CN112717134B - 一种用于儿童情感障碍的基因药物 - Google Patents
一种用于儿童情感障碍的基因药物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于儿童情感障碍技术领域，尤其涉及一种用于治疗抑郁症的基因药物。本发明提供了一种有效抑制LOC107985688表达的LOC107985688 siRNA，本发明所提供的LOC107985688 siRNA能够有效地抑制H2O2所导致的神经细胞损伤和神经细胞凋亡，因此可将其用于制备抑郁症基因药物。本发明所制备的药物可制备为气雾型药物、注射剂型药物或口服剂型药物。
Description
技术领域
本发明属于儿童情感障碍技术领域，尤其涉及一种用于儿童情感障碍的基因药物。
背景技术
儿童情感障碍包括抑郁症，自闭症等疾病。目前，我国儿童，青少年抑郁症的发病率逐年上升，抑郁症已经成为威胁儿童和青少年健康成长的主要疾病。抑郁症是一种危害严重的精神疾病,抑郁症患者的主要临床症状为显著而持久的情绪低落，兴趣减低，思维迟缓，悲观无望，缺乏主动等，患者常常伴有全身多系统与客观检测不相符的多种多样的躯体不适，严重的患者会出现自杀念头和行为。根据相关数据统计，目前全世界约有3.5亿人患有抑郁症，抑郁症已成为人类第二大杀手。
由于抑郁症患者常常会出现边界不清的表型，因此容易与其他疾病发生极大的交织，这种现象增加了抑郁症的研究难度。尽管抑郁症的发病原因十分的复杂，但是抑郁症患者后期都会出现神经元细胞损伤的情况。因此，寻找能够有效减少损伤的靶点可以为开发新的抑郁症药物有效治疗儿童和青少年情感障碍提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于儿童情感障碍的基因药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了LOC107985688作为靶标在制备抑郁症药物中的用途，所述LOC107985688的RNA核酸序列为XR_001755878.1，所述核酸序列如SEQ ID NO.1。
此外，本发明提供LOC107985688抑制剂在制备抑郁症药物中的用途。
优选地，所述抑制剂为降低神经细胞中LOC107985688基因表达的shRNA，siRNA，或小分子化合物。
优选地，所述抑制剂为siRNA，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
此外，本发明提供了一种用于制备抑郁症药物的LOC107985688 siRNA，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
此外，本发明提供了一种用于治疗抑郁症的药物，所述药物包括LOC107985688siRNA和药学上可接受的载体，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
优选地，所述药物形式包括气雾型药物、注射剂型药物和口服剂型药物。
此外，本发明提供了LOC107985688 siRNA在制备神经细胞氧化损伤保护剂中的用途，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
除此之外，本发明提供了 LOC107985688 siRNA在制备抑制神经细胞凋亡抑制剂中的用途，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种有效抑制LOC107985688表达的LOC107985688 siRNA，本发明所提供的LOC107985688 siRNA能够有效地抑制H2O2所导致的神经细胞损伤和神经细胞凋亡，因此可将其用于制备抑郁症基因药物，从而有效的治疗儿童和青少年的抑郁症和情感障碍。
附图说明
图1 si-LOC107985688-1，si-LOC107985688-2和si-LOC107985688-3的抑制效果
图2 抑制LOC107985688在H2O2导致的细胞活力下降中的作用
图3抑制LOC107985688对于H2O2导致的Nrf2蛋白表达下调的作用
图4抑制LOC107985688对于H2O2导致的Caspase3酶活力上调的作用
图5 抑制LOC107985688对于H2O2导致的凋亡相关蛋白的影响。
具体实施方式
为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，现将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。
实施例1
LOC107985688 siRNA的制备和检验
1.设计3条敲减LOC107985688的siRNA
3条siRNA的序列如下
si-LOC107985688-1的正义链序列为GCUGGACAAUGCAAAUGAACU（SEQ ID NO.2）
si-LOC107985688-1的反义链序列为UUCAUUUGCAUUGUCCAGCUU（SEQ ID NO.3）
si-LOC107985688-2的正义链序列为CACAGAAGAUCGAAGUGUACA（SEQ ID NO.4）
si-LOC107985688-2的反义链序列为UACACUUCGAUCUUCUGUGAU（SEQ ID NO.5）
si-LOC107985688-3的正义链序列为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG（SEQ ID NO.6）
si-LOC107985688-3的反义链序列为UUACUUUACACGUAGUCGUUG（SEQ ID NO.7）
2.检测3条siRNA的抑制效果
（1）将SH-SY5Y细胞接种于细胞培养板中，转染si-NC，si-LOC107985688-1，si-LOC107985688-2和si-LOC107985688-3，每组设置3个重复；
（2）转染48h后，根据Invitregen公司的Trizol说明书提取总RNA；
（3）根据TaKaRa逆转录试剂盒说明书逆转录得到cDNA；
（4）设计LOC107985688荧光定量PCR引物，LOC107985688的引物序列如下：
LOC107985688的正向引物为TGCCTGTGAGCCTTGAACAA（SEQ ID NO.8）
LOC107985688的反向引物为ATCCCAGCACTTTAGGAGGC（SEQ ID NO.9）
GAPDH的引物序列如下：
GAPDH的正向引物为GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT（SEQ ID NO.10）
GAPDH的反向引物为GGGGTCATTGATGGCAACA（SEQ ID NO.11）
（5）根据TaKaRa一步法荧光定量PCR试剂盒说明书配置荧光定量实验体系；
（6）荧光定量PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 45s，40个循环。
实验结果使用2-ΔΔCt分析法进行计算，结果如图1所示，转染si-LOC107985688-1之后的LOC107985688的相对表达量为0.254±0.015，转染si- LOC107985688-2之后的LOC107985688的相对表达量为0.285±0.027，转染si- LOC107985688-3之后的LOC107985688的相对表达量为0.129±0.021。从实验结果可以看出，本发明所提供的siRNA均对LOC107985688的表达具有较好的抑制效果。其中，si- LOC107985688-3的抑制效果最佳，因此，本发明选择si- LOC107985688-3进行后续的实验。
实施例2
抑制LOC107985688对于H2O2导致的氧化损伤的保护作用
（1）将5000个SH-SY5Y细胞接种于96孔板中，分为A组（转染si-NC但不进行H2O2处理），B组（转染si-NC并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），C组（转染si-LOC107985688-3并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），每组设置3个复孔；
（2）H2O2处理结束后，使用MTT检测OD值并计算细胞活力。
实验结果如图2所示，H202处理24h后能够显著的降低SH-SY5Y细胞的细胞活力（B组细胞活力为67.97±1.894），而C组的细胞活力显著高于B组（C组细胞活力为80.87±2.206），说明在SH-SY5Y细胞中转染si-LOC107985688-3之后，能够部分的逆转H202所导致的细胞活力下降。
实施例3
抑制LOC107985688对于Nrf2蛋白的调控
Nrf2（核因子E2相关因子2）是细胞抗氧化体系中的关键调节因子，能够调控细胞内多种抗氧化基因的表达，因此，本发明检测抑制LOC107985688是否能够调控Nrf2蛋白。
（1）将SH-SY5Y细胞接种于6孔细胞培养板中，A组（转染si-NC但不进行H2O2处理），B组（转染si-NC并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），C组（转染si-LOC107985688-3并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），每组设置3个复孔；
（2）处理24h后，去除培养基，使用PBS清洗细胞2次，添加蛋白裂解液，使用细胞刮将细胞刮下，使用移液器将细胞转移至1.5mlEP管中；
（3）冰上，裂解30分钟，每隔10分钟使用涡旋器进行涡旋；
（4）4℃，12000r/min，离心15min，将上清转移至新的1.5ml EP管中；
（5）根据BCA试剂盒说明书测量蛋白浓度，调整蛋白样品为2ug/ul;
（6）配置分离胶和浓缩胶，安装电泳槽，进行上样；
（7）浓缩胶80V，分离胶120V，待溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳；
（8）按照海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫的三明治模型安装转膜夹，将转膜夹放入转膜槽中，加入冰盒，恒流250mA 转膜1.5h；
（9）将PVDF膜取出放入到5%的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；
（10）孵育Nrf2和β-actin抗体，4℃孵育过夜；
（11）回收一抗，使用TBST洗膜3次，每次10min；
（12）孵育二抗，室温孵育1h，使用TBST洗膜3次，每次10min，暗室进行显影曝光。
实验结果如图3所示，可以看出，H2O2降低了Nrf2的蛋白表达，而抑制LOC107985688则可以部分的提高Nrf2的蛋白表达，该结果进一步验证了si- LOC107985688在逆转氧化损伤中的作用。
实施例4
抑制LOC107985688对于Caspase3酶活性的调控
（1）将SH-SY5Y细胞接种于6孔细胞培养板中，A组（转染si-NC但不进行H2O2处理），B组（转染si-NC并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），C组（转染si-LOC107985688-3并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），每组设置3个复孔；
（2）根据碧云天Caspase3活性检测试剂盒说明书，使用酶标仪测定A405吸光度下的吸光值，计算A，B,和C组的Caspase3酶活性。
实验结果如图4所示，从图中可以看出，H2O2处理后，B组中的Caspase3酶活力显著升高（B组Caspase3酶活力为1.403±0.029），而相较于B组，C组中酶活力的上调得到了一定的抑制（C组Caspase3酶活力为1.203±0.025，差异具有统计学意义），说明抑制LOC107985688能够降低H2O2所导致的Caspase3酶活力上调，即，抑制LOC107985688能够抑制H2O2所导致的神经细胞凋亡。
实施例5
抑制抑制LOC107985688对于凋亡相关蛋白BAX和BCL-2的调控
（1）将SH-SY5Y细胞接种于6孔细胞培养板中，A组（转染si-NC但不进行H2O2处理），B组（转染si-NC并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），C组（转染si-LOC107985688-3并且转染24h后添加250μmol/mL的H2O2），每组设置3个复孔；
（2）蛋白提取步骤和Western Blot步骤同实施例3。
实验结果如图5所示，从图中可以看出，抑制LOC107985688能够部分下调H2O2所导致的促凋亡蛋白BAX的上调，并且能够部分的上调H202所导致的抑凋亡蛋白BCL-2的下调，该结果进一步验证抑制LOC107985688能够抑制H2O2所导致的神经细胞凋亡。
序列表
<110> 山东大学齐鲁医院
青岛思拓新源细胞医学有限公司
<120> 一种用于儿童情感障碍的基因药物
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1061
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
ggatttggca accaaaagcc tgaaagcaac actagaagct atgcagacag atgagtttat 60
cgaaagagga aatgagtata tgagagcaaa gagcgaagaa ccatgggaag tgagaaaagc 120
tggtgggggg aagacaagga aggaacaact gcctgtgagc cttgaacaag ctacttccat 180
tttctggctc tttagtctcc tcatttgtaa aatgaggggg ctggagtaag taagctctat 240
aaggctctca gctgtgacat ctatgcataa tcacagaaga tcgaagtgta cagaacacca 300
tggaaactga agagagattc tgaaaggagg ctttaagagg tcacttgcat ccaatgctgc 360
agaagtgtca gagactgagg acttaaatga agccactgat tagcaattta aagatcctct 420
ccaagacagg gtctcactga gtgcagcggc acgatcttgg ctcactgcaa cctccgcctc 480
ccaggtccaa gcgattctcc tgcctcagcc tcctgagtag ctggcattac aggtatgaac 540
catcatgccc agctaatttt tgtgatttta gtagagacag ggtttcacca tgttgaccag 600
gctggtctgg aactcctgac ctcaagtgat ccgtctgcct cggcctccta aagtgctggg 660
attacaggca tgagccaccg tgcctggccg ctttctgcat ttttagtgtc actcaaccct 720
tgttgtctct gattgtcaag gcaacgacta cgtgtaaagt aatgtggaca gagtcttgga 780
cagagaaatg cctcagaaat gttttgtgat gaagatgaag gagaggcgct ggaagcagaa 840
actggggagg gggtaggatt cgtgtctcca cttactctcc accccagcag ggacagaaag 900
catgcctcct ctttcctgtt cattggctac attcctctct gaggccagag gggcaagctg 960
gacaatgcaa atgaactttg gatgagactt agccaagggg cctccaaagg gagagcagcg 1020
gggctgctta ggagggaata aaaaaataag gtggtcacct a 1061
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcuggacaau gcaaaugaac u 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uucauuugca uuguccagcu u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacagaagau cgaaguguac a 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uacacuucga ucuucuguga u 21
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<211> 21
<212> RNA
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acgacuacgu guaaaguaau g 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uuacuuuaca cguagucguu g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 10
gggaaggtga aggtcggagt 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggggtcattg atggcaaca 19
Claims (5)
1.一种用于制备抑郁症药物的LOC107985688 siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
2.一种用于治疗抑郁症的药物，其特征在于，所述药物包括LOC107985688 siRNA和药学上可接受的载体，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物形式包括气雾型药物、注射剂型药物和口服剂型药物。
4.LOC107985688 siRNA在制备神经细胞氧化损伤保护剂中的用途，其特征在于，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
5. LOC107985688 siRNA在制备抑制神经细胞凋亡抑制剂中的用途，其特征在于，所述siRNA的正义链为ACGACUACGUGUAAAGUAAUG，所述siRNA的反义链为UUACUUUACACGUAGUCGUUG。
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