CN105838804A - MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于血液病辅助诊断试剂领域，具体涉及一种MiR‑17‑5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用，包括MiR‑17‑5p的qPCR上游引物，序列为：5’‑GCCGCCAAAGTGCTTACA‑3’以及MiR‑17‑5p的qPCR下游引物，序列为：5’‑CAGAGCAGGGTCCGAGGTA‑3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3’。本发明作为一种辅助诊断试剂，灵敏度强，特异性高，目的是通过快速检测MiR‑17‑5p预估患者是否有恶性血液疾病的可能，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检测依据，具有较大的临床应用价值。

Description

MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用
技术领域
本发明属于血液病辅助诊断试剂领域，具体涉及一种MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂及应用。
背景技术
血液系统肿瘤已成为威胁人类生命的主要疾病之一，恶性血液病是一类难治性血液系统肿瘤，其特点在于治疗棘手，生存期短，预后差，且具体发病机制至今尚未明了。在对恶性血液病的干预治疗中，如果能对疾病做出早期诊断并达到良好的评估，对于改善患者的临床缓解率及预后评估提供有效的帮助，提高生存与治愈率。
MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约19-24nt的非编码单链RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因3’UTR区部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而调控转录后靶基因的表达。近年来研究发现，miRNAs与血细胞分化调控及血液肿瘤的发生、发展、诊断和治疗等密切相关，这也提示我们从miRNAs入手可能为恶性血液病的诊断和治疗提供新的思路和手段。
恶性血液病包括骨髓异常增生综合征(MDS)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)以及再生障碍性贫血(AA)等。MiR-17在基因组水平上定位于人类染色体13q31.3，本研究主要以MDS、AML以及CML为例，阐明MiR-17-5p表达量的检测对于恶性血液病早期诊断的意义。实验中我们发现与正常人样本相比，MiR-17-5p在恶性血液病患者中表达明显上调，提示MiR17-5p可能作为恶性血液病诊疗的有效靶点。
目前越来越多的研究表明miRNAs在恶性血液病的风险评估和发病机制中发挥着重要的作用，目前针对恶性血液病的诊断尚无明确的分子标记物。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的之一是提供一种灵敏度强、特异性高、能快速检测MiR-17-5p以预估患者是否有恶性血液疾病的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂。
本发明的目的之二是提供MiR-17-5p在制备恶性血液病辅助诊断试剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物，序列为：5’-GCCGCCAAAGTGCTTACA-3’以及MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列为：5’-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。
还包括MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物，逆转录引物均具有茎环结构。上述逆转录引物是采用CN200610027217.7的专利的原理设计而成的。
所述的MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物为逆转录反应体系的一部分，MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液均为10uM，使用时将MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液等比例(同体积)混合，稀释10倍制成浓度为1uM的逆转录引物混合液。上述贮存液的溶剂为蒸馏水。U6是一类核小分子RNA，U6逆转录引物以这类小分子RNA为模版逆转录后得到cDNA，在qPCR体系中作为内参。值得一提的是，逆转录引物不局限于本发明的逆转录引物，任意能扩增出MiR-17-5p或U6的cDNA(后续用于MiR-17-5p或U6的qPCR)的逆转录引物均能实现发明目的，该部分引物的设计为现有技术，不再赘述。
逆转录反应体系总体积是20ul，具体如下：
另：5×反应缓冲液包括250mM Tris-HCl pH 8.3、250mM KCl、20mM MgCl250mTDDT；x为RNA模板的体积。
还包括分离单核细胞以及总RNA提取试剂；分离单核细胞所需试剂：淋巴细胞分离液和1640培养基；RNA提取所需试剂：①PBS缓冲液，浓度为0.01M，pH7.4；②氯仿，纯度为99.7％；③异丙醇，纯度为99.7％；④乙醇，浓度为95％，其中含5％的0.1％DEPC溶液；⑤DPEC溶液，DPEC浓度为0.1％。
qPCR反应体系如下，每个反应管总体积是20ul：
若是MiR-17-5p反应管，则qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物和下游引物；逆转录反应产物为采用MiR-17-5p逆转录引物得到的反应产物；
若是内参U6反应管，则qPCR引物是U6qPCR上游引物和下游引物；逆转录反应产物为采用U6逆转录引物得到的反应产物。
本发明作为一种辅助诊断试剂，灵敏度强，特异性高，目的是通过快速检测MiR-17-5p预估患者是否有恶性血液疾病的可能，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检测依据，具有较大的临床应用价值。同时拟采用细胞增殖、细胞分化、流式分析、基因芯片、双荧光素报告酶基因等体外研究手段，揭示MiR-17-5p在恶性血液病中发挥的功能和调控机制，以及作为相关辅助诊断的依据。
附图说明
图1为本发明的恶心血液病辅助诊断试剂的使用流程图；
图2为MiR-17-5p扩增曲线图；
图3为MiR-17-5p溶解曲线图；
图4为MDS样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比图；
图5为MDS相对高危组(MDS-RAEB)与低危组(MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD)之间MiR-17-5p的检测对比图；
图6为AML样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比图；
图7为恶性血液病(MDS/AML/CML)之间MiR-17-5p的检测对比图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例详细地说明本发明所涉及实施例的技术方案。
MiR-17在基因组水平上定位于人类染色体13q31.3，MiR17-5p的具体位置为X染色体:1391350605-1391350688。
实验流程
根据图1，恶性血液病辅助诊断试剂的使用流程如下：特异的茎环逆转录引物与定量PCR引物的设计及合成；骨髓样品通过Ficoll密度梯度离心法提取单核细胞；单核细胞总RNA的提取；RNA定量及质量检测；使用茎环引物进行逆转录(RNA:500ng/体系)；qRT-PCR检测分析。
采用NanoDrop2000超微量分光光度计检测RNA浓度及OD值，OD260/280值在1.8～2.0之间；茎环逆转录引物是一种专门设计的茎环结构引物，“茎”部分的碱基的互补和堆积能增加RNA-DNA杂交复合物的热稳定性，茎环结构的空间约束力相比于传统的线性逆转录引物来说，更有助于提高反应的特异性，MiR17-5p逆转录引物与MiR17-5p 3’端特异性结合后，在逆转录酶作用下进行逆转录反应。
一、引物设计和合成
实验中所涉及的逆转录引物和qPCR引物均委托苏州吉玛基因公司合成，MiR-17-5p及内参U6 qPCR引物序列(均为DNA)如表1：
表1 MiR-17-5p及内参U6 qPCR引物序列
二、分离单核细胞以及总RNA的提取
通过Ficoll密度梯度离心法从骨髓样本中分离出单核细胞，并从单核细胞提取总RNA；具体如下：
单核细胞分离步骤：
①在试管中加入5-6ml淋巴细胞分离液，在上层缓慢地加入骨髓或外周血，使骨髓或外周血与淋巴细胞分离液形成一层清晰的分界，2200rpm/min离心20min；
②使用吸管吸取白膜层。加入10ml 1640培养基(即RPMI-1640细胞培养基)吹打洗涤后1000rpm离心，弃上清，再次加入适量1640培养基将沉淀的细胞吹打混匀。
③显微镜下计数，调整细胞浓度到2×107/ml。加入等量的“冻存保护液”，使细胞终浓度为1×107/ml。将细胞吹打混匀后分装到冻存管中，冻存管放入程控降温盒中，最后将程控降温盒置于-80℃冰箱中过夜。冻存保护液由9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成，份数为体积份数。
RNA提取所需试剂：
①PBS缓冲液，浓度为0.01M，pH7.4
②氯仿，纯度为99.7％
③异丙醇，纯度为99.7％
④乙醇，浓度为95％(其中含5％的0.1％DEPC溶液)
⑤DPEC溶液，浓度为0.1％，以上百分比为溶剂占总溶液的体积百分数。
氯仿和异丙醇的纯度指的是氯仿或异丙醇占整个溶液的体积百分比；乙醇的浓度指乙醇占整个溶液的体积百分比，整个溶液还含体积百分比为5％的DEPC溶液，其中DEPC溶液中DEPC的体积百分比为0.1％，DEPC溶液的溶剂为水。
总RNA提取步骤：
1、将冻存管中体积为1ml的单核细胞以13000rpm离心8分钟，弃去上清，用1ml0.01M PBS(pH 7.4)吹打悬浮后再以13000rpm离心8分钟，收集沉淀；
2、用1ml TRIzol充分吹打悬浮沉淀，直至沉淀溶解，加入200ul纯度为99.7％的氯仿溶液，上下摇晃30S，不要太剧烈，完全混合后静置2min，13000rpm离心8min；
3、离心后吸取上清液，尽量避免吸到下层液体，再加入同等体积的浓度为99.7％的异丙醇，吸打混合后静置2min，13000rpm离心8min；
4、尽量吸弃上清，加入500ul 95％乙醇(含5％体积的0.1％DEPC)吹打后再13000rpm离心8min，倒掉乙醇，待EP管中乙醇挥发后用含0.1％DEPC溶液溶解，-80摄氏度冻存。
三、反转录
以mRNA为模板，逆转录500ng RNA合成第一链。
20ul逆转录体系，反应条件：
逆转录体系(每个反应管总体积是20ul)如下：
另：5×反应缓冲液包括250mM Tris-HCl(pH 8.3)、250mM KCl、20mM MgCl250mTDDT。
反应条件：
1、65℃ 5分钟
2、25℃ 5分钟
3、42℃ 60分钟
4、70℃ 5分钟
四、SYBR荧光定量检测
以逆转录产物为模板进行q-PCR反应
qPCR反应体系如下(每个反应管总体积是20ul)：
若是MiR-17-5p反应管，则qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物序列：5’-GCCGCCAAAGTGCTTACA-3’和下游引物序列：5’-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3’；逆转录反应产物为采用MiR-17-5p逆转录引物得到的反应产物。
若是内参U6反应管，则qPCR引物是U6qPCR上游引物序列：
5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’和下游引物序列：
5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，逆转录反应产物为采用U6逆转录引物得到的反应产物。
qPCR反应条件如下：
Step1：50℃ 2分钟
Step2：95℃ 10分钟
循环数：40，包括以下2个步骤：
Step3：95℃ 15秒
60℃ 1分钟。
五、本发明的检测效果
从扩增曲线(图2)看出，本发明的扩增体系及条件应用合理；溶解曲线(图3)中单一的溶解峰也表明产物单一特异性较好。其中扩增曲线横坐标表示qPCR扩增的循环数，纵坐标表示随着循环数的增加PCR产物扩增量。
溶解曲线横坐标表示溶解分析的温度区间，纵坐标表示扩增产物与染料结合的一个溶解峰值，是一个荧光信号值。在定量PCR实验中，常用溶解曲线来进一步分析反应产物的特异性。通常是在整个反应结束后，加设一段升温降温程序，由于SYBR GREEN是一种非特异性结合DNA双链的染料，扩增后也可能和反应中的引物二聚体或杂带非特异性结合，而释放荧光信号，会导致仪器检测的信号不仅仅是目的基因，所以需要在反应结束后设定一个升温过程，然后慢慢把温度降下来，由于不同DNA片段的解链温度不同，这时若PCR产物纯，则只会出现一个荧光溶解峰，因为只对应一个温度值；若有引物二聚体或其他非特异性条带，则会在其他温度处出现另外的溶解峰，这是一种PCR扩增特异性的检测方法。分析时并不是将扩增产物溶解在溶液中，直接是qPCR程序扩增完后在仪器上添加的一个溶解分析。
六、MiR-17-5p在各类样本中的表达
(1)MDS样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比，结果见图4。
20例正常人样本，27例确诊的MDS样本，统计学分析P<0.001，表明MDS样本中MiR-17-5p表达量与正常人相比，显著上调。
(2)MDS相对高危组(MDS-RAEB)与低危组(MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD)之间MiR-17-5p的检测对比，结果见图5。
20例正常人样本，27例确诊的MDS样本，其中11例MDS-RAEB高危患者，16例MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD型患者，统计学分析P<0.01，实验数据表明MDS高危患者中，MiR-17-5p表达量相较于低危组也有明显上调。
(3)AML样本与正常人样本MiR-17-5p的检测对比，结果见图6。
AML样本共19例，其中M1型7例，M2型3例，M2a型3例，M5型1例，M5b型5例；AML患者与正常人相比，MiR-17-5p平均上调4倍。
(4)恶性血液病(MDS/AML/CML)之间MiR-17-5p的检测对比，结果见图7。
图7表示在MDS、AML、CML群体样本中，MiR-17-5p的相对表达量高于正常样本群体，P<0.01，有显著的统计学意义。图4-7纵坐标表示MiR-17-5p的相对表达量。
以上数据均显示，在恶性血液病如急性髓细胞白血病(AML)、骨髓异常增生综合征(MDS)患者和慢性髓性白血病(CML)样本中，MiR-17-5p均呈现出异常上调趋势。
MicroRNA在恶性血液病中的研究逐年增多，其在生物体内的调控功能也越来越凸显，由于目前生物标志物主要是功能蛋白和特定基因或SNP，起重要调控作用的MicroRNA作为诊断标记物研究相对较少，导致其在临床诊断中的作用被忽略。我们的研究发现，在恶性血液疾病中，MiR-17-5p均有明显上调趋势，明显高于正常人群，同时MDS不同类型之间有一定差异，我们的结果中看出高危组样本平均表达量也高于低危组样本，提示MiR-17-5p的表达可能对推断MDS的病程有潜在的指导意义，而MDS较之AML上调倍数更为明显；同时，针对恶性血液病细胞中的功能实验也验证了MiR-17-5p可能参与调控细胞增殖、周期和分化等重要的生物学过程。因此，在对恶性血液病有一定的早期诊断作用的研究基础上，鉴于MiR-17-5p可能成为恶性血液病的早期诊断的辅助诊断指标，本发明从实际应用出发，我们试图这一操作简单、灵敏度高且特异性强的检测MiR-17-5p表达的手段引入恶性血液病的辅助诊断中，对临床恶性血液病的诊疗和预后提供分子检测依据，具有较大的临床应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物，序列为：5’-GCCGCCAAAGTGCTTACA-3’以及MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列为：5’-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3’；还包括扩增内参U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’；以及U6的qPCR反向引物，序列为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。
2.根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，还包括MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物，逆转录引物均具有茎环结构。
3.根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，所述的MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物为逆转录反应体系的一部分，MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液均为10uM，使用时将MiR-17-5p逆转录引物和U6逆转录引物贮存液等比例混合，稀释10倍制成浓度为1uM的逆转录引物混合液。
4.根据权利要求3所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，逆转录反应体系总体积是20ul，具体如下：
另：5×反应缓冲液包括250mM Tris-HCl pH 8.3、250mM KCl、20mM MgCl2 50mT DDT；x为RNA模板的体积。
5.根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，还包括分离单核细胞以及总RNA提取试剂；分离单核细胞所需试剂：淋巴细胞分离液和1640培养基；RNA提取所需试剂：①PBS缓冲液，浓度为0.01M，pH7.4；②氯仿，纯度为99.7％；③异丙醇，纯度为99.7％；④乙醇，浓度为95％，其中含5％的0.1％DEPC溶液；⑤DPEC溶液，DPEC浓度为0.1％。
6.根据权利要求1所述的MiR-17-5p恶性血液病辅助诊断试剂，其特征在于，qPCR反应体系如下，每个反应管总体积是20ul：
若是MiR-17-5p反应管，则qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物和下游引物；逆转录反应产物为采用MiR-17-5p逆转录引物得到的反应产物；
若是内参U6反应管，则qPCR引物是U6qPCR上游引物和下游引物；逆转录反应产物为采用U6逆转录引物得到的反应产物。
7.MiR-17-5p在制备恶性血液病辅助诊断试剂中的应用。
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