CN113718028A - 基于微小rna的子痫前期诊断用途及组合物 - Google Patents

基于微小rna的子痫前期诊断用途及组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种诊断受试者是否具有子痫前期或处于子痫前期的风险中的方法，还提供了微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用及用于检测子痫前期的诊断组合物，本发明血浆中微小RNA的表达在子痫前期患者中的表达明显增加，可作为一个有价值的、简单方便、易于动态监测子痫前期的诊断指标；同时，胎盘组织中微小RNA的增加也是一个潜在的、预测子痫前期的诊断指标。

Description

基于微小RNA的子痫前期诊断用途及组合物
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及外周血微小RNA 486在诊治子痫前期中的应用。
背景技术
在目前的市场上公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
子痫前期(PE)是一种病因学不明的妊娠特发性疾病，目前该病估计可影响全世界2-8％的孕产妇的妊娠，是全世界孕产妇和围产儿的主要死亡原因之一。根据《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》，子痫前期为妊娠20周后孕妇出现收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg，伴有下列任意1项：尿蛋白定量≥0.3g/24h，或尿蛋白/肌酐比值≥0.3,或随机尿蛋白≥(+)(无条件进行蛋白定量时的检查方法)；无蛋白尿但伴有以下任何1种器官或系统受累：心、肺、肝、肾等重要器官，或血液系统、消化系统、神经系统的异常改变，胎盘-胎儿受到累及等。
子痫前期可以根据诊断在34周之前和34周之后，将该病细分为早发性(EOPE)和晚发性(LOPE)两种表型。然而这两种表型研究发现有着不同的病因和发病机制，妊娠早期胎盘发育受损和螺旋动脉重构受损通常与EOPE有关，而LOPE可能与母体内皮功能障碍有关。又可以根据该病的严重程度将该病分为轻度子痫前期患者和重度子痫前期患者。近年来，人们一直在寻找非侵入性的生物标记物来诊断和预测子痫前期。其中，最重要的是血管生成相关标记物之一，VEGF家族的成员，预计将被期望作为预测和诊断PE的有效生物标记物进行评估。虽然sFlt-1/胎盘生长因子(PIGF)比率在过去几年被认为是一个新的标记，然而通常在孕晚期该比率才表现出变化而无法早期预测子痫前期的风险，因此我们仍然需要寻找新的无创标记物。
微小RNA(miRNAs/miRs)是内源性小的非编码RNA分子，通常长22-24个核苷酸，通过与3’-非翻译区(UTR)配对来调节靶基因的表达，从而调节下游mRNA的翻译。miRNAs在分化，增殖，凋亡和稳态调节等多种细胞过程中发挥着重要的作用，同时miRNA在循环中的高度稳定，允许了它们在各种疾病中作为生物标志物存在，如癌症，心血管疾病等疾病。目前预测子痫前期针对外周血中微小RNA鲜有报道。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于微小RNA的子痫前期诊断用途及组合物。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“PE”是指：子痫前期。
术语“EOPE”是指：早发性子痫前期。
术语“LOPE”是指：晚发性子痫前期。
术语“EDTA”是指：乙二胺四乙酸。
术语“PCR”是指：聚合酶链反应。
术语“Real-time PCR”、“qPCR”是指：实时荧光定量PCR。
术语“Trizol试剂”是指：一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
术语“LSD”是指：最小显著性差异法。
术语“ROC曲线”是指：受试者工作特征曲线。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种诊断受试者是否具有子痫前期或处于子痫前期的风险中的方法，其包括测定来自所述受试者的受试样品中的微小RNA的水平，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的微小RNA水平的改变表明受试者具有子痫前期或处于子痫前期的风险中。
本发明的第二方面提供了微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自所述受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有子痫前期或处于子痫前期的风险中，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明受试者具有子痫前期或处于子痫前期的风险中。
根据本发明第一方面或第二方面的方法/应用，其中受试样品中的微小RNA的水平低于对照样品中的相应微小RNA的水平。
根据本发明第一方面或第二方面的方法/应用，其中所述受试者是子痫前期患者。
根据本发明第一方面或第二方面的方法/应用，其中所述受试者是妊娠期孕产妇受试者，优选地，所述受试者是妊娠20周后出现收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg的孕妇。
根据本发明第一方面或第二方面的方法/应用，其中所述微小RNA为miRNA-486，优选地，所述微小RNA选自miRNA-486-1、miRNA-486-2、miRNA-486-5p和miRNA-486-3p中的一种或更多种，更优选地，所述微小RNA为miRNA-486-5p。
根据本发明第一方面或第二方面的方法/应用，其中所述受试样品来自组织和/或体液，其中：所述组织优选为胎盘组织，所述体液优选为血浆，更优选为静脉血。
本发明的第三方面提供了一种用于检测子痫前期的诊断组合物，其中所述诊断组合物包含微小RNA的特异性探针/检测引物；其中所述微小RNA优选为miRNA-486，更优选选自miRNA-486-1、miRNA-486-2、miRNA-486-5p和miRNA-486-3p中的一种或更多种，最优选为miRNA-486-5p。
根据本发明第二方面的应用或根据本发明第三方面的诊断组合物，其中所述特异性探针/检测引物的核酸序列包含SEQ ID NO:1。
本发明的第四方面提供了微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自妊娠期孕产妇的受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有子痫前期或处于子痫前期的风险中，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明受试者具有子痫前期或处于子痫前期的风险中，所述微小RNA为miRNA-486-5p；其中受试样品中的miRNA-486-5p的水平高于对照样品中的相应微小RNA的水平。
本发明的基于微小RNA的子痫前期诊断用途及组合物可以具有但不限于以下有益效果：
1、微小RNA在PE的胎盘组织，外周血单个核细胞层和血浆中表达增高。
2、血浆和外周血单个核细胞层中微小RNA和收缩压、舒张压、平均动脉压呈现明显的正相关。
3、通过ROC曲线分析和ROC曲线下面积(AUC)的计算，结果表明微小RNA对子痫前期有一定诊断价值。
4、血浆和外周血单个核细胞层中微小RNA的表达在子痫前期患者中的表达明显增加，提示其可作为一个有价值的、简单方便、易于动态监测子痫前期的诊断指标。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例7胎盘样本中miR-486-5p的扩增曲线。
图2示出了实施例7外周血单个核细胞样本中miR-486-5p的扩增曲线。
图3示出了实施例7血浆样本中miR-486-5p的扩增曲线。
图4示出了实施例9胎盘样本中miR-486-5p在子痫前期患者中的表达水平。
图5示出了实施例9外周血单个核细胞样本中miR-486-5p在子痫前期患者中的表达水平。
图6示出了实施例9血浆样本中miR-486-5p在子痫前期患者中的表达水平。
图7示出了实施例9血浆中miR-486-5p在重度子痫前期患者与对照组间的统计学差异。
图8示出了实施例9血浆中miR-486-5p在晚发型子痫前期与对照组间的统计学差异。
图9示出了实施例9外周血单个核细胞中miR-486-5p在轻度子痫前期患者，重度子痫前期患者与对照组间的统计学差异。
图10示出了实施例9外周血单个核细胞中miR-486-5p在早发型子痫前期患者，晚发型子痫前期患者与对照组间的统计学差异。
图11示出了实施例9血浆中miR-486-5p诊断子痫前期的AUC值。
图12示出了实例例9外周血单个核细胞中miR-486-5p诊断子痫前期的AUC值。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
Trizol试剂、TaKaRa Mir-X miRNAFirst-Strand Synthesis试剂盒、TBGreenTM预混料ExTaqTM试剂盒，购自TaKaRa公司，大连，中国。
仪器：
高速冷冻离心机，Microfuge 21R，购自赛默飞公司，上海，中国。
全自动医用PCR分析系统，SLAN-96S,购自宏石医疗科技有限公司，上海，中国。
实施例1研究对象
在该研究中，从2019年01月至2021年06月，产前诊断实验室收集的病历资料共200例，分为子痫前期(PE)组和正常对照组，收集其病例资料、胎盘组织样本、静脉血。
实施例2胎盘组织标本的收集
剖宫产娩出胎盘后，立即在无菌状态下于胎盘母体面中央取两块胎盘各约1cm×1cm×1cm大小及蜕膜组织少许，标本放入无菌Eppendorf管，15min内置于液氮中保存，以待RNA提取。采用Real-time PCR检测各组胎盘组织中miR-486-5p水平。
实施例3静脉血的收集
孕妇于生育前抽取5ml的静脉血，收集到EDTA真空管中。将抽取的静脉血在30分钟内置于4℃及1500g的离心机中离心15分钟后分离出血浆，白膜层以待RNA提取。
实施例4RNA的提取
根据试剂的使用说明，用Trizol试剂(TaKaRa)分离总RNA，具体步骤如下：将胎盘组织加入适量的Trizol试剂后匀浆，另外白膜层和血浆分别加入适量的Trizol试剂后充分混匀，静置5分钟，加入1/5初始量的氯仿，剧烈震荡后室温静置5分钟，12000×g离心15分钟后将上清液移至新的离心管中，加入与上清液等量体积的异丙醇后充分混合，静置10分钟，12,000×g离心10分钟，用等量的75％乙醇清洗沉淀，7,500×g离心5分钟，弃上清保留沉淀，干燥后溶解于适量的无RNA酶的水中。
实施例5逆转录获得RNA
逆转录反应应用TaKaRa Mir-X miRNAFirst-Strand Synthesis试剂盒(TaKaRa,大连,中国)。5微升的mRQ的缓冲液，3.75微升的总RNA以及1.25微升的mRQ酶混匀，总体积为10微升的混合液在37摄氏度下孵育1小时，然后在85摄氏度下终止5分钟，使酶失活。
实施例6实时定量聚合酶链反应
采用TBGreenTM预混料ExTaqTM试剂盒(TaKaRa,大连,中国)在进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)。每孔加入10微升的TB Green Premix Ex TaqII，0.8微升的前引物和后引物，2微升的DNA模板以及6.4微升的水混匀，同样的体积配置U6内参混合液，将总体积为20微升的混合液在95摄氏度下预变性30秒，然后在95摄氏度下反应5秒，60摄氏度下反应20秒，同时将该两种PCR反应进行40个循环，最后在95摄氏度反应5秒，60摄氏度反应30秒。
实施例7分析引物的特异性及扩增效率
根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，图1示出了实施例7胎盘样本中miR-486-5p的扩增曲线；图2示出了实施例7外周血单个核细胞样本中miR-486-5p的扩增曲线；图3示出了实施例7血浆样本中miR-486-5p的扩增曲线。采用相对量法与内参U6进行目的基因相对表达量的分析。
计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。
引物信息，详细信息见表1：
Homo sapiens microRNA486-1(MIR486-1),microRNA
NCBI Reference Sequence:NR_030161.1
表1引物信息
引物名称 引物序列SEQ ID NO:1 Tm值
hsa-miR-486-5p-F CUGUACUGAGCUGCCCCGA 58
实施例8数据处理
运用SPSS 20.0和GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，计数资料以频数或率(％)的形式表示，采用χ2检验。采用Pearson分析法分析miRNA相对表达量与相关指标的相关性，采用ROC分析miRNA对PE的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。
实施例9研究结果：
1、miR-486-5p在PE的胎盘组织中表达增加
如图4所示，30例对照组和30例子痫前期患者的胎盘样本中qPCR证实miR-486-5p在子痫前期患者中的表达水平明显增加。
2、miR-486-5p在PE的外周血单个核细胞中表达增加
如图5所示，100例健康妊娠妇女和100例子痫前期患者的血浆样本中qPCR证实miR-486-5p在子痫前期患者中的表达水平明显增加。
3、miR-486-5p在PE的血浆中表达增加
如图6所示，100例健康妊娠妇女和100例子痫前期患者的血浆样本中qPCR证实miR-486-5p在子痫前期患者中的表达水平明显增加。
4、血浆中miR-486-5p与血压之间的相关关系
如表2所示，通过皮尔逊相关分析，所有血浆样本中miR-486-5p与收缩压和平均动脉压呈现明显的正相关。
表2所有血浆样本中miR-486-5p和血压值的相关关系
—— 收缩压 舒张压 平均动脉压
miR-486-5p皮尔逊相关性 0.220 0.129 0.169
P值 0.004** 0.091 0.026*
5、外周血单个核细胞中miR-486-5p与血压之间的相关关系
如表3所示，通过皮尔逊相关分析，所有外周血单个核细胞样本中miR-486-5p与收缩压，舒张压和平均动脉压呈现明显的正相关。
表3所有外周血单个核细胞样本中miR-486-5p和血压值的相关关系
—— 收缩压 舒张压 平均动脉压
miR-486-5p皮尔逊相关性 0.286 0.237 0.268
P值 0.000** 0.004** 0.001**
6、各组别之间miR-486-5p存在差异性表达
如图7所示，血浆样本中miR-486-5p在重度子痫前期患者与对照组间差异存在统计学差异。
如图8所示，在早发型子痫前期，晚发型子痫前期和对照组之间，血浆样本中miR-486-5p在晚发型子痫前期和对照组间存在统计学差异。
如图9所示，外周血单个核细胞中miR-486-5p在重度子痫前期，轻度子痫前期患者与对照组差异存在统计学差异。
如图10所示，外周血单个核细胞中miR-486-5p在早发型子痫前期患者，晚发型子痫前期患者与对照组间存在统计学差异。
7、血浆中miR-486-5p对子痫前期的诊断价值
如图11所示，通过ROC曲线分析和ROC曲线下面积(AUC)的计算，结果显示出血浆miR-486-5p诊断子痫前期的AUC值为0.5621(95％CI:0.4801到0.6442)。如图12所示，外周血单个核细胞miR-486-5p诊断子痫前期的AUC值为0.6557(95％CI:0.5684到0.7430)，该结果表明miR-486-5p对子痫前期有一定诊断意义。
综上，本发明的研究显示，血浆和外周血单个核细胞中miR-486-5p的表达在子痫前期患者中的表达明显增加，提示其可作为一个有价值的、简单方便、易于动态监测子痫前期的诊断指标。同时，本发明的结果也提示胎盘组织miR-486-5p的增加也是一个潜在的、预测子痫前期的诊断指标。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 青岛大学附属医院
<120> 基于微小RNA的子痫前期诊断用途及组合物
<130> YZDI-210064
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
cuguacugag cugccccga 19

Claims (10)

1.一种诊断受试者是否具有子痫前期或处于子痫前期的风险中的方法，其包括测定来自所述受试者的受试样品中的微小RNA的水平，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的微小RNA水平的改变表明受试者具有子痫前期或处于子痫前期的风险中。
2.微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自所述受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有子痫前期或处于子痫前期的风险中，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明受试者具有子痫前期或处于子痫前期的风险中。
3.根据权利要求1或2的方法/应用，其中受试样品中的微小RNA的水平高于对照样品中的相应微小RNA的水平。
4.根据权利要求1-3任一项的方法/应用，其中所述受试者是子痫前期患者。
5.根据权利要求1-4任一项的方法/应用，其中所述受试者是妊娠期孕产妇受试者，优选地，所述受试者是妊娠20周后出现收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg的孕妇。
6.根据权利要求1-5任一项的方法/应用，其中所述微小RNA为miRNA-486，优选地，所述微小RNA选自miRNA-486-1、miRNA-486-2、miRNA-486-5p和miRNA-486-3p中的一种或更多种，更优选地，所述微小RNA为miRNA-486-5p。
7.权利要求1-6任一项的方法/应用，其中所述受试样品来自组织和/或体液，其中：所述组织优选为胎盘组织，所述体液优选为血浆，更优选为静脉血。
8.一种用于检测子痫前期的诊断组合物，其中所述诊断组合物包含微小RNA的特异性探针/检测引物；其中所述微小RNA优选为miRNA-486，更优选选自miRNA-486-1、miRNA-486-2、miRNA-486-5p和miRNA-486-3p中的一种或更多种，最优选为miRNA-486-5p。
9.根据权利要求2-7任一项的应用，或根据权利要求8的诊断组合物，其中所述特异性探针/检测引物的核酸序列包含SEQ ID NO:1。
10.微小RNA和/或所述微小RNA的特异性探针/检测引物在制备诊断组合物中的应用，其中所述诊断组合物用于通过测定来自妊娠期孕产妇的受试者的受试样品中的上述微小RNA的水平从而诊断受试者是否具有子痫前期或处于子痫前期的风险中，其中相对于对照样品中的相应微小RNA的水平，受试样品中的所述微小RNA水平的改变表明受试者具有子痫前期或处于子痫前期的风险中，所述微小RNA为miRNA-486-5p；其中受试样品中的miRNA-486-5p的水平高于对照样品中的相应微小RNA的水平。
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