CN109182497A - hsa-miR-17-5p作为类风湿关节炎诊断标志物的应用 - Google Patents
hsa-miR-17-5p作为类风湿关节炎诊断标志物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了hsa‑miR‑17‑5p作为类风湿关节炎诊断标志物的应用。本发明首次证实了hsa‑miR‑17‑5p在类风湿关节炎患者滑膜组织中高表达,且可分泌到血清中,而且类风湿关节炎患者血清中hsa‑miR‑17‑5p水平显著升高。因此,本发明提供了一种新的类风湿关节炎诊断标志物,即血清hsa‑miR‑17‑5p,对类风湿关节炎患者具有较好的诊断作用,且特异性好,灵敏度高,克服了现有类风湿关节炎诊断标志物类风湿因子RF和抗环瓜氨酸抗体ACPA特异性差,灵敏度不够的缺点,对类风湿关节炎具有较好的诊断价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,更具体地,涉及hsa-miR-17-5p作为类风湿关节炎诊断标志物的应用。
背景技术
风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,其病理特征为炎症反应和炎症细胞因子分泌增多。RA临床表现为长期慢性炎症浸润、关节疼痛、关节肿大和关节畸形,对人类健康和生活带来极大伤害。流行病学研究发现世界女性类风湿关节炎发病率约为1.16%,男性为0.44%。目前,类风湿关节炎已成为亟待解决的公共卫生问题,也是临床研究的热点。研究显示,早期诊断和治疗类风湿关节炎有效地改善病人生活质量和预后。类风湿关节炎发病过程缓慢,病程久,长达十几年。类风湿关节炎发展到后期导致关机畸形和破坏,严重影响患者的生活和健康,给社会和家庭带来巨大的经济压力。
目前,现有的类风湿关节炎的诊断方法包括血清标志物、影像学和临床症状,但是这些指标往往在疾病发展到一定阶段才出现,影响疾病的诊断和治疗。血清学检测对类风湿关节炎至关重要,比如,类风湿因子RF和抗环瓜氨酸抗体ACPA,但是,这两个指标特异性和敏感性存在一定的缺陷。因此,寻找特异性好、灵敏度高的血清标志物对诊断类风湿关节炎尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有类风湿关节炎病诊断标志物特异性不好,灵敏度不高的问题,提供血清hsa-miR-17-5p作为类风湿关节炎诊断标志物的应用,为类风湿关节炎病的诊断提供新的靶点,并且对类风湿关节炎诊断有良好的临床应用价值。
本发明的第一个目的是提供hsa-miR-17-5p作为诊断鉴别类风湿关节炎和骨关节置换的标志物的应用。
本发明的第二个目的是提供hsa-miR-17-5p或其检测试剂在制备诊断鉴别类风湿关节炎和骨关节置换的试剂盒和/或制剂方面的应用。
本发明的第三个目的是提供hsa-miR-17-5p在作为类风湿关节炎检测标志物的应用。
本发明的第四个目的是提供hsa-miR-17-5p在制备类风湿关节炎诊断试剂盒方面的应用。
本发明的第五个目的是提供一组检测血清hsa-miR-17-5p的引物对。
本发明的第六个目的是提供一种类风湿关节炎检测诊断试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
具体地,首先,我们利用qRT-PCR方法检测类风湿关节炎患者滑膜组织和骨关节置换病人滑膜组织hsa-miR-17-5p(序列如SEQ ID NO.1所示)的表达水平,发现类风湿关节炎患者hsa-miR-17-5p表达水平明显高于骨关节置换病人滑膜组织。同时,我们收集类风湿关节炎患者血清和健康人血清,用qRT-PCR方法检测hsa-miR-17-5p的表达水平,发现类风湿关节炎患者血清hsa-miR-17-5p表达水平明显高于健康人血清。
此外,我们利用ROC曲线分析血清中hsa-miR-17-5p在类风湿关节炎患者中的诊断作用,结果显示hsa-miR-17-5p可作为类风湿关节炎的诊断标志物,AUC面积为0.864,表明血清hsa-miR-17-5p对类风湿关节炎的诊断具有较好价值,且发现hsa-miR-17-5p表达水平对类风湿关节炎诊断的敏感性和特异性分别为80%和80%,95%置信区间为0.751~0.977,具有特异性好,灵敏度高特点。
因此,以下应用均应在本发明的保护范围之内;
hsa-miR-17-5p作为诊断鉴别类风湿关节炎和骨关节置换的标志物的应用,以及hsa-miR-17-5p或其检测试剂在制备诊断鉴别类风湿关节炎和骨关节置换的试剂盒和/或制剂方面的应用。所述hsa-miR-17-5p是指滑膜组织中hsa-miR-17-5p。
hsa-miR-17-5p作为类风湿关节炎检测标志物的应用,hsa-miR-17-5p或其检测试剂在制备类风湿关节炎诊断试剂盒和/或制剂方面的应用。所述hsa-miR-17-5p是指血清中hsa-miR-17-5p。
hsa-miR-17-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还请求保护一组检测hsa-miR-17-5p的引物对,核苷酸序列依次如SEQ IDNO:2~3所示:
hsa-miR-17-5p-F(SEQ ID NO.2):5’-CGGCGGCAAAGTGCTTACAG-3’
hsa-miR-17-5p-R(SEQ ID NO.3):5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’。
本发明还请求保护上述引物对在制备类风湿关节炎检测诊断试剂盒和/或制剂方面的应用。
所述诊断试剂盒和/或制剂能检测hsa-miR-17-5p的表达水平,表达水平升高则患有类风湿关节炎。
本发明还请求保护一种类风湿关节炎检测诊断试剂盒,试剂盒包含检测血清hsa-miR-17-5p表达水平的试剂。
优选地,所述试剂盒包括SEQ ID NO:2~3所示的引物对。
优选地,所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒,包括检测血清hsa-miR-17-5p表达水平的荧光定量PCR反应体系。
优选地,所述荧光定量PCR反应条件为:96℃3min,60℃40s,45个循环。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种新的类风湿关节炎诊断标志物,即hsa-miR-17-5p,首次证实了hsa-miR-17-5p在类风湿关节炎患者滑膜组织中高表达,hsa-miR-17-5p可分泌到血清中,而且类风湿关节炎患者血清中hsa-miR-17-5p水平显著升高;另外,利用ROC曲线分析,结果显示,hsa-miR-17-5p表达水平对类风湿关节炎诊断的敏感性和特异性分别为80%和80%。因此,hsa-miR-17-5p可作为诊断鉴别类风湿关节炎和骨关节置换的标志物,血清中hsa-miR-17-5p可作为类风湿关节炎诊断标志物,克服了现有类风湿关节炎诊断标志物类风湿因子RF和抗环瓜氨酸抗体ACPA特异性和敏感性差的问题,具有特异性好、灵敏度高的特点,对类风湿关节炎诊断有良好的临床应用价值。
附图说明
图1是类风湿关节炎患者和骨关节置换病人滑膜组织hsa-miR-17-5p表达水平。类风湿关节炎患者和骨关节置换病人各取3例,数据采用均数±标准差表示,***p<0.001。
图2是类风湿关节炎患者和健康人血清hsa-miR-17-5p表达水平。类风湿关节炎患者和健康人各取20例,数据采用均数±标准差表示,***p<0.001。
图3是hsa-miR-17-5p诊断类风湿关节炎的ROC曲线。(A)ROC曲线分析血清hsa-miR-17-5p对类风湿关节炎的诊断应用价值,(B)ROC曲线分析血清hsa-miR-17-5p对类风湿关节炎诊断应用价值的相关指标。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 qRT-PCR检测类风湿关节炎患者滑膜组织hsa-miR-17-5p水平
1、制备cDNA
类风湿关节炎患者滑膜组织和骨关节置换病人的滑膜组织来源于广州医科大学附属第三医院。滑膜组织采用无菌收集,手术后取关节滑膜组织于干净无菌的50mL离心管中,置于冰上,于无菌操作台剥除脂肪组织、骨头、血管等后,用PBS洗3遍。采用QIAGEN公司miRNeasy Micro Kit提取RNA,逆转录成cDNA。
2、PCR检测
以cDNA为模板,按照miScript SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN公司)的操作说明,以表1所示引物,进行qRT-PCR实验;
表1、qRT-PCR引物
PCR反应参数:96℃30s;96℃3min,60℃40s,45个循环。以上实验重复三次,以U6为内对照,通过2-△△CT法计算各组之间hsa-miR-17-5p表达水平的差异;按照下列公式计算样本的相对表达量:△Ct=Cthsa-miR-17-5p–CtU6。
3、结论
如附图1所示,与骨关节置换病人的滑膜组织相比,类风湿关节炎患者滑膜组织hsa-miR-17-5p表达水平明显升高。
实施例2 qRT-PCR检测类风湿关节炎患者血清中hsa-miR-17-5p水平
1、制备cDNA
类风湿关节炎患者血清和健康人血清来源于广州医科大学附属第三医院。血清于高速冷冻离心机10000rpm,10min,去除细胞碎片。采用QIAGEN公司miRNeasy Serum/PlasmaKit提取RNA,逆转录成cDNA。
2、PCR检测
以cDNA为模板,按照miScript SYBR GreenPCR试剂盒(QIAGEN公司)的操作说明,以表2所示引物,进行qRT-PCR实验;
PCR反应参数:96℃3min,60℃40s,45个循环。以上实验重复三次,以cel-miR-39为内对照,通过2-△△CT法计算各组之间hsa-miR-17-5p表达水平的差异;按照下列公式计算样本的相对表达量:△Ct=Cthsa-miR-17-5p–Ctcel-miR-39。
3、结论:如附图2所示,与健康人血清相比,类风湿关节炎患者血清中hsa-miR-17-5p表达水平明显升高。
实施例3 ROC曲线分析hsa-miR-17-5p表达水平在类风湿关节炎患者中的诊断作用
1、采用SPSS17.0软件分析血清中hsa-miR-17-5p在类风湿关节炎患者中的诊断作用。
2、结论:ROC曲线如附图3中A图所示,结果显示AUC面积为0.864,表明血清中hsa-miR-17-5p对类风湿关节炎的诊断具有较好的价值;同时,对类风湿关节炎诊断应用价值的相关指标的ROC曲线进行分析,结果如附图3中B图所示,表明:hsa-miR-17-5p对类风湿关节炎的诊断敏感性和特异性分别为80%和80%;95%置信区间为0.751~0.977,具有特异性好,灵敏度高的特点。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例,但本发明并不局限于上述实施例,即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)
<120> hsa-miR-17-5p作为类风湿关节炎诊断标志物的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcagaataa tgtcaaagtg cttacagtgc aggtagtgat atgtgcatct actgcagtga 60
aggcacttgt agcattatgg tgac 84
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcggcaaa gtgcttacag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtgcagggt ccgaggtat 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccgggtgt aaatcagctt g 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgcagggt ccgaggtat 19
Claims (10)
1.hsa-miR-17-5p作为诊断鉴别类风湿关节炎和骨关节置换的标志物的应用。
2. hsa-miR-17-5p或其检测试剂在制备诊断鉴别类风湿关节炎和骨关节置换的试剂盒和/或制剂方面的应用。
3. hsa-miR-17-5p作为类风湿关节炎检测标志物的应用。
4. hsa-miR-17-5p或其检测试剂在制备类风湿关节炎诊断试剂盒和/或制剂方面的应用。
5.根据权利要求3~4任一所述应用,其特征在于,hsa-miR-17-5p是指血清中hsa-miR-17-5p。
6. 一组检测血清hsa-miR-17-5p的引物对,其特征在于,核苷酸序列依次如SEQ IDNO: 2~3所示。
7.权利要求6所述引物对在制备类风湿关节炎诊断试剂盒中的应用。
8.一种类风湿关节炎检测诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含检测血清hsa-miR-17-5p表达水平的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求6所述引物对。
10.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒,包括检测血清hsa-miR-17-5p表达水平的荧光定量PCR反应体系。
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