CN114941025B - 用于诊断子痫前期的miRNA及其应用 - Google Patents

用于诊断子痫前期的miRNA及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114941025B
CN114941025B CN202210354910.4A CN202210354910A CN114941025B CN 114941025 B CN114941025 B CN 114941025B CN 202210354910 A CN202210354910 A CN 202210354910A CN 114941025 B CN114941025 B CN 114941025B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
preeclampsia
sample
subject
mirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210354910.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114941025A (zh
Inventor
许张晔
周猛
包思琪
周彤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Original Assignee
Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University filed Critical Second Affiliated Hospital and Yuying Childrens Hospital of Wenzhou Medical University
Priority to CN202210354910.4A priority Critical patent/CN114941025B/zh
Publication of CN114941025A publication Critical patent/CN114941025A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114941025B publication Critical patent/CN114941025B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于诊断子痫前期的miRNA及其应用，所述的miRNA包括miR‑196b‑5p、miR‑584‑5p、miR‑520f‑5p中的一种或多种。本发明提供了测量样品中所述的miRNA表达水平的试剂在制备诊断或预测子痫前期的工具中的应用。本发明还提供了一种诊断子痫前期或预测子痫前期风险的系统。

Description

用于诊断子痫前期的miRNA及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及用于诊断子痫前期的miRNA及其应用。
背景技术
子痫前期(Preeclampsia，PE)是一种全身性疾病，特征是妊娠20周后出现高血压、内皮细胞功能障碍、绒毛外细胞滋养细胞侵袭能力差以及胎盘和胎儿生长迟缓。这种多系统疾病影响了大约5-8％的妊娠，是对母婴都构成危险的最严重的妊娠并发症之一。全世界每年大约有7万名妇女和5万名婴儿死于这种疾病。
PE的病理生理学机制尚不清楚。滋养层细胞的增殖和迁移是维持妊娠成功的关键，在PE中，滋养层细胞对母体蜕膜的侵袭不足和母体螺旋动脉的重塑导致了病理的发生。有研究者认为，母体螺旋动脉重构功能障碍和流向胎盘的血流量减少与PE的发展有关，最终导致循环中促血管生成或抗血管生成因子的失衡，而不是来自缺血胎盘。一些研究支持这一理论，尤其是胎盘生长因子(PlGF)、妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)、抗血管生成可溶性fms-1型(sFlt-1)和可溶性内皮糖蛋白(sEng)具有在妊娠早期诊断和预测PE的能力。此外，由于缺乏较高的特异性和敏感性，上述因素并不是预测子痫前期的良好生物学指标。
miRNAs是单链(～22个核苷酸)的非编码RNAs，负责转录后基因表达调控的机制，通过序列特异性结合到目标mRNA转录本的3’-非翻译区。目前已知这些小分子在PE的发病机制中起关键作用，并被证明参与调节妊娠期间滋养层细胞从胎盘侵入。在循环中，可能在母体血浆中检测到，胎盘来源的miRNAs以微囊、外切体的形式释放，或与蛋白质结合，并具有相对稳定的。然而，将miRNAs作为诊断PE的可靠生物标志物的研究还处于起步阶段，几乎没有临床应用的研究。
发明内容
本发明的目的是提供用于诊断或预测子痫前期的miRNA。
为实现该目的，本发明采用了如下技术方案：
在一个方面中，本发明提供了用于测量样品中生物标志物的表达水平的试剂在制备工具中的应用，所述的工具用于诊断受试者是否患有子痫前期或预测受试者患子痫前期的风险，所述的生物标志物包括miR-196b-5p、miR-584-5p、miR-520f-5p中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，所述的生物标志物为miR-196b-5p和miR-584-5p的组合。
在一个实施方案中，所述的样品包括血液或组织。
在一个实施方案中，所述的受试者为人。
在一个实施方案中，所述的试剂包括通过聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片检测生物标志物的表达水平的试剂。
在一个优选的实施方案中，所述的聚合酶链反应包括实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应。
在一个实施方案中，所述的试剂包括探针、引物。
在一个优选的实施方案中，所述的探针包含以下标记：放射性核素、重金属、配体、荧光分子、化学发光分子、酶或类似物。
在一个实施方案中，所述的工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
在一个实施方案中，相对于对照受试者，所述的miR-196b-5p，或miR-584-5p在患有子痫前期或可能会患子痫前期的受试者中表达下调；或所述的miR-520f-5p在患有子痫前期或可能会患子痫前期的受试者中表达上调。
另一方面，本发明提供了一种诊断子痫前期或预测子痫前期风险的系统，所述的系统包括检测单元，所述的检测单元用于检测样品中生物标志物的表达水平，所述的生物标志物包括miR-196b-5p、miR-584-5p、miR-520f-5p中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，所述的生物标志物为miR-196b-5p和miR-584-5p的组合。
在一个实施方案中，所述的系统还包括信息获取单元，所述的信息获取单元用于执行获取受试者检测信息的操作，所述的检测信息包括所述生物标志物的表达水平。
在一个优选的实施方案中，所述的系统还包括分析单元，所述单元将信息获取单元得到的生物标志物的表达水平作为输入变量，输入子痫前期的诊断模型进行分析。更为优选的，所述的系统还包括评估单元，所述的评估单元用于输出样品对应的受试者患子痫前期或可能会患子痫前期的风险值。
另一方面，本发明还提供了生物标志物在构建前面所述的系统中的应用，所述的生物标志物包括miR-196b-5p、miR-584-5p、miR-520f-5p中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，所述的生物标志物为miR-196b-5p和miR-584-5p的组合。
附图说明
图1是miRNA差异表达结果图，其中，图A是miRNA差异表达统计图，图B是WMUcohort-1样本中五种miRNA表达的可视化图，图C是Mann-Whitney U检验评估miRNA的表达水平结果图；
图2是GSE114349数据集中miR-196b-5p、miR-584-5p联合用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图3是GSE114349数据集中miR-196b-5p用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图4是GSE114349数据集中miR-584-5p用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图5是GSE114349数据集中miR-196b-5p、miR-520f-5p联合用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图6是GSE114349数据集中miR-520f-5p用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图7是WMU cohort-3中miR-196b-5p、miR-584-5p联合用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图8是WMU cohort-3中miR-196b-5p用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图9是WMU cohort-3中miR-584-5p用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图10是WMU cohort-3中miR-196b-5p、miR-520f-5p联合用于诊断子痫前期的ROC曲线图；
图11是WMU cohort-3中miR-520f-5p用于诊断子痫前期的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明基于在子痫前期患者中的具有改变的表达水平的miRNA的鉴定。如本文描述和举例说明的，特定的miRNA在子痫前期患者中表达上调或下调。
如本文可交换使用，“miR”、“微小RNA”、“miR”、或“miRNA”指来自miR基因的未加工或加工的RNA转录物。由于miR不翻译成蛋白质，术语“miR”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为“miR前体”，并且一般含有长度约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可通过用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut或RNA酶III，例如大肠杆菌RNA酶III))消化加工为活性的19-25个核苷酸的RNA分子。这种活性的19-25个核苷酸的RNA分子还称为“加工的”miR基因转录物或“成熟”miRNA。应理解，如本文所用的术语“miR”可包括一种或多种miR-寡核苷酸，包括成熟miR、前-miR、pri-miR、或miR种子序列。
miRNA(miR)信息可获自Sanger研究所，其在http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/保持miRNA的注册。miRBase序列数据库包括核苷酸序列和来自各种来源的公布的miRNA的注释。miRBase注册为新的miRNA基因提供独特的名称，在公布前新的miRNA遵从传统的定名命名法。
在本发明中，可从受试者的样品中测量至少一种miRNA的表达水平。
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施方案中，动物是人。
术语“样品”是指体液样品，分离的细胞的样品或来自组织或器官的样品。体液样品可以通过公知的技术获得，并且包括，血液、尿液、淋巴液、痰液、腹水、支气管灌洗液或任意其他身体分泌物或其衍生物的样品。组织或器官样品可以从任意组织或器官获得，例如，通过组织活检获得。分离的细胞可以通过分离技术，如离心或细胞分选，从体液或组织或器官获得，例如，细胞、组织或器官样品可以从表达或产生生物标记的这些细胞、组织或器官获得。样品可以是冷冻的、新鲜的、固定的(例如，福尔马林固定的)、离心的和/或包埋的(例如，石蜡包埋的)等。当然，在评估样品中标记的量之前，细胞样品可以进行多种公知的收集后制备和存储技术(例如，核酸和/或蛋白提取，固定，保存，冷冻，超滤，浓缩，蒸发，离心等)。同样地，组织活检样品也可以进行收集后制备和存储技术，例如，固定。样品可以在治疗之前、治疗过程中或治疗后采集。样品可以从怀疑患有或诊断患有急性高山病并且因此可能需要治疗的患者采集，或者从不被怀疑患有任何病症的正常个体采集。在本发明的具体实施例中，所述的样品包括血液、组织。
在一个实施方案中，可从受试者中取出样品，并且可通过标准技术提取和分离DNA。例如，在某些实施方案中，可以在开始接受治疗之前从受试者获得样品。可从受试者的未受影响的样品、从正常人个体或正常个体的群体获得相应的对照样品。然后可将对照样品与来自受试者的样品一起进行处理，以便可将从来自受试者的样品中的miRNA水平与来自对照样品的miRNA水平进行比较。
在一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平高于对照样品中相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“上调”)。如本文中所使用的，当来自受试者的样品中miR基因产物的量大于对照(例如，参考标准，对照细胞样品，对照组织样品)中相同基因产物的量时，miR基因产物的表达“上调”。
在另一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平低于对照样品中相应miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“下调”)。如本文中所使用的，当从来自受试者的样品中的该基因产生的miR基因产物的量低于从对照样品中的相同基因产生的量时，miR基因的表达“下调”。
可根据一个或多个RNA表达标准确定对照和正常样品中相对miR基因表达。所述标准可包括例如标准细胞系中的miR基因表达水平、或从对照群体获得的miR基因表达的平均水平(例如对照参考标准)。
可以用本领域技术人员公知的各种技术(例如聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片)测量至少一种miR基因产物的水平。
在特定的实施方案中，通过下述测量至少一种miR基因产物的水平：逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA特异性探针寡核苷酸(例如包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交以提供受试样品的杂交特征谱，和将受试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。相对于对照样品，受试样品中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有特定病症或处于发展特定病症的风险中。
还可从基因特异性寡核苷酸探针(所述探针从已知的miRNA序列产生)制备微阵列。可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5’-胺修饰，并且使用可商购获得的微阵列系统例如GeneMachineOmniGridTM 100Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化的载玻片进行印制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡聚物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交物变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂交条件(例如在25℃下于6X SSPE/30％甲酰胺中进行18小时，然后在37℃下于0.75X TNT中清洗40分钟)下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置上，发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上的其中发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出信号由一列杂交事件组成，其标示了特定cDNA序列的相对丰度，从而标示了患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素蛋白-Alexa647缀合物直接检测包含生物素的转录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法扫描微阵列。阵列上的各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
使用阵列对于miRNA表达的检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点上鉴定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成熟分子和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用2.5μg总RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRNA(每物种数百个)允许对数个物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核苷酸探针。这样的工具允许分析各已知的miR在不同条件下的跨物种表达。
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于miRNome的大部分(优选整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于进行miR基因表达特征谱分析，以分析miR的表达模式。可使不同的miR特征(signature)与已建立的疾病标志物关联或直接与疾病状态关联。
本发明还提供了用于诊断子痫前期或预测子痫前期风险的系统。
应当理解，本文使用的“系统”、“装置”、“单元”是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。
所属技术领域的技术人员知道，本发明可以实现为设备、方法或计算机程序产品。因此，本公开可以具体实现为以下形式，即：可以是完全的硬件、也可以是完全的软件(包括固件、驻留软件、微代码等)，还可以是硬件和软件结合的形式，本文一般称为“单元”或“系统”。此外，在一些实施例中，本发明还可以实现为在一个或多个计算机可读介质中的计算机程序产品的形式，该计算机可读介质中包含计算机可读的程序代码。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实验方法
一、伦理声明
本研究经温州医科大学附属第二医院和育英儿童医院人类伦理委员会批准(批准号：LCKY2020-242)，并征得患者及其家属的知情同意。这项研究是根据该委员会制定的规定和指导方针进行的。
二、研究设计和患者信息
本研究于2020年6月至2021年12月在温州医科大学附属第二医院产科和温州医科大学育英儿童医院完成。血液样本取自在医疗干预之前禁食过夜(≈10小时)的剖腹产术前妇女。每次采集后于30分钟内制备血浆样本。胎盘样本按照记载在之前研究中的方法进行快速处理(WYATT S,KRAUS F,ROH C,et al.The correlation between sampling siteand gene expression in the term human placenta[J].Placenta,2005,26(5):372-9)。简而言之，就是将靠近脐带附着点的组织进行横切(～5cm)，剥离沿基板的蜕膜层和绒毛膜表面，将每个样品用冷生理盐水溶液中彻底冲洗后，置于液氮中冷冻。所有样品都保存在-80℃下，用于RNA提取。将纳入上述样品数据的数据集命名为WMU cohort，4种WMU cohort的具体信息如下：
WMU cohort-1为采用sRNA-seq获得的组织样本数据，样本数n＝10(5例PE患者VS5例健康对照)；
WMU cohort-2为采用qPCR获得的组织样本数据，样本数n＝40(20例PE患者VS 20例健康对照)；
WMU cohort-3为采用sRNA-seq获得的血浆样本数据，样本数n＝19(11例PE患者VS8例健康对照)；
WMU cohort-4为采用qPCR获得的血浆样本数据，样本数n＝38(19例PE患者VS 19例健康对照)。
本发明比较了从miRBase收集的2888条miRNAs在WMU cohort-1中的5例PE患者和5名健康对照的胎盘组织中的表达情况，并在WMU cohort-2中进行了验证，WMU cohort-2中包括20例PE患者和20名健康对照。本发明从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载了胎盘组织的数据集GSE114349(n＝41)，该数据集包含来自21名正常血压妇女和20名子痫前期妇女的胎盘组织样品。
临床和人口统计数据是在例行访问期间获得，并使用标准数据表进行记录。妊娠时间是根据早期超声确认的参与者最后一次正常月经期计算获得。PE患者的诊断标准是依据美国妇产科医师学会的技术公报(ACOG Practice Bulletin No.202:GestationalHypertension and Preeclampsia[J].Obstetrics and gynecology,2019,133(1):1.):收缩压(SBP)≥140mmHg，舒张压(DBP)≥90mmHg，在妊娠20周后的6小时间隔内至少测量两次，蛋白尿水平大于0.3g/24h或点状尿蛋白肌酐比大于300mg/mmol。如果患者出现以下一种或多种情况，则诊断为重度子痫前期:血压≥160/110mmHg，血小板减少症<100，000n/L，肝功能受损，视觉或大脑障碍，进行性肾功能不全或肺水肿。所有的PE患者都是初产妇或多胎产妇(范围1-2)。如果受试者的1小时葡萄糖耐量试验有异常，或存在其他疾病如高血压、心血管疾病、糖尿病、肾病或其他慢性全身性疾病，则被排除在外。
三、外周全血样本的miRNA表达谱分析。
(原始数据部分)微阵列分析：PE组和正常对照组血浆和胎盘组织中的miRNA组分。每个样品的总RNA量为1μg，作为小RNA库的输入材料。使用
Figure BDA0003582047270000091
Sample PrepKit for
Figure BDA0003582047270000092
生成测序文库。制造商的建议和索引代码被添加到每个样品的属性序列中。用SuperScrip II(ThermoFisher)合成第一链cDNA，在Qubit系统(Invitgen)上评价文库质量。在Nova6000平台(Illumina)上对原始数据准备进行测序。
四、miRNA定量
应用Fastp(0.20.1)去除原始测序读数的低质量读数和衔接子。使用miRdeep2mapper.pl命令，将过滤的干净测序读数映射到从ENSEMBL(版本95)获得的人类基因组GRCh38。然后执行miRDeep2.pl命令对已知的miRNA进行定量，从miRBase数据库(https://www.mirbase.org/)下载包含成熟miRNA序列及其相应前体序列的miRNA参考文件。
五、RT-PCR、定量实时PCR和miRNA表达分析
定量实时PCR分析用于验证miRNA表达。使用miRcute miRNA分离试剂盒(货号4992860,天晟生物,中国)从组织和血浆中分离RNA。第4992860号，田生物技术公司，中国)，并根据制造商的方案使用用于RT-PCR的PrimeScript RT Master Mix(罗氏诊断公司，美国)进行逆转录。对于miRNA表达分析，miRNA的定量通过使用对miRNA特异的Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR引物组(每组一个RT引物和一对qPCR引物)确定，这些引物由锐博生物公司设计。用于茎环RT成熟miRNA分析的所有试剂均获自锐博生物公司。使用SYBR SelectRreMix Ex Taq II(Takara Bio，日本)在Bio-Rad CFX96实时检测系统(Bio-Rad，美国)上进行实时PCR。数据被适当地归一化到U6(血浆)或cel-miR-39-3p(组织)水平。所有分析均采用2-ΔCt方法进行。
六、PE预测模型
单个miRNA的预测模型直接使用该miRNA的表达水平，cutoff使用该miRNA的表达中位值；miRNA的联合模型使用以径向基函数为核函数的SVM构建，预测样本为子痫的概率，以0.05为cutoff。
七、数据分析
所有统计分析和数字生成均使用统计软件R4.0.5版(https://www.r-project.org)以及R包'ggplot2'、'ggrepel'、'ggpubr'、'pheatmap'、'corrplot'、'pROC'、'logistf'、'caret'和'PRROC'。Mann Whitney U检验用于比较两个独立组之间的结果。采用受试者工作特征曲线下面积(AUROC)、查准率-查全率曲线、敏感性(TPR)、特异性(TNR)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和总体准确度(ACC)来衡量miRNA用于区分PE样本和正常对照样本的能力。
实施例1研究人群的临床特征
采集了孕妇的血浆样本和胎盘组织作为四个数据集的一部分。表1列出了每个数据集中患有和不患有PE的妇女的临床特征。在健康对照组和PE患者中，产妇年龄和BMI在统计学上相似(均p>0.05)。正如预期的那样，在所有数据集中，PE患者的术前收缩压(PreSBP)、术前舒张压(PreDBP)和尿蛋白均显著高于健康对照组。(均P<0.01)。与健康对照组相比，PE患者分娩的中位胎龄更早，平均出生体重更低。除数据集1外，尽管样本之间差异很大，但在与其他三个数据集的分析中，白蛋白和血尿素氮分别具有统计学意义。
表1四个数据集患者的临床特征
Figure BDA0003582047270000111
Figure BDA0003582047270000121
表1中这些值以平均值±标准差或n/N(％)的形式给出；P*值用于比较健康人和PE患者。BMI为怀孕期间的体重指数；PreSBP为术前收缩压；PreDBP为术前舒张压；ALB为白蛋白；GLOB为球蛋白；ALT为丙氨酸转氨酶；BUN为血尿素氮；BUN/CREA为血尿素氮/肌酐；GA为考虑到孕龄的可能性。
实施例2PE相关候选miRNA生物标志物的鉴定
当比较PE组和正常组之间的miRNAs表达谱时，鉴定了5个差异表达的miRNAs。其中，与正常胎盘样本相比，PE胎盘样本中发现两个和三个miRNA分别上调和下调(图1A)。图1B是WMU cohort-1样本中五种miRNA表达的可视化。然后，具体比较PE和正常对照样本之间5种miRNA的表达水平，并采用Mann-Whitney U检验评估两组之间5种miRNA的表达水平是否存在统计学差异(图1C)。
实施例3miRNA诊断效能分析
本发明所涉及的miRNA诊断效能如表2、3，图2-11所示，从该实验结果可知，miR-196b-5p、miR-584-5p、miR-520f-5p用于诊断子痫前期具有很好的诊断效能，且miR-196b-5p、miR-584-5p联合用于诊断子痫前期的效果优于单个miRNA。
表2miRNA在GSE114349数据集中的诊断效能数据
Figure BDA0003582047270000122
Figure BDA0003582047270000131
表3miRNA在WMU cohort-3中的诊断效能数据
miRNA AUC 灵敏性 特异性 精度
miR-196b-5p、miR-584-5p联合 0.966 1.000 0.625 0.842
miR-196b-5p 0.852 0.727 0.875 0.790
miR-584-5p 0.636 0.546 0.625 0.579
miR-196b-5p、miR-520f-5p联合 0.841 0.727 0.750 0.737
miR-520f-5p 0.625 0.364 0.875 0.579
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.检测样品中生物标志物组合的表达水平的试剂在制备诊断受试者是否患有子痫前期或预测受试者患子痫前期的风险产品中的应用，所述的生物标志物组合由miR-196b-5p和miR-584-5p组成，所述的样品为血液或组织，所述的miR-196b-5p和miR-584-5p在患有子痫前期或可能会患子痫前期的受试者中表达下调。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的受试者为人。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括通过PCR、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹检测生物标志物的表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR包括实时荧光定量PCR、逆转录PCR、竞争性PCR。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括探针、引物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的探针包含以下标记：放射性核素、重金属、配体、荧光分子、化学发光分子、酶。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括芯片、试剂盒、试纸。
8.样品中生物标志物组合表达水平的检测单元在构建诊断子痫前期或预测子痫前期风险的系统中的应用，其特征在于，所述的生物标志物组合由miR-196b-5p和miR-584-5p组成；所述的系统还包括信息获取单元，所述的信息获取单元用于执行获取受试者检测信息的操作，所述的检测信息包括所述生物标志物的表达水平；所述的系统还包括分析单元，所述单元将信息获取单元得到的生物标志物的表达水平作为输入变量，输入子痫前期的诊断模型进行分析；所述的系统还包括评估单元，所述的评估单元用于输出样品对应的受试者患子痫前期或可能会患子痫前期的风险值。
CN202210354910.4A 2022-04-06 2022-04-06 用于诊断子痫前期的miRNA及其应用 Active CN114941025B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210354910.4A CN114941025B (zh) 2022-04-06 2022-04-06 用于诊断子痫前期的miRNA及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210354910.4A CN114941025B (zh) 2022-04-06 2022-04-06 用于诊断子痫前期的miRNA及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114941025A CN114941025A (zh) 2022-08-26
CN114941025B true CN114941025B (zh) 2023-03-14

Family

ID=82908006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210354910.4A Active CN114941025B (zh) 2022-04-06 2022-04-06 用于诊断子痫前期的miRNA及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114941025B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103205430A (zh) * 2013-04-28 2013-07-17 夏彦恺 人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用
WO2014114802A1 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Charité - Universitätsmedizin Berlin Non-invasive prenatal genetic diagnostic methods
CN108588211A (zh) * 2018-05-02 2018-09-28 北京泱深生物信息技术有限公司 一种子痫前期的生物标志物及其应用
WO2019163900A1 (ja) * 2018-02-22 2019-08-29 国立大学法人大阪大学 Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法
US10435757B1 (en) * 2016-06-15 2019-10-08 University Of South Florida Methods of measuring C19MC miRNA in a post-natal tissue and uses thereof
CN113718028A (zh) * 2021-10-15 2021-11-30 青岛大学附属医院 基于微小rna的子痫前期诊断用途及组合物
CN113736877A (zh) * 2021-10-15 2021-12-03 青岛大学附属医院 基于微小RNA 27a的子痫前期诊断用途及组合物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210071180A1 (en) * 2018-04-23 2021-03-11 Board Of Regents, The Universy Of Texas System Microrna 584-5p compositions and methods for treating cancer

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014114802A1 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Charité - Universitätsmedizin Berlin Non-invasive prenatal genetic diagnostic methods
CN103205430A (zh) * 2013-04-28 2013-07-17 夏彦恺 人类重度子痫前期发生相关的血清微小核糖核酸标志物及其应用
US10435757B1 (en) * 2016-06-15 2019-10-08 University Of South Florida Methods of measuring C19MC miRNA in a post-natal tissue and uses thereof
WO2019163900A1 (ja) * 2018-02-22 2019-08-29 国立大学法人大阪大学 Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法
CN108588211A (zh) * 2018-05-02 2018-09-28 北京泱深生物信息技术有限公司 一种子痫前期的生物标志物及其应用
CN113718028A (zh) * 2021-10-15 2021-11-30 青岛大学附属医院 基于微小rna的子痫前期诊断用途及组合物
CN113736877A (zh) * 2021-10-15 2021-12-03 青岛大学附属医院 基于微小RNA 27a的子痫前期诊断用途及组合物

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Christine Akehurst et al..Differential expression of microRNA-206 and its target genes in preeclampsia.《Journal of Hypertension》.2015,第33卷(第10期),摘要、第2070页右栏第1段. *
Differential expression of microRNA-206 and its target genes in preeclampsia;Christine Akehurst et al.;《Journal of Hypertension》;20151031;第33卷(第10期);摘要、第2070页右栏第1段 *
子痫前期患者血浆miＲNA 及相关凝血功能指标的相关性分析;董方华 等;《广东医学》;20160831;第37卷(第16期);摘要、第2434页左栏第1段-第2436页右栏第2段及图1 *
子痫前期患者血浆miRNA表达谱的研究与分析;董方华 等;《现代医院》;20160630;第16卷(第6期);摘要、第789页左栏第1段-第800页右栏第3段 *
脐静脉血浆外泌体miRNA和子痫前期发病机制的相关研究;赵雪娅;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20220115(第01期);第15页第5段-第18页最后一段、第27页第1段及图2 *
董方华 等.子痫前期患者血浆miＲNA 及相关凝血功能指标的相关性分析.《广东医学》.2016,第37卷(第16期),摘要、第2434页左栏第1段-第2436页右栏第2段及图1. *
董方华 等.子痫前期患者血浆miRNA表达谱的研究与分析.《现代医院》.2016,第16卷(第6期),摘要、第789页左栏第1段-第800页右栏第3段. *
赵雪娅.脐静脉血浆外泌体miRNA和子痫前期发病机制的相关研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》.2022,(第01期),第15页第5段-第18页最后一段、第27页第1段及图2. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114941025A (zh) 2022-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Luque et al. Usefulness of circulating microRNAs for the prediction of early preeclampsia at first-trimester of pregnancy
Zhao et al. Diagnostic potential for miRNAs as biomarkers for pregnancy-specific diseases
JP2022519897A (ja) 対象の妊娠関連状態を決定するための方法及びシステム
Hromadnikova et al. First trimester screening of circulating C19MC microRNAs can predict subsequent onset of gestational hypertension
JP2006515517A (ja) 妊娠障害診断マーカーとしての血中ｍＲＮＡ
JP2018524972A (ja) 肺癌の診断または検出のための方法及び組成物
WO2016149759A1 (en) Methods and systems for determining risk of a pregnancy complication occurring
Kim et al. Maternal plasma miRNAs as potential biomarkers for detecting risk of small-for-gestational-age births
CN109504784B (zh) 用于预测人辅助生殖技术中早期胚胎质量的miRNA分子标志及其应用
US20210148899A1 (en) Circulating rna signatures specific to preeclampsia
EP2759602A1 (en) Non-invasive prenatal genetic diagnostic methods
US20130316351A1 (en) Methods and kits for diagnosing conditions related to hypoxia
CA2953368A1 (en) Methods for diagnosing risk of renal allograft fibrosis and rejection
US11149315B2 (en) Method for predicting cervical shortening and preterm birth
US20150038358A1 (en) Methods for detecting trisomy 21
US20230135486A1 (en) Circulating rna signatures specific to preeclampsia
CN114941025B (zh) 用于诊断子痫前期的miRNA及其应用
JP2022510488A (ja) 胎盤機能不全のための核酸バイオマーカー
US10954564B2 (en) Combinations of cell free nucleic acids
CN113755570B (zh) 用于预测不明原因复发性流产的生物标志物及应用
KR102505618B1 (ko) 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
KR102505617B1 (ko) 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
CN111944893A (zh) 与唇腭裂产前无创诊断相关的miRNA分子标志物及其应用
US20170342495A1 (en) Markers of preterm birth
EP4183888A1 (en) Mirna signature for identification of the receptive endometrium

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant