p53诱导型基因的水平与所述与缺氧相关的病状的严重程度相关联，所述比较允许确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度。
在本发明的又一个方面，本发明提供一种用于确定对受试者的与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法，包括确定两个或更多个生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平，所述生物样品在两个或更多个时间点从所述受试者获得，所述时间点中的至少一个在所述治疗期间或之后，其中：
(i)对于在与缺氧相关的病状中过表达的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平降低指示所述治疗性治疗的效果；
(ii)对于在与缺氧相关的病状中受抑制的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平提高指示所述治疗性治疗的效果。
还在本发明的又一个方面，本发明提供一种用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗以便治疗所述病状的方法，所述方法包括确定得自受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和在至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的所述水平高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的情况下选择受试者以接受所述治疗性治疗。
实施方案列表
以下所公开的是本发明的一些非限制性实施方案，其以编号段落的形式提供。一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示所述受试者患有与缺氧相关的病状。
1.一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示所述受试者患有与缺氧相关的病状。
2.一种用于确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度的方法，包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和将所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平与预定范围进行比较，所述预定范围使所述至少一种p53诱导型基因的所述水平与所述与缺氧相关的病状的所述严重程度相关联，所述比较允许确定所述受试者的与缺氧相关的所述病状的所述严重程度。
3.一种用于确定对受试者的与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法，包括确定来自两个或更多个生物样品的至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平，所述生物样品在两个或更多个时间点从所述受试者获得，所述时间点中的至少一个在所述治疗期间或之后，其中：
(i)对于在与缺氧相关的病状中过表达的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平降低指示所述治疗性治疗的效果；
(ii)对于在与缺氧相关的病状中受抑制的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平提高指示所述治疗性治疗的效果。
4.根据实施方案3所述的方法，其中在开始所述治疗之前的时间点取得一个或多个第一样品而在所述治疗期间或之后的时间点取得一个或多个第二样品。
5.根据实施方案3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品并且在所述治疗期间继所述一个或多个第一样品的所述时间点之后的时间点取得一个或多个第二样品。
6.根据实施方案3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品而在已中止所述治疗之后的时间点取得一个或多个第二样品。
7.一种用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗以便治疗所述病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和在至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的所述水平高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的情况下选择所述受试者以接受所述治疗性治疗。
8.一种用于执行根据实施方案1至7中任一项所述的方法的试剂盒，包含至少一种用于扩增来自生物样品的至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的试剂和用于执行根据权利要求1至7中任一项所述的方法的说明书。
9.根据实施方案8所述的试剂盒，其中所述至少一种试剂包括用于与所述至少一种p53诱导型基因特异性杂交的引物或探针。
10.根据实施方案8或9所述的试剂盒，所述试剂盒还包含至少一种用于从生物样品中提取无细胞RNA的试剂。
11.根据实施方案1至7中任一项所述的方法或根据实施方案8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述样品为体液样品。
12.根据实施方案11所述的方法或试剂盒，其中所述体液样品为血液样品。
13.根据实施方案11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血清样品。
14.根据实施方案11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血浆样品。
15.根据实施方案1至7中任一项所述的方法或根据实施方案8至10中任一项所述的试剂盒，其中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平通过RT-PCR确定。
16.根据实施方案15所述的方法或试剂盒，其中所述RT-PCR为实时定量RT-PCR。
17.根据实施方案1至7中任一项所述的方法或根据实施方案8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状选自心血管疾病、癌症、脑血管意外(CVA)和胎儿窘迫。
18.根据实施方案17所述的方法或试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状是胎儿窘迫。
19.根据实施方案17所述的方法或试剂盒，其中所述心血管疾病是心肌梗塞。
20.根据实施方案18或19所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因选自TP53(GeneBank登录号Nm_000546)、p21(GeneBank登录号Nm_000389)、ERCC5(GeneBank登录号Nm_000123)、MDM2(GeneBank登录号Nm_0006878)、TP53I3(GeneBank登录号Nm_004881)、NOTCH1(GeneBank登录号Nm_017617)、PIGF(GeneBank登录号Nm_002643)、BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)、ZMAT3(GeneBank登录号Nm_0022470)、APAF1(GeneBank登录号Nm_013229)、FAS(GeneBank登录号Nm_152873)、ANGPTL2(GeneBank  登录号Nm_012098)、PUMA(GeneBank登录号Nm_014417)、IGFBP6(GeneBank登录号Nm_002178)、GDF15(GeneBank登录号Nm_004864)、BNIP3L(GeneBank登录号Nm_004331.2)、TGFβ3(GeneBank登录号Nm_003239)、VEGF(GeneBank登录号Nm_001025366)和HIF-1α。
21.根据实施方案20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因选自p21(GeneBank登录号Nm_000389)、BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)、HIF-1α(GeneBank登录号Nm_001530)、NOTCH1(GeneBank登录号Nm_017617)、TGFβ3(GeneBank登录号Nm_003239)和ZMAT3(GeneBank登录号Nm_0022470)。
22.根据实施方案20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是p21(GeneBank登录号Nm_000389)。
23.根据实施方案20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)。
一些非限制性实施方案的详述
本发明基于以下发现：各种p53诱导型基因的无细胞RNA的浓度改变(尤其是血液中)与各种与缺氧相关的病状例如胎儿窘迫(由胎儿中测量的低氧水平反映)、子痫前期、缺血性心脏病、中风(脑血管意外(CVA))和心肌梗塞相关联。
因此，不希望受理论的束缚，已知缺氧会影响p53和p53诱导型基因表达水平。
基于上述，本发明的发明人已设想到无细胞RNA可用作预测各种与缺氧相关的疾病的有效诊断工具。
本发明还包括基于与缺氧相关的病状的治疗前后各种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平差异评估对所述与缺氧相关的病状的治疗效果的工具。
因此，根据本发明的第一方面，提供一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括检测得自受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示受试者患有与缺氧相关的病状。
如本文所用，术语“检测”是指定量以及定性确定得自受试者的生物样品中无细胞RNA的存在与否。该检测因此允许基于得自受试者的生物样品中无细胞RNA的水平确定受试者的与缺氧相关的病理状态(例如，心肌缺血；心肌梗塞的急性阶段(最初几个小时至7天)、治疗阶段(7至28天)和治愈阶段(29天和往后))的存在(或不存在)。
如本文所用，术语“与缺氧相关的病状”是指通常由于至器官的血流减少而使得器官或组织中氧水平降低到预定正常生理水平或范围以下的状态。这种血流减少可由以下非限制性情况引起：(i)由栓子(血凝块)引起的脉管堵塞；(ii)由于动脉粥样硬化导致的脉管堵塞；(iii)血管破损(出血性中风)；(iv)由于诸如在血管痉挛期间和可能在短暂性脑缺血发作(TIA)期间和蛛网膜下出血之后发生的血管收缩导致的血管堵塞。根据本发明教导内容的缺氧可为慢性或短暂性的。
与缺氧相关的病状可包括但不限于脑血管意外(CVA)、胎儿窘迫(例如，在分娩前期(分娩之前)或分娩期(分娩过程)期间损害胎儿；可与胎儿缺氧(胎儿低氧水平)互换使用)、心血管疾病和病状例如急性冠状动脉综合症、缺血性心脏病、心肌缺血(也称为缺血性心脏病)、心肌梗塞(MI)(包括其所有阶段，如本文所述)心脏外科手术、神经外科、脑缺氧、脑梗塞、外科手术(例如，全外科手术缺氧、手术后缺氧)、创伤、肺部疾病、肺性高血压症、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、冠状动脉疾病、周围性血管疾病[例如，动脉硬化(动脉粥样硬化、移植加速动脉硬化)、深静脉血栓形成]、癌症(例如但不限于子宫颈癌、结肠癌、肾癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌或胰细胞癌、淋巴癌、白血病)、血管生成及血管生成相关病症(例如但不限于糖尿病视网膜病变、黄斑变性、牛皮癣和类风湿性关节炎)、肾衰竭、骨骼肌局部缺血、睡眠呼吸暂停、睡眠期间缺氧、病毒感染、细菌感染、吸烟、贫血、血容量不足、出血、高血压、糖尿病、血管病变(vasculopathologies)、雷诺氏疾病(Reynaud's disease)、内皮功能障碍、局部灌注受损(例如，肢体、肠、肾局部缺血)、血栓形成、冻伤、褥疮性溃疡、窒息、中毒(例如，一氧化碳、重金属)、高空病、婴儿猝死综合症(SIDS)、哮喘、先天性循环系统畸形(例如，法洛四联症(Tetralogy of Fallot))以及骨髓成红血细胞增多症(蓝婴综合症(blue baby syndrome))。
如本文所用，术语“生物样品”是指任何得自受试者的样品。这种样品优选为体液。合格的样品包括但不限于血液、血浆、血清、羊水、痰、唾液、精液、尿液、粪便、骨髓和脑脊液(CSF)。术语“血清”是指移除纤维蛋白凝块和血细胞之后获得的血液的流体部分，区别于循环血液中的血浆。术语“血浆”是指血液的流体、非细胞部分，区别于凝固后获得的血清。在一些实施方案中，生物样品选自痰或唾液。通常对样品进行处理以从中移除细胞部分，即变成无细胞RNA样品，如下文进一步论述。
从受试者获得生物样品的程序是本领域熟知的。这些程序包括但不限于血液取样、羊膜穿刺术、绒毛膜绒毛取样和尿液采集。
如本文所用，“受试者”是指任何温血动物，尤其包括哺乳动物类的成员，例如但不限于人类和非人灵长类，例如黑猩猩和其他类人猿以及猴物种；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养哺乳类动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类例如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语并不表示特定年龄或性别，并因此包括成年和新生受试者，不论雄性或雌性。在本发明上下文中的受试者优选为人类受试者。
如本文所用，短语“无细胞核糖核酸(RNA)”(也称为循环RNA或ciRNA)是指存在于样品的无细胞部分中的这类RNA(例如，mRNA)。本文所述的无细胞RNA不包含在完整细胞(即，包含未受损的细胞质膜)中但通常与粒子相关(例如，来源于胎盘的合体滋养细胞微粒，参见Rusterholz等，上文；或凋亡小体，参见Hasselmann等，Clin Chem(2001)47:1488-1489)。在一些实施方案中，该无细胞RNA是完整的(即，未成片段的)。
可根据本领域已知的任何方法从生物样品中提取无细胞RNA样品(参见实施例部分的通用材料和方法部分)。例如，在获得生物样品(即血液)之后，如此前所述(参见例如Ng等，上文)来制备样品。简而言之，通过两个离心周期(例如，于4℃下以1,600×g进行10分钟)从样品移除所有有核细胞。将所得的无细胞样品(例如，血浆或血清)转移到干净的管(例如，埃彭道夫管(eppendorftube))中，与TRIzol LS试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)加氯仿进行混合并离心(例如，于4℃下以11,900×g进行15分钟)。将水性层转移到新管中并与70%乙醇(以1:1比率)混合。然后根据制造商的推荐规范将混合物转移到RNeasy微型柱(RNeasy微型试剂盒，Qiagen,Valencia,CA)中并用不含RNA酶的水洗脱总RNA。
根据本发明的对无细胞RNA的定量可通过本领域已知的任何方法或采用这类方法的试剂盒来实现。这类方法的一些非限制性实例包括逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时RT-PCR(例如，
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和Assays-on-DemandTM,(Applied Biosystems,Foster City，CA,USA)、分子信标(Molecular Beacons)、
Figure BDA00002543266900122
和
Figure BDA00002543266900123
Green(分子探针))、血浆/血清循环RNA纯化试剂盒(例如，Norgen's；www.norgenbiotek.com)以及RNA微阵列。在一些实施方案中，将无细胞RNA进一步对多个看家基因(例如，β-肌动蛋白、GAPDH、CypA、HPRT、Ki-67、SDHA、HPRT1、HBS1L、AHSP、β-2-微球蛋白)进行归一化以便提供对生物样品中无细胞RNA的更加准确的测量。用于进行RNA定量的试剂通常包含至少一种用于与所述至少一种p53诱导型基因特异性杂交的引物和/或探针。如本文所用，术语“特异性杂交”是指形成诸如RNA:RNA、RNA:DNA和/或DNA:DNA分子的双链分子。
扩增和/或检测特定基因的无细胞RNA通常涉及使用至少一种序列特异性寡核苷酸(参见以下的实施例部分的通用材料和方法部分)。所述寡核苷酸可具有至少10、至少15、至少20、至少25或至少30个与本发明的多核苷酸序列特异性杂交的碱基。
可使用多种方法进行杂交双链体的检测，包括通过序列特异性探针(例如，MGB-探针)。通常，标签或标记附接(偶联)至探针。这些标签或标记在本领域具有标准用途并且包括放射性、荧光、生物或酶标签或标记。
传统的杂交测定包括PCR、RT-PCR、RNA酶保护；原位杂交、引物延伸、RNA印迹(Northern Blot)和斑点印迹分析(参见下文实施例部分)。
适于检测某些p53诱导型基因的特异性引物和探针的实例在以下的实施例部分提供。本领域的任何技术人员将能够使用本领域熟知的方法基于本文提供或本领域可获得的可用基因序列生成合适的引物和探针。
如本文所用，术语“p53诱导型基因”是指其中基因的表达直接或间接地受蛋白质53(p53)调节的基因。在一些实施方案中，p53对所述基因的调节通过转录调节进行，由此该基因的表达水平改变取决于基因的转录速率(例如，通过影响转录起始)。当在转录水平调节基因时，p53蛋白可通过结合DNA结合位点(其有时位于基因的启动子附近)或通过结合调节结合位点以打开基因(即激活基因)或关闭基因(即抑制基因)来调节基因的表达。在一些实施方案中，基因调节在转录后修饰(例如，糖基化、乙酰化、脂肪酰化、二硫键形成等)、RNA转运、RNA翻译(例如，翻译起始)、蛋白质转运、蛋白质稳定性、mRNA降解(即转录物稳定性)、影响基因的染色质组分(例如，影响染色质对于RNA聚合酶和转录因子的可接近性)中的一个或多个的水平进行。
如本文所用，术语“与至少一种p53诱导型基因相关的预定范围”通常是指限定得自未患有任何与缺氧相关的病状的健康受试者的样品(即正常、对照的、未受缺氧影响的样品)中测量的无细胞RNA的水平的p53诱导型基因的浓度范围。这种对照样品通常得自具有相同年龄范围、生理状态(例如，妊娠)和性别的受试者。在某些情况下，其甚至可来自在缺氧状态之前的相同受试者，例如来自可能发展与缺氧相关的病状的受试者(例如，妊娠前)。在一些实施方案中，所述预定范围是限定从得自处于与缺氧相关的病状的各个阶段(例如，对于MI-心肌梗塞的急性阶段、治疗阶段或治愈阶段，如本文所述)的受试者的样品测量的无细胞RNA的水平的p53诱导型基因的浓度范围。该预定范围可用试验方法确定(例如，通过从得自MI患者的血液取样无细胞RNA)或来源于文献(如果可用的话)。
因此，根据本发明，测量为统计上不同于(即高于或低于)如上定义的至少一种p53诱导型基因的预定浓度范围的无细胞RNA的水平指示受试者患有与缺氧相关的病状。
在一些实施方案中，所述与缺氧相关的病状选自胎儿窘迫、动脉硬化性血管疾病、心肌缺血、心肌梗塞、不稳定型心绞痛、心脏性猝死、冠状动脉斑块破裂或它们发生的所有阶段的血栓形成。
如本文所用，术语“局部缺血”是指通常由堵塞的动脉导致的涉及至器官的血液供应不足的病状。如本文所用，术语“心肌缺血”是指由至心脏的肌肉组织的血流不足引起的心脏功能的病症。局部缺血可为无症状或有症状的。血流减少可例如由冠状动脉变窄(冠状动脉硬化)、由血栓阻塞(冠状动脉血栓形成)、或不那么常见地由心脏内的小动脉和其他小血管分散性变窄而导致。如本文所用，术语“心肌梗塞(MI)”(也称为急性心肌梗塞(AMI)或心脏病发作)是指继发于长期局部缺血的心肌不可逆坏死。通常，心肌梗塞由供应心肌的动脉闭塞或堵塞引起并导致心肌损伤或坏死(即心脏病发作)。在本发明的上下文中，心肌梗塞是指所述疾病的任何阶段(例如，心肌梗塞的急性阶段、治疗阶段或治愈阶段，如本文所述)。如本文所用，术语“胎儿窘迫”是指胎儿有发展成妊娠相关的并发症的风险的任何病状。胎儿窘迫包括但不限于营养物质供应不足和胎儿生长中止。胎儿窘迫可影响胎儿发育和脑功能并在与早产和紧急分娩(例如，剖腹产)有关的妊娠结局中发挥重要作用。与胎儿窘迫相关的病状包括但不限于异常妊娠、胎儿缺氧、胎儿窘迫、宫内生长迟缓(IUGR)、胎儿生长受限(FGR)、胎儿酒精综合症(FAS)、烟碱摄入、酒精摄入、营养不足、孕妇糖尿病、孕妇高龄和孕妇过度锻炼。与胎儿窘迫相关的妊娠相关缺氧病状的其他实例在上文中详细举例说明。
在一些实施方案中，如本文所定义的胎儿窘迫与缺氧相关，所述缺氧与诸如以下的妊娠相关缺氧病状有关：子痫前期、子痫、轻度子痫前期、慢性高血压、EPH妊娠中毒、妊娠期高血压、并发子痫前期(包括与慢性高血压、慢性肾病或狼疮并发的子痫前期)、HELLP综合症(溶血、肝酶升高、血小板数目减少)、肾病、妊娠期糖尿病、胎盘缺氧、胎儿缺氧、宫内生长迟缓(IUGR)、胎儿生长受限(FGR)、胎儿酒精综合症(FAS)。
在一些实施方案中，所述至少一种p53诱导型基因选自：p21(GeneBank  登录号U09579)、VEGF(GeneBank  登录号NM_001025366)、HIF1α(GeneBank登录号NM_001530.2)、MDM2(EST=MDM2,GeneBank登录号M92424)和TP53I3(GeneBank登录号NM 147184.1)、Fas抗原/TNFR6(GeneBank登录号X89101)、TNFR18(GeneBank  登录号AI923712)、凝溶胶蛋白(Gelsolin)(GeneBank登录号X04412)、btgl(GeneBank登录号X61123)、EST=PIG8(依托泊苷(Etoposide)诱导的，GeneBank登录号R11732)、T10mRNA/人小泛素相关修饰物(human sentrin)/SUMO(GeneBank登录号U83117)、Apaf 1(GeneBank登录号AL135220)、ANGL2,EST=血管生成素样(GeneBank登录号AF125175)、和胞质腺苷酸激酶(GeneBank登录号J04809)、S100钙-结合蛋白A4(GeneBank登录号M80563)、细胞周期蛋白G2(GeneBank登录号U47414)、EST=Ras抑制剂Rin 1(GeneBank登录号L36463)、B-细胞转位基因2，抗增殖剂(GeneBank登录号U72649)、ERCC5(GeneBank登录号AW502004)、H2B和H2A组蛋白基因(291A,GeneBank登录号Z83336)、Notch同源基因1(果蝇属GeneBank登录号AI566271)、Eph受体A2(GeneBank登录号M59371)、肝细胞生长因子样蛋白基因(GeneBank登录号U37055)和EST=α-L岩藻糖苷酶前体(GeneBank登录号M29877)、甘露糖苷酶2,αB1(GeneBank登录号U37248)、磷酸甘露糖酶Sec53p同源物(GeneBank登录号U86070)、亚精胺(GeneBank登录号U40369)、过氧化物酶体膜内在蛋白PMP34(GeneBank登录号AI871429)、假定蛋白/人立方蛋白(Cubilin)(GeneBank登录号AF034611)、精氨基琥珀酸合成酶1(GeneBank登录号AA069289)、脂皮质蛋白1/人膜联蛋白A1(GeneBank登录号ASW379702)、EST=黄嘌呤脱氢酶(GeneBank登录号U39487)和EST=前列腺素合成酶(GeneBank登录号M98539)、生物素羧化酶/人神经元酸性蛋白(GeneBank登录号AI422580)、Ly-6同种抗原/人二氢嘧啶酶(GeneBank登录号D78014)、神经视锥蛋白样蛋白3(NVP-3,GeneBank登录号AI391924)、EST=芳烃受体相互作用蛋白(GeneBank登录号U78521)、PIGF，磷脂酰肌醇聚糖，F类3A(GeneBank登录号W015279)、EST=UNC-51样激酶1(GeneBank登录号AL046256)、tob家族/ERBB2转导子的DNA(GeneBank登录号D38305)、TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白(GeneBank登录号AI299346)、p53-诱导型锌指蛋白(Wig-1/ZMAT3)mRNA(GeneBank登录号AI457344)和GATA-1的辅因子(FOG)1(GeneBank登录号AF488691)、T复合体相关睾丸表达3(GeneBank登录号AA781436)、硒结合蛋白1(GeneBank登录号U29091)、EST=BPM1/人网蛋白1(GeneBank登录号Z54367)、EST=Vamp2/人小突触泡蛋白2(GeneBank登录号M36205)、Fas/APO-1细胞表面抗原(GeneBank登录号X63717)、Bcl-2结合组分3(bbc3/PUMA,GeneBank登录号U82987)、Bcl-6(GeneBank登录号U00115)、Bak(GeneBank登录号U16811)、ATL衍生的PMA响应肽(GeneBank登录号D90070)和GADD45(GeneBank登录号M60974)、BTG2(GeneBank登录号U72649)、损伤特异性DNA结合蛋白(GeneBank登录号U18300)、组蛋白2A样蛋白(GeneBank登录号U90551)、PCNA(GeneBank登录号M15796)、内皮糖蛋白(GeneBank登录号X72012)、多功能蛋白聚糖(GeneBank登录号U16306)、重链4F2(GeneBank登录号M21904)、SMAD7(GeneBank登录号AF010193)、TGF-β超家族蛋白(GeneBank登录号AB000584)和IGFBP6(GeneBank登录号M62402)、巯基氧化酶(Quiescin)/QSCN6(GeneBank登录号L42379)、脂肪组织分化相关蛋白(Adipophilin)(GeneBank登录号X97324)、多发性外生骨疣类型II蛋白(GeneBank登录号U72263)、血管平滑肌α-肌动蛋白(GeneBank登录号X13839)、平滑肌蛋白(Smoothelin)(GeneBank登录号Z49989)、神经微丝亚基NF-L(GeneBank登录号X05608)、NB胸腺素β(GeneBank登录号D82345)、LIM域蛋白(GeneBank登录号X93510)、赖氨酰氧化酶样蛋白(GeneBank登录号U24389)和UDP-半乳糖4差向异构酶(GALE，GeneBank登录号L38668)、cAMP活化蛋白激酶B(GeneBank登录号Y12556)、溶酶体α-甘露糖苷酶B(GeneBank登录号U05572)、羧酸酯酶(肝脏，GeneBank登录号Y09616)、ABC3(GeneBank登录号U78735)、载脂蛋白C-I(VLDL，GeneBank登录号M20902)、CART(GeneBank登录号U20325)、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(GeneBank登录号M12625)、硫氰酸酶(GeneBank登录号D87292)、NECDIN相关蛋白(GeneBank登录号U35139)和NSCL-2基因(GeneBank登录号M96740)、FEZI-T基因(GeneBank登录号U60062)、神经损伤诱导蛋白(Ninjurin)1(GeneBank登录号U72661)、淀粉样蛋白前体样蛋白(GeneBank登录号U48437)、c-Ha-ras(GeneBank登录号J00277)、肠VIPR相关蛋白(GeneBank登录号X77777)、二酰基甘油激酶(α,GeneBank登录号X62535)、推定ser/thr蛋白激酶(GeneBank登录号U56998)、DM激酶(GeneBank登录号L08835)、DRAL-FHL2(GeneBank登录号L42176)和激活转录因子3(GeneBank登录号L19871)、ZNF127-Xp(GeneBank登录号U38315)、LISCH7(GeneBank登录号AD000684)、锌指蛋白7(GeneBank登录号M29580)、Tip-1(GeneBank登录号U90913)、核因子NF-116(GeneBank登录号HG3494)、POM-ZP3(GeneBank登录号U10099)、KIAAA0247(GeneBank登录号D87434)、乳腺珠蛋白1(GeneBank登录号U33147)、二硫化物异构酶相关蛋白(GeneBank登录号J05016)和OS4(GeneBank登录号U81556)、不孕症相关精子蛋白(GeneBank登录号S58544)、KIAA0147(GeneBank登录号D63481)、SURF-1(GeneBank登录号Z35093)、WD重复蛋白HAN11(GeneBank登录号U94747)、p53诱导基因3(PIG3,GeneBank登录号AF010309)、MIC-1/GDF15,TGF-L家族成员(GeneBank登录号AFO 19770)、参与核苷酸切除修复的DDB2(GeneBank登录号U18300a)、MYD88，骨髓分化(GeneBank登录号U70451a)、视黄酸受体L(GeneBank登录号X07282)和Fas/APO1(GeneBank登录号Z70519)、MAPK14(GeneBank登录号L35253)、Bcl2相关X蛋白(Bax,GeneBank登录号L22474)、FKBP4(可能的肽基脯氨酰-顺式-反式-异构酶，GeneBank登录号M88279)、线粒体应激70蛋白前体(致死蛋白(Mortalin)2,GeneBank登录号L15189a)、p57KIP2(CDK抑制剂1C,GeneBank登录号U22398)、DNA连接酶1(LIG1,GeneBank登录号M36067)、DNA切除修复相关蛋白1(ERCC5,GeneBank登录号L20046a)、G/T错配胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG，GeneBank登录号U51166)、同源盒蛋白1(HOXD3,GeneBank登录号D111117a)和MAP4K5(Jun N-末端激酶的激活因子，GeneBank登录号U77129、复制因子A蛋白1(RPA1,GeneBank登录号M63488)、Bcl2拮抗物/杀伤因子1(BAK1,GeneBank登录号U23765)、TGF-L诱导型早期生长应答基因(TIEG，GeneBank登录号S81439a)、MAP2K1(MEK11.5激酶，GeneBank登录号L05624)、硫酸软骨素蛋白聚糖2(CSPG2,GeneBank登录号U16306a)和锌指蛋白197(p18蛋白，ZNF197,GeneBank登录号Z21707a)、腺苷酸激酶3(GeneBank登录号J04809)、醛缩酶A(GeneBank登录号NM_000034)、醛缩酶C(GeneBank登录号NM_0051654)、烯醇化酶1(ENO1,GeneBank Accession No.NM_001428)、葡萄糖转运蛋白1(GeneBank登录号NM_153369)、葡萄糖转运蛋白3(GeneBank登录号NM_001009770)、甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GeneBank登录号NM_002046)、己糖激酶1(GeneBank登录号Nm_000188X)和己糖激酶2(GeneBank登录号Nm_000189X)、胰岛素样生长因子2(IGF-2,GeneBank登录号NM_000612)、IGF结合蛋白1(IGFBP-1,GeneBank登录号uc001gkz.1)、IGFBP-3(GeneBank登录号uc003tnr.1)、乳酸脱氢酶A(GeneBank登录号NM_005566)、磷酸甘油酸激酶1(GeneBank登录号NM_000291)、丙酮酸激酶M(GeneBank登录号M23725)、转化生长因子β3(TGF β3,GeneBank登录号uc00ldoh.1)、血浆铜蓝蛋白(GeneBank登录号NM_000096)、促红细胞生成素(GeneBank登录号NM_000799)、转铁蛋白(GeneBank登录号NM_001063)和转铁蛋白受体(GeneBank登录号NM_003234)、α1B-肾上腺素受体(GeneBank登录号NM_000679)、肾上腺髓质素(GeneBank登录号NM_001124)、内皮素-1(GeneBank登录号NM_001101696)、血红素加氧酶1(GeneBank登录号NM_002133)、一氧化氮合酶2(GeneBank登录号uc002gzu.1)和VEGF受体FLT-1(GeneBank登录号NM 001025366)以及BCL2/腺病毒E1B 19kd-相互作用蛋白3样蛋白(BNIP3L,GeneBank登录号NM_004331.2。
在一些实施方案中，所述p53诱导型基因选自TP53、P21、ERCC5、MDM2、TP53I3(PIG3)、NOTCH、PIGF、BTG2、ZMAT3(WIG1)、APAF1、FAS、ANGPTL2、PUMA(BBC3)、IGFBP6、GDF15、BNIP3L、TGF-β3、VEGF、HIF1α(如表1中所示)并使用
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基因表达测定(Applied Biosystems)(也如表1中所示)或使用技术人员普遍接受的等同形式商业或设计引物/探针组进行定量。
在一些实施方案中，所述p53诱导型基因选自TP53、P21、ERCC5、MDM2、TP53I3(PIG3)、NOTCH、PIGF、BTG2、ZMAT3(WIG1)、APAF1、FAS、ANGPTL2、PUMA(BBC3)、IGFBP6、GDF15、BNIP3L、TGF-β3、VEGF、HIF1α(如表3中所示)并使用Assays-on-DemandTM,Applied Biosystems(也如表3中所示)或使用技术人员普遍接受的等同形式商业或设计引物/探针组进行定量。
表1：p53诱导型基因
  基因符号   登录号   SEQ ID NO   测定号
  1   TP53   Nm_000546   SEQ ID NO:16   Hs01034249_m1
  2   P21(CDKN1A)   Nm_000389   SEQ ID NO:17   Hs01121168_m1
  3   ERCC5   Nm_000123.2   SEQ ID NO:18   Hs01557031_m1
  4   MDM2   Nm_006878   SEQ ID NO:19   Hs00234753_m1
  5   TP53I3(PIG3)   Nm_004881   SEQ ID NO:20   Hs00153280_m1
  6   NOTCH1   Nm_017617   SEQ ID NO:21   Hs00413187_m1
  7   PIGF   Nm_002643   SEQ ID NO:22   Hs00601696_m1
  8   BTG2   Nm_006763   SEQ ID NO:23   Hs00198887_m1
  9   ZMAT3(WIG1)   Nm_022470   SEQ ID NO:24   Hs01074692_m1
  10   APAF1   Nm_013229   SEQ IDNO:25   Hs00185508_m1
  11   FAS   Nm_152873   SEQ ID NO:26   Hs00910107_m1
  12   ANGPTL2   Nm_012098   SEQ ID NO:27   Hs00765775_m1
  13   PUMA(BBC3)   Nm_014417   SEQ ID NO:28   Hs00248075_m1
  14   IGFBP6   Nm_002178   SEQ ID NO:29   Hs00181853_m1
  15   GDF15   Nm_004864   SEQ ID NO:30   Hs00171132_m1
  16   BNIP3L   NM_004331.2   SEQ ID NO:31   Hs00188949_m1
  16   TGFβ3   Nm003239   SEQ ID NO:32   Hs00234245_m1
  17   VEGF   Nm_001025366   SEQ ID NO:33   Hs99999070_m1
  18   HIF1a   Nm_001530   SEQ ID NO:34   Hs00936372
表2：引物和探针
Figure BDA00002543266900201
表3：Assays-on-DemandTM,Applied Biosystems
Figure BDA00002543266900211
Figure BDA00002543266900221
根据另一个方面，本发明提供一种用于确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度的方法，包括确定得自受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和将所述p53诱导型基因的无细胞RNA的水平与预定值(其可为一定范围的离散数)进行比较，所述预定值使所述至少一种p53诱导型基因的水平与所述与缺氧相关的病状的严重程度相关联，所述比较允许确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度。
根据另一个方面，本发明提供一种用于确定对受试者的与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法，包括从两个或更多个生物样品确定至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平，所述生物样品在两个或更多个连续时间点从所述受试者获得，所述时间点中的至少一个在治疗期间或之后，其中：
(i)对于在与缺氧相关的病状中过表达的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的无细胞RNA的水平降低指示所述治疗性治疗的效果；
(ii)对于在与缺氧相关的病状中受抑制的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的无细胞RNA的水平提高指示所述治疗性治疗的效果。
如本文所用，术语“治疗性治疗的效果”是指通过测量正在接受针对与缺氧相关的病状的治疗的受试者的健康状况的改善来评估治疗患有与缺氧相关的病状(例如，心肌梗塞)的受试者的成效。根据本发明，评估受试者的医疗健康可使用本领域已知的任何可接受的医疗测试/程序进行。
在一些实施方案中，治疗性治疗的效果通过将至少一种p53诱导型基因的表达水平回复到正常基因表达水平来证明，所述正常基因表达水平即在对照(例如，测量的健康受试者或此前从健康受试者获得的测量结果)中测量的所述至少一种p53诱导型基因的表达水平。
如本文所用，p53诱导型基因的无细胞RNA的水平的“降低”或“提高”是指当根据本发明测量时在统计上显著的降低或提高。确定统计上显著的降低或提高可使用任何常用的统计检验来进行。本领域的技术人员将知道如何选择最适当的统计检验以确定p53诱导型基因的无细胞RNA水平的统计上显著的降低或提高。在一个实施方案中，所述检验为卡方检验(Chi-square test)。在另一个实施方案中，所述检验为t检验。在又一个实施方案中，所述检验为曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)。
因此，例如，在准许住院时(例如，在到达医院和开始导管插入程序或任何其他用于治疗心肌梗塞的程序或治疗例如抗血小板药物、三硝酸甘油酯、血管紧张素转化酶抑制剂、β-阻滞剂之前的之间时间)从患有急性胸痛的受试者获得第一血清或血浆样品，并且每隔几小时或几天连续取得另外的样品以监测给予该住院受试者的治疗(例如，导管插入程序或如本文所述的任何其他用于医治心肌梗塞的治疗)的效果。
在一些实施方案中，另外的样品在开始治疗(例如，导管插入程序)之后的1至30天之间的时间周期中按每天(和/或每小时)的间隔取得。
在一些实施方案中，另外的样品在开始治疗(例如，导管插入程序)之后3至6小时之间取得。
在一个实施方案中，另外的样品在开始治疗(例如，导管插入程序)之后约4小时取得。
在一些实施方案中，治疗的效果进一步通过将如本文所述的来自两个或更多个得自受试者的生物样品的至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平与得自对照(例如，健康受试者)的至少一种p53诱导型基因的RNA水平进行比较而确定。根据这些实施方案，治疗性治疗的效果通过将如本文所定义的接受已完成治疗的治疗的受试者(例如，在导管插入程序之后3至6小时的MI患者)的至少一种p53诱导型基因的基因表达值与对照样品(例如，健康受试者)中至少一种p53诱导型基因的基因表达值进行比较来评估。
测量这些样品中的无细胞RNA并比较样品之间的至少一种p53诱导型基因的水平，从而确定对所述受试者的治疗的效果。在一些实施方案中，还将所述至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的浓度与从相同性别、类似体重和年龄的健康个体取得的参考对照样品进行比较。根据本发明，参考对照还可以得自细胞系(例如，A2780人卵巢癌细胞系)。
在一些实施方案中，在开始治疗之前的时间点取得一个或多个第一样品而在所述治疗期间或之后的时间点取得一个或多个第二样品。在一个实施方案中，第二样品在治疗之后3至6小时之间取得。在一个实施方案中，所述治疗为导管插入。
在一些实施方案中，在治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品并且在治疗期间继一个或多个第一样品的时间点之后的时间点取得一个或多个第二样品。
在一些实施方案中，在治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品并且在已中止治疗之后的时间点取得一个或多个第二样品。
然后将所述一个或多个第一样品与所述一个或多个第二样品进行比较以确定p53诱导型基因的表达间差异，所述比较允许确定治疗效果，如本文所述。
根据本发明的第三个方面，提供一种用于选择患有与缺氧相关的某种病状的受试者以接受治疗性治疗以便治疗所述病状的方法，所述方法包括确定得自受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和在所述水平高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的情况下选择受试者以接受所述治疗性治疗。
根据本发明的第四个方面，提供用于执行本文所定义的任何方法的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种用于扩增来自生物样品的至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的试剂和用于执行本发明的方法的说明书。在某些实施方案中，试剂盒还包含至少一种用于从生物样品中提取无细胞RNA的试剂。
在一些实施方案中，所述至少一种用于扩增无细胞RNA的试剂包含用于与所述至少一种p53诱导型基因特异性杂交的引物或探针。
在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)从得自受试者的生物样品中提取无细胞RNA，
b)对至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平进行定量，
c)将步骤b中获得的无细胞RNA的水平与所述至少一种p53诱导型基因的预定浓度范围和/或与参考对照进行比较。
在一些实施方案中，所述与缺氧相关的病状是胎儿窘迫。
在一些实施方案中，所述与缺氧相关的病状是心肌梗塞。
在一些实施方案中，所述至少一种p53诱导型基因选自：TP53(GeneBank登录号Nm_000546)、p21(GeneBank登录号Nm_000389)、ERCC5(GeneBank  登录号Nm_000123)、MDM2(GeneBank登录号Nm_0006878)、TP53I3(GeneBank登录号Nm_004881)、NOTCH1(GeneBank  登录号Nm_017617)、PIGF(GeneBank登录号Nm_002643)、BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)、ZMAT3(GeneBank  登录号Nm_0022470)、APAF1(GeneBank登录号Nm_013229)、FAS(GeneBank登录号Nm_l52873)、ANGPTL2(GeneBank  登录号Nm_012098)、PUMA(GeneBank登录号Nm_014417)、IGFBP6(GeneBank登录号Nm_002178)、GDF15(GeneBank登录号Nm_004864)、BNIP3L(GeneBank登录号Nm_004331.2)、TGFβ3(GeneBank登录号Nm_003239)、VEGF(GeneBank登录号Nm_001025366)和HIF-1α。在一些实施例中，所述至少一种p53诱导型基因选自p21(GeneBank登录号Nm_000389)、BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)、HIF-1α(GeneBank登录号Nm_001530)、NOTCH1(GeneBank登录号Nm_017617)、TGFβ3(GeneBank登录号Nm_003239)和ZMAT3(GeneBank登录号Nm_0022470)。
在一个实施方案中，用于检测p53诱导型基因的所述无细胞RNA的引物或探针是表2中示出的引物或探针或由技术人员从本领域已知的用于所述基因的引物和探针中选择的引物和探针。
在一些实施方案中，用于检测p53诱导型基因的所述无细胞RNA的引物或探针是表3中示出的引物或探针或由技术人员从本领域已知的用于所述基因的引物和探针中选择的引物和探针。
在一些实施方案中，所述至少一种p53诱导型基因选自p21、BTG2、TGFβ3、NOTCH1、HIF1α、MDM2和ZMAT3。
在一个实施方案中，所述至少一种p53诱导型基因是p21。
在另一个实施方案中，所述至少一种p53诱导型基因是BTG2。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于实施或检验本发明的实施方案，但以下描述示例性方法和/或材料。如发生矛盾，则本专利说明书，包括定义，将占据主导地位。此外，所述材料、方法和实施例仅为示例性的并非旨在必要地限制。
如本文以上所述且受以下权利要求书部分保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验性支持。
一些非限制性实施例的描述
现在参照以下实施例，并结合以上描述；以一种非限制性方式说明本发明。
一般来讲，本文所用的命名和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。文献中对这些技术进行了详尽的说明。参见例如"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等，(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"I-III卷，Ausubel,R.M.编辑(1994)；Ausubel等，"Current Protocols in MolecularBiology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley & Sons,New York(1988)；Watson等，"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等(编辑)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如以下中所述的方法：美国专利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",I-III卷，Cellis,J.E.编辑(1994)；"Current Protocols in Immunology"I-III卷，Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等(编辑)，"Basic and ClinicalImmunology"(第8版)，Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman及合作者，New York(1980)；可用的免疫测定充分描述于专利和科技文献中，参见例如美国专利No.3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.编辑(1984)；"Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney，R.I.编辑(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guideto Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"1-317卷，Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods AndApplications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等，"Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual"CSHL Press(1996)；所有这些均以引用方式并入，如同在本文中完全示出。其他一般参考文献在本文档上下文中提供。其中的程序据信是本领域熟知的并为了方便读者而提供。其中包含的所有信息均以引用方式并入本文。
通用材料和方法
从孕妇采集血液：从具有单胎(即，具有单个胎儿的妊娠)无并发症妊娠的健康妇女和具有并发症妊娠的妇女采集15ml血液样品。该研究经过Sheba Medical Center的Research Ethics Committee批准。所有血液样品于Sheba Medical Center的妇产科在受试者知情同意后获得。
血液制备：如此前Ng[Ng等，Proc Natl Acad Sci(2003)100(8):4360-2]所述来制备血液样品。详细地，将血液样品收集在含有EDTA的管中，于4℃下以1,600×g离心10分钟(以从血液样品中移除有核细胞)。然后将血浆和血清小心地转移到1.5ml埃彭道夫管中。将血浆样品于4℃下再次以16,000×g离心10分钟并将上清液收集到新的聚丙烯管中。将血清样品保存在-20℃下以供将来参考。
RNA提取：如此前Ng[Ng等，Clin Chem(2002)48(8):1212-7]所述，将1.6ml血浆(离心之后)与2ml TRIzol LS试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)和0.4ml氯仿混合。将混合物于4℃下以11,900×g离心15分钟并将水性层转移到新管中。向一体积的水性层中添加一体积的70%乙醇。然后按照制造商的推荐规范将混合物转移到RNeasy微型柱(RNeasy微型试剂盒，Qiagen,Valencia,CA)中。进行柱上DNA酶处理以移除任何污染DNA(不含RNA酶的DNA酶套件(RNase-FreeDNase Set)，Qiagen,Valencia,CA)。将总RNA用30μl不含RNA酶的水洗脱并保存在-80℃下。
实时定量RT-PCR：使用一步实时定量RT-PCR并用针对各目标基因的特异性引物进行特定无细胞mRNA的扩增。RT-PCR引物是跨越内含子的，以便降低DNA污染，并且进行NCBI-blast检查以排除非特异性扩增。
根据制造商的说明书(EZ rTth RNA PCR试剂套件(EZ rTth RNAPCR reagent set)，Applied Biosystems,Foster City，CA)以20μl的反应体积设置RT-PCR。详细地，使用100-500nM PCR引物扩增5μl提取的血浆RNA。对每个样品一式两份进行分析并且同时对各分析一式三份处理相应的校准曲线。每项分析中还包含没有模板的对照(NTC)。
根据本发明使用的RT-PCR热循环特征如下：反应开始在50℃下进行20分钟逆转录并在95℃下变性5分钟。然后，按照如下进行50个PCR循环：在95℃下变性15秒，随后在60℃下退火/延伸30秒。
从患有心肌梗塞的患者采集血液：为了分析患有心肌梗塞(MI)的患者的无细胞RNA的水平，使用来自Applied Biosystems的测定试剂盒(Assays-on-DemandTM，表3)。该测定使用一批预先设计的引物和探针组以用于定量实时PCR基因表达研究。
RNA通过磁珠(Magmax试剂盒，由Applied Biosystems制造；AM1836)提取并用于一步RT-PCR试剂盒(来自QIAGEN的QuantiFastProbe RT-PCR Plus试剂盒；204482)。根据下文中说明的相对定量方法进行RNA的定量。
实施例1
并发缺氧的妊娠的血清中的p21mRNA相比于正常妊娠升高
结果
结果表明在并发缺氧的妊娠中p21基因表达大大升高(图1)。在得自具有并发症妊娠的受试者的五个RNA样品中观察到四个有阳性p21基因表达，而在得自具有正常妊娠的受试者的五个样品中未观察到p21基因表达。
在进一步研究中，在20个正常妊娠的RNA样品中测试p21基因表达并将结果与并发症妊娠中观察到的升高的p21基因表达进行比较(如图1中所示)。如图2中所示，在测试的20例正常妊娠中仅有一例的p21基因表达大大升高(病例号19)，同时在四例中检测到小幅升高(病例号1、7、13和17)。
综合目前结果证实循环p21 mRNA为预测胎儿窘迫的无创性标记物。
实施例2
如广泛临床研究中确定，具有并发缺氧的妊娠的妇女的血浆样品中p21、MDM2和HIF1α的RNA表达上调
结果
在初始结果(如实施例1中所示)之后，将该研究扩展至较大的受试者组(总计54个受试者)，在这些之中，有31个正常妊娠受试者和23个并发症妊娠受试者。使用表2中所示的引物和探针，对母体血浆RNA样品测试与缺氧和应激相关的基因的基因表达，这些基因具体地是p21(GeneBank登录号U09579)、VEGF(GeneBank登录号NM_001025366)、MDM2(GeneBank登录号M92424)、HIF1α(GeneBank登录号NM_001530.2)和TP53I3(GeneBank登录号NM_147184.1)。
如下表4A中所示，在所测试的23个缺氧妊娠受试者中，13个测试为p21基因表达阳性而10个记录为p21基因表达阴性。此外，在所测试的31个正常妊娠受试者中，仅2个测试为p21基因表达阳性而29个记录为p21基因表达阴性。缺氧妊娠中p21基因表达对比正常妊娠的卡方检验结果示出p小于0.001(表4B)。
表4A：p21基因表达
H/N*p21交叉列表
Figure BDA00002543266900321
表4B：卡方检验
卡方检验
Figure BDA00002543266900322
a.仅对2×2表计算
b.0个单元格(.0%)的期望频数小于5。最小期望频数是6.39。
如下表5A中所示，在所测试的23个缺氧妊娠受试者中，10个测试为VEGF基因表达阳性而13个记录为VEGF基因表达阴性。此外，在所测试的31个正常妊娠受试者中，6个测试为VEGF基因表达阳性而25个记录为VEGF基因表达阴性。缺氧妊娠中VEGF基因表达对比正常妊娠的卡方检验结果示出p=0.053(表5B)。
表5A：VEGF基因表达
H/N*vegf交叉列表
Figure BDA00002543266900331
表5B：卡方检验
卡方检验
Figure BDA00002543266900341
a.仅对2×2表计算
b.0个单元格(.0%)的期望频数小于5。最小期望频数是6.81。
如下表6A中所示，在所测试的22个缺氧妊娠受试者中，12个测试为MDM2基因表达阳性而10个记录为MDM2基因表达阴性。此外，在所测试的31个正常妊娠受试者中，仅5个测试为MDM2基因表达阳性而26个记录为MDM2基因表达阴性。缺氧妊娠中MDM2基因表达对比正常妊娠的卡方检验结果示出p=0.004(表6B)。
表6A：MDM2基因表达
H/N*mdm2交叉列表
Figure BDA00002543266900342
Figure BDA00002543266900351
表6B：卡方检验
卡方检验
Figure BDA00002543266900352
Figure BDA00002543266900361
a.仅对2×2表计算
b.0个单元格(.0%)的期望频数小于5。最小期望频数是7.06。
如下表7A中所示，在所测试的22个缺氧妊娠受试者中，10个测试为HIF1α基因表达阳性而12个记录为HIF1α基因表达阴性。此外，在所测试的31个正常妊娠受试者中，0个测试为HIF1α基因表达阳性而31个记录为HIF1α基因表达阴性。缺氧妊娠中HIF1α基因表达对比正常妊娠的卡方检验结果示出p小于0.001(表7B)。
表7A：HIF1α基因表达
H/N*hif1a交叉列表
Figure BDA00002543266900362
Figure BDA00002543266900371
表7B：卡方检验
卡方检验
Figure BDA00002543266900372
a.仅对2×2表计算
b.1个单元格(25.0%)的期望频数小于5。最小期望频数是4.15。
如下表8A中所示，在所测试的22个缺氧妊娠受试者中，6个测试为TP53I3基因表达阳性而16个记录为TP53I3基因表达阴性。此外，在所测试的23个正常妊娠受试者中，5个测试为TP53I3基因表达阳性而18个记录为TP53I3基因表达阴性。缺氧妊娠中TP53I3基因表达对比正常妊娠的卡方检验结果示出p=0.466(表8B)。
表8A：TP53I3基因表达
H/N*TP5313交叉列表
Figure BDA00002543266900381
表8B：卡方检验
卡方检验
Figure BDA00002543266900391
a.仅对2×2表计算
b.0个单元格(.0%)的期望频数小于5。最小期望频数是5.38。
如下表9中所示，相比于正常妊娠，缺氧妊娠中相关联的p21、MDM2和HIF1α基因表达揭示仅4个缺氧妊娠受试者的这3个基因的表达为阴性，而24个正常妊娠受试者的这3个基因的表达为阴性。此外，5个缺氧妊娠受试者的p21、MDM2和HIF1α的表达为阳性，而没有一个正常妊娠受试者的这3个基因的表达记录为阳性。
表9：p21、MDM2和HIF1α基因表达之间的关系
p21*mdm2*hif1a*H/N交叉列表
频数
Figure BDA00002543266900392
Figure BDA00002543266900401
类似地，如下表10中所示，相比于正常妊娠，缺氧妊娠中相关联的p21、VEGF和HIF1α基因表达揭示仅5个缺氧妊娠受试者的这3个基因的表达为阴性，而23个正常妊娠受试者的这3个基因的表达为阴性。
此外，3个缺氧妊娠受试者的p21、VEGF和HIF1α的表达为阳性，而没有一个正常妊娠受试者的这3个基因的表达记录为阳性。
表10：p21、VEGF和HIF1αH/N基因表达之间的关系
p21*vegf*hif1a*H/N交叉列表
频数
Figure BDA00002543266900402
Figure BDA00002543266900411
总结缺氧妊娠中不同缺氧相关基因的基因表达(下表11和12)揭示p21基因表达和/或HIF1α基因表达是缺氧妊娠中最显著上调的基因。因此，除了其他在与缺氧相关的病状中过表达或受抑制的p53诱导型基因以外，这两个基因的表达(一起或独立地)标志着妊娠期间的缺氧应激。
表11
术语移除情况模型
Figure BDA00002543266900412
表12
术语移除情况模型
Figure BDA00002543266900413
实施例3：患有急性心肌梗塞的患者的p53诱导的基因激活
研究受试者：
一个100个受试者的组参与该研究。50个受试者是在Meir医院(Kfar Saba)的心脏重症监护室住院的患有急性心肌梗塞(MI)的患者。所有患者均为超过30岁的男性。50个受试者是进行无创性局部缺血评估并未显示急性局部缺血的患者(对照组)。
MI患者：
所述MI患者患有急性MI并伴有ST段抬高。患者由于连续胸痛而住院，据记录胸痛已发生至少1小时但不超过6小时。所有MI患者均准备进行紧急导管插入并显示以下至少一种：
1.前壁ST抬高
2.新的左束支传导阻滞(LBBB)
3.后壁ST抬高，有外侧壁或后壁的心电图参与的证据。
对照组：
所述对照组由50个患者组成，使用超声波心动图或超声波心动图应激测试对这些患者进行无创性局部缺血评估，未显示急性局部缺血。
对血液样品分析基因BNIP3L、P21、MDM2、HIF1α、NOTCH1、BTG2、TGFβ3、ZMAT3和ERCC5的表达。从患者分离RNA并扩增。根据相对定量方法(Livak KJ和Schmittgen TD.Methods 2001;25(4):402-8；Marisa LW和Juan FM,BioTechniques 2005;39:75-85)进行患者血液样品中无细胞RNA的定量，该方法测定多个样品间基因的稳态mRNA水平的改变并将其相对于内参RNA的水平进行表示。从A2780(人卵巢癌细胞系)提取的总RNA用作相对定量的外标(定标物)。对测试样品相比于定标物(即来自细胞系A2780的RNA)的倍数增加进行定量。将所有患者的RNA样品(归一化成内参即GAPDH之后)与A2780细胞系中的表达水平进行比较。
对于MI组：
-取得两个血液样品：
1.在到达医院时(在到达时间至急诊室之间并直到导管插入)，t=0；
2.导管插入4小时后；t=4。
对于对照组：
-在进行测定(超声波心动图或超声波心动图应激测试)之前取得一个血液样品。
统计分析：
1.对t=0(MI患者的样品)vs.对照；t=4(MI患者的样品)vs.对照以及t=0vs.t=4的无细胞RNA水平进行参数t检验(表13，结果示出p值；*p<0.05、**p<0.01)。
表13-t检验
  基因   t=0/对照   t=4/对照   t=0/t=4
  BNIP3L   0.3   0.37   0.16
  P21   0.0012**   0.001**   0.21
  MDM2   0.02*   0.11   0.08
  HIF1-α   0.0002***   0.00003   0.4
  NOTCH1   0.18   0.14   0.19
  BTG2   0.073   0.12   0.00004***
  TGF-β3   N/A   N/A   N/A
  ZMAT3   N/A   N/A   N/A
  ERCC5   0.07   0.06   0.4
2.当在t=0和/或t=4和/或对照中的一些血液样品中未检测到无细胞RNA的情况下，进行曼-惠特尼非参数统计检验(Wilcoxon秩和检验)(表14，结果示出p值；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)
表14-曼-惠特尼检验
  基因   t=0/对照   t=4/对照   t=0/t=4
  BNIP3L   N/A   N/A   N/A
  P21   0.0007***   0.28   0.0017**
  MDM2   0.14   0.5   0.08
  HIF1-α   0.017*   0.4   0.017*
  NOTCH1   0.0024**   0.14   0.0034**
  BTG2   0.0002***   0.24   0.0001***
  TGF-β3   0.15   0.26   0.013*
  ZMAT3   0.094   0.036*   0.16
  ERCC5   0.11   0.44   0.08
结果揭示p21、MDM2、HIF-1α、NOTCH1、BTG2基因的表达指示急性MI(表13-14，左列)。基因p21、HIF-1α、NOTCH1、TGF-β3和BTG2显示为对MI的治疗成功性的预测性标记物(表13-14，右列)。
基因p21、MDM2、HIF-1α、NOTCH1、BTG2显示为基因表达回复到正常值的预测性标记物，如t=4vs.对照中所示(表13、14中的中间列)。
应当理解，为清楚起见而在分开的实施方案的语境中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中以组合形式提供。反之，为简明起见而在单个实施方案的语境中描述的本发明的多个特征也可以分开或以任何合适的子组合提供。
虽然已结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但显然多种替代形式、修改形式和变型形式对本领域的技术人员而言将是显而易见的。因此，其旨在涵盖所有这些落在所附权利要求书的精神和广泛范围内的替代形式、修改形式和变型形式。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及GenBank登录号在这里均以引用方式全文并入本说明书中，就如各个单独出版物、专利或专利申请或GenBank登录号被具体和单独地指出以引用方式并入本文的程度一样。此外，本专利申请中对任何参考文献的引用或认同不应理解为承认这些参考文献可用作本发明的现有技术。
Figure IDA00002543267400011
Figure IDA00002543267400031
Figure IDA00002543267400041
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Claims (23)

1.一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示所述受试者患有与缺氧相关的病状。
2.一种用于确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度的方法，包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和将所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平与预定范围进行比较，所述预定范围使所述至少一种p53诱导型基因的所述水平与所述与缺氧相关的病状的所述严重程度相关联，所述比较允许确定所述受试者的与缺氧相关的所述病状的所述严重程度。
3.一种用于确定对受试者的与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法，包括确定来自两个或更多个生物样品的至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平，所述生物样品在两个或更多个时间点从所述受试者获得，所述时间点中的至少一个在所述治疗期间或之后，其中：
(i)对于在与缺氧相关的病状中过表达的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平降低指示所述治疗性治疗的效果；
(ii)对于在与缺氧相关的病状中受抑制的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平提高指示所述治疗性治疗的效果。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在开始所述治疗之前的时间点取得一个或多个第一样品并且在所述治疗期间或之后的时间点取得一个或多个第二样品。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品并且在所述治疗期间继所述一个或多个第一样品的所述时间点之后的时间点取得一个或多个第二样品。
6.根据权利要求3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品而在已中止所述治疗之后的时间点取得一个或多个第二样品。
7.一种用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗以便治疗所述病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平和在至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的所述水平高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的情况下选择所述受试者以接受所述治疗性治疗。
8.一种用于执行根据权利要求1至7中任一项所述的方法的试剂盒，包含至少一种用于扩增来自生物样品的至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的试剂和用于执行根据权利要求1至7中任一项所述的方法的说明书。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述至少一种试剂包含用于与所述至少一种p53诱导型基因特异性杂交的引物或探针。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，所述试剂盒还包含至少一种用于从生物样品中提取无细胞RNA的试剂。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述样品为体液样品。
12.根据权利要求11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为体液样品，其为血液样品。
13.根据权利要求11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血清样品。
14.根据权利要求11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血浆样品。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，其中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平通过RT-PCR确定。
16.根据权利要求15所述的方法或试剂盒，其中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平通过实时定量RT-PCR确定。
17.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状选自心血管疾病、癌症、脑血管意外(CVA)和胎儿窘迫。
18.根据权利要求17所述的方法或试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状是胎儿窘迫。
19.根据权利要求17所述的方法或试剂盒，其中所述心血管疾病是心肌梗塞。
20.根据权利要求18或19所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因选自TP53(GeneBank登录号Nm_000546)、p21(GeneBank登录号Nm_000389)、ERCC5(GeneBank登录号Nm_000123)、MDM2(GeneBank登录号Nm_0006878)、TP53I3(GeneBank登录号Nm_004881)、NOTCH1(GeneBank登录号Nm_017617)、PIGF(GeneBank登录号Nm_002643)、BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)、ZMAT3(GeneBank登录号Nm_0022470)、APAF1(GeneBank登录号Nm_013229)、FAS(GeneBank登录号Nm_152873)、ANGPTL2(GeneBank  登录号Nm_012098)、PUMA(GeneBank登录号Nm_014417)、IGFBP6(GeneBank登录号Nm_002178)、GDF15(GeneBank  登录号Nm_004864)、BNIP3L(GeneBank登录号Nm_004331.2)、TGFβ3(GeneBank登录号Nm_003239)、VEGF(GeneBank登录号Nm_001025366)和HIF-1α。
21.根据权利要求20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因选自p21(GeneBank登录号Nm_000389)、BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)、HIF-1α(GeneBank登录号Nm_001530)、NOTCH1(GeneBank登录号Nm_017617)、TGFβ3(GeneBank登录号Nm_003239)和ZMAT3(GeneBank登录号Nm_0022470)。
22.根据权利要求20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是p21(GeneBank登录号Nm_000389)。
23.根据权利要求20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是BTG2(GeneBank登录号Nm_006763)。
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