JP7187081B2 - 液体生検多重癌遺伝子バイオマーカーを用いた乳癌の早期診断および治療後のモニタリング方法 - Google Patents

液体生検多重癌遺伝子バイオマーカーを用いた乳癌の早期診断および治療後のモニタリング方法 Download PDF

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Description

本発明は、多重癌遺伝子バイオマーカーを用いた乳癌の早期診断および治療後のモニタリング方法に関し、より具体的には、エクソソーム内多重遺伝子発現分析を用いた乳癌の早期診断および治療後のモニタリングのための非侵襲的方法等に関する。
乳癌は、世界の女性癌発病率１位であり、韓国でも甲状腺癌の次に女性に最もありふれた癌であって、乳癌検診のためには、微細石灰化敏感度に優れたＸ線基盤の乳房撮影術（ｍａｍｍｏｇｒａｐｈｙ）が主に使用されるが、乳癌発生の危険因子と知られた緻密型乳房を有する女性では、Ｘ線乳房撮影術の敏感度が顕著に低くなる限界点を有していて、追加的な乳房超音波検査を行わなければならず、超音波検査の特性上、検査時間が相対的に長く、検査者に対する依存度が大きいという短所がある。また、乳癌組織生検（ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｙ）を通した侵襲的方法（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ）の乳癌診断法は、検査者の苦痛、感染による副作用および入院と検査後に回復期間を必要とするという問題点を有している。したがって、液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）を用いた乳癌早期診断法の開発は非常に至急であり、これは、組織生検回数を減らし、Ｘ線乳房撮影術の低い敏感度を克服できるものと期待される。
現在まで開発された液体生検を用いた乳癌診断法は、診断に使用されるバイオマーカーが極めて少数に過ぎず、大部分のバイオマーカーが乳癌４期だけで高い敏感度を示すので、癌早期診断に大きな困難があり、全世界的に体液を用いた新しい癌遺伝子診断法の開発が活発に行われている。代表的な液体生検を用いた乳癌遺伝子診断技術としては、血液内腫瘍細胞死滅の結果として腫瘍細胞から放出された血液内循環する腫瘍由来の循環ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ）を分析する遺伝子検査技術がある。この技術（ｃｔＤＮＡ遺伝子分析法）は、主に特定遺伝子の突然変異（ＢＲＡＣＡ１／２ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の有無を分析する方法であって、癌の早期診断よりは、未来の癌誘発可能性の予測にさらに適した技術であり、抗癌剤治療効果の予測（ＨＥＲ２ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅｒａｐｙ）により個人オーダーメード治療剤の選択に非常に効果的な技術である。ただし、初期段階の小さい腫瘍の場合、血液内ｃｔＤＮＡのｈａｌｆ－ｌｉｆｅは、１時間内外であって、結果の安定性と再現性が低いだけでなく、ｃｔＤＮＡのレベルが個人ごとに異なり、検出することも難しいので（低い検出効率、低い純度、低い敏感度）、高感度検出方法の開発を必要とするのが現状である。
一方、乳癌手術を受けた後にも、再発有無の確認のために定期検診を必要とするが、乳癌手術後の再発には、（１）局所再発と（２）全身再発（遠隔転移）の2つに分けられる。局所再発とは、手術部位および胸壁、脇のリンパ節等に再発したことを言い、全身再発とは、肺、骨、肝、脳、卵巣等人体の他の臓器に再発することを言う。再発は、大部分手術後５年以内に多く発生するので、５年間は、少なくとも６ヶ月に１回ずつ、その後は、一生の間に１年に１回ずつ定期検診を受けなければならない。乳癌定期検診項目としては、代表的に（１）医師の診察（乳房の他の部位および反対側の乳房に癌が新しく発生したか否かを観察）、（２）乳房の写真撮影、（３）腫瘍標識子（ＣＡ１５－３）血液検査、（４）肝機能血液検査、（５）胸部の肺写真（肺に転移があるか否かを観察）、（６）全身同位元素骨スキャン（ｂｏｎｅ ｓｃａｎ）（骨に転移があるか否かを観察するが、腫瘍標識子検査および肝機能検査で異常が発見されたり、骨の痛みのような症状がある場合に施行し、ただし、乳癌２期中盤以上の患者は、６ヶ月間隔で規則的に施行）、（７）肝超音波検査（検査が必要であると疑われる場合にのみ施行）、および（８）脳コンピュータ（ＣＴ）撮影（検査が必要であると疑われる場合にのみ施行）が含まれる。ただし、上記のように現在施行される乳癌再発モニタリングのための定期検診検査項目は、高費用だけでなく、検査者の不便さを招き、多くの時間を必要とするという短所がある。したがって、高い検出度、低費用で検査者の苦痛なしに簡単にかつ短時間に結果を得ることができる治療後のモニタリング方法を開発することが切実に要求されている。
本発明は、上記のような従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定して、乳癌および乳癌の分子サブタイプ別に早期診断する方法等を提供することを目的とする。
また、本発明は、エクソソーム内のｍＲＮＡを用いてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定して、乳癌治療後の再発モニタリング方法を提供することを目的とする。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、（ａ）正常人および被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子のｍＲＮＡレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌と判定する段階を含む、乳癌の早期診断のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）正常人および被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子のｍＲＮＡレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌と判定する段階を含む、乳癌の早期診断方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記乳癌は、Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ、ＨＥＲ２ ｔｙｐｅ、およびＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅからなる分子サブタイプ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ）群から選ばれ得る。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、およびＨＣＣＲ１遺伝子のｍＲＮＡレベルがカベオリン－１、ベータ－カテニン、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプの乳癌の早期診断のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、およびＨＣＣＲ１遺伝子のｍＲＮＡレベルがカベオリン－１、ベータ－カテニン、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプの乳癌の早期診断方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプは、ＥＲ陽性（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、ＰＲ陽性（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、およびＨＥＲ２陰性（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｎｅｇａｔｉｖｅ）である。
また、本発明の他の具現例において、前記被検者は、乳癌患者である。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルがＨＣＣＲ１、カベオリン－１、およびベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプの乳癌の早期診断のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルがＨＣＣＲ１、カベオリン－１、およびベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプの乳癌の早期診断方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプは、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性である。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルがＨＣＣＲ１、カベオリン－１、およびベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅの乳癌の早期診断のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルがＨＣＣＲ１、カベオリン－１、およびベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅの乳癌の早期診断方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅは、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陽性である。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記カベオリン－１遺伝子のｍＲＮＡレベルがＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、ＨＣＣＲ１、ベータ－カテニン、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプの乳癌の早期診断のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン、および形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記カベオリン－１遺伝子のｍＲＮＡレベルがＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、ＨＣＣＲ１、ベータ－カテニン、およびＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプの乳癌の早期診断方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプは、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陰性である。
また、本発明において前記生物学的試料は、血液および尿を含む。
また、本発明のさらに他の具現例において、前記ＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子は、癌の生成および増殖に関与する遺伝子である。
また、本発明のさらに他の具現例において、前記ＨＣＣＲ１遺伝子は、癌の進行に関与する遺伝子である。
また、本発明のさらに他の具現例において、前記ＴＧＦ－β３遺伝子は、腫瘍免疫反応に関与する遺伝子である。
また、本発明のさらに他の具現例において、前記カベオリン－１およびベータ－カテニン遺伝子は、癌幹細胞および抗癌剤耐性に関与する遺伝子である。
また、本発明は、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌の早期診断用組成物を提供する。
また、本発明は、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌の早期診断用キットを提供する。
本発明のさらに他の具現例において、前記ｍＲＮＡレベルを測定する物質は、ｍＲＮＡを増幅させることができるプライマーまたはプローブであり得る。
また、本発明は、（ａ）正常人および被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子のｍＲＮＡレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌が再発したものと判定する段階を含む、乳癌治療後の再発モニタリング方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記被検者は、乳癌治療を受けたヒトであり得る。
また、本発明は、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌治療後の再発モニタリングキットを提供する。
本発明者らは、血液内リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ；ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）から保護され得る二重脂質膜構造（ｌｉｐｉｄｓ ｂｉｌａｙｅｒ）のエクソソーム内部にあるｍＲＮＡを分析する技術を開発し、前記技術を通じて診断の正確性および再現性を高めることができると判断したところ、乳癌は、分子サブタイプ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ）の分類が明確であり、標的治療が効果的に行われているので、本発明は、乳癌分子サブタイプ別の早期診断に適用可能な最小限の多重癌遺伝子バイオマーカー技術を通じて、４つの分子サブタイプの乳癌を早期診断することを可能にし、発現程度によって乳癌進行程度を判断することができ、高い検出感度の技術的特徴によりエクソソーム内多重遺伝子発現分析を用いて乳癌治療後の再発有無をモニタリングすることを可能にする。これに加えて、現在施行される乳癌再発モニタリングのための定期検診検査項目は、高費用だけでなく、検査者の不便さを招き、多くの時間を必要とするという短所があるが、本発明において開発される製品は、高い検出度で低費用で検査者の苦痛なしに簡単に且つ短時間に結果を得ることができるという点から非常に有用であるので、乳癌治療後に再発有無のモニタリングのための遺伝子体外診断用医療機器の開発に広く活用され得るものと期待される。
乳癌由来のエクソソームで選定された６個のバイオマーカー遺伝子（ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、ＨＣＣＲ１、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１、β－ｃａｔｅｎｉｎ、およびＴＧＦ－β３）を乳癌分子サブタイプ別に細胞株に処理して発現レベルを分析した結果を示す図である。 乳癌由来のエクソソームで確保した５個のバイオマーカー遺伝子（ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、ＨＣＣＲ１、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１、およびＴＧＦ－β３）を健常者と乳癌患者ｐｏｏｌｉｎｇサンプルを対象に発現レベルを確認した図である。 ５×１０５個以上の乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）が４８時間の間分泌したエクソソームをスパイクテスト（Ｓｐｉｋｅ ｔｅｓｔ）した場合に、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲのＣｔ値を確認した図である。
本発明者らは、血液内リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ；ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）から保護され得る二重脂質膜構造（ｌｉｐｉｄｓ ｂｉｌａｙｅｒ）のエクソソーム内部にあるｍＲＮＡを分析する技術を開発し、前記技術を通じて診断の正確性および再現性を高めることができると判断したところ、これに基づいて液体生検多重癌遺伝子バイオマーカーを用いた乳癌の早期診断方法および乳癌治療後の再発有無のモニタリングのための遺伝子体外診断用医療機器の開発可能性があることを確認することによって、本発明を完成した。
また、乳癌は、分子サブタイプ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ）の分類が明確であり、標的治療が効果的に行われているので、本発明者らは、前記乳癌分子サブタイプ別の早期診断に適用可能な最小限の多重癌遺伝子バイオマーカーを発見し、４つの分子サブタイプの乳癌の早期診断方法、発現程度によって乳癌進行程度を判断する方法、高い検出感度の技術的特徴により乳癌治療後の再発有無を確認できるモニタリング、および特定遺伝子バイオマーカー発現レベルで高危険群と低危険群の癌患者に区分できる方法等を提供しようとする。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明の一実施例では、乳癌細胞株由来のエクソソームを用いた実験を通じて選定された６個の遺伝子（ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、ＨＣＣＲ１、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１、β－ｃａｔｅｎｉｎ、およびＴＧＦ－β３）を、図１に示されたように、乳癌分子サブタイプ別の細胞株２個ずつ（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ／ＢＴ４７４、ＺＲ－７５－１／ＳＫ－ＢＲ３、ＭＤＡ－ＭＢ４５３／ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＴ２０）で独立して３回以上発現レベルを分析した。その結果、癌の生成および増殖において重要な役割をするＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１の場合、ＥＲおよびＰＲ陽性とＨＥＲ２陽性においてそれぞれ正の相関関係を示し、癌の進行に関与するＨＣＣＲ１遺伝子の場合、ＥＲおよびＰＲ陽性と正の相関関係を示した。また、癌幹細胞と抗癌剤耐性に重要な機能をするｃａｖｅｏｌｉｎ－１およびβ－ｃａｔｅｎｉｎの場合、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ分子サブタイプ（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２－）と深い相関関係を予想したが、期待とは異なって、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１のみがｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ分子サブタイプで特異的に高い発現が観察され、ＴＧＦ－β３の場合は、ＨＥＲ２陽性と正の相関関係を確認した（実施例１参照）。
本発明の他の実施例では、乳癌由来のエクソソームで確保した５個のバイオマーカー遺伝子を健常者と乳癌患者ｐｏｏｌｉｎｇサンプルを対象に発現レベルを確認した結果、ＡＮＴ２とＶＤＡＣ１が、乳癌分子サブタイプと関係なく、最も大きい差異を示すことを確認した（実施例２参照）。
本発明のさらに他の実施例では、本発明が検出敏感度が高いことを実験を通じて明らかにし、乳癌再発モニタリングに有用であるという点を証明するために、正常血液に乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１：ＥＲ－／ＰＲ－／ＨＥＲ２－）をスパイクテストして検出可能な癌細胞数を予測した結果、５×１０５個以上の乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）が４８時間の間分泌したエクソソームをスパイクテストした場合に、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲのＣｔ値が３５未満であることを確認したところ、結果的に遺伝子検出可能な範囲であることを確認した（実施例３参照）。
したがって、本発明は、（ａ）正常人および被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階；（ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する段階；および（ｃ）前記ＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子のｍＲＮＡレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌と判定する段階を含む、乳癌の早期診断のための情報提供方法を提供する。
本発明に使用される用語「エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、細胞から分泌される二重脂質膜（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ）を有している小さい形態の小胞体を包括的に意味し、エクソソームは、多様な細胞から分泌され、略３０～２００ｎｍの直径を有しているものと知られている。このようなエクソソーム内には、細胞に由来した多様な種類のタンパク質、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ等が含まれている。
本発明に使用される用語「生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」とは、非侵襲的に獲得され得る試料であって、エクソソームを含んでいるすべての試料を意味し、好ましくは、血液、血しょう、血清、骨髄、組織、細胞、唾液、喀痰、髪の毛、尿等てあり得、より好ましくは、血液、尿等や、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ １；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上の多重癌遺伝子バイオマーカーのｍＲＮＡ量を測定できる試料であれば、これに制限されない。
本発明に使用される用語「分子サブタイプ」とは、疾病の診断や治療等臨床に用いるための分子診断による分類タイプを意味し、最近、患者の身体を分子レベルでプロファイリングすることができることによって、それによる標的治療法の開発につながり、疾病の分類方式も変わっている傾向にある。前記分類による分子サブタイプは、癌治療および癌患者の予後と密接な関連があり、好ましくは、乳癌であり、それによる乳癌の分子サブタイプタイプは、Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ、ＨＥＲ２ ｔｙｐｅ、およびＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅであるが、これに制限されない。
また、前記分子サブタイプタイプのうちＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプは、ＥＲ陽性（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、ＰＲ陽性（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、およびＨＥＲ２陰性（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｎｅｇａｔｉｖｅ）であることを特徴とし、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプは、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性であることを特徴とし、分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅは、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陽性であることを特徴とし、分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプは、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陰性であることを特徴とするが、これに制限されない。
前記ＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子は、癌の生成および増殖に関与する遺伝子であることを特徴とし、前記ＨＣＣＲ１遺伝子は、癌の進行に関与する遺伝子であることを特徴とし、前記ＴＧＦ－β３遺伝子は、腫瘍免疫反応に関与する遺伝子であることを特徴とし、前記カベオリン－１およびベータ－カテニン遺伝子は、癌幹細胞および抗癌剤耐性に関与する遺伝子であることを特徴とするが、これに制限されない。
また、本発明は、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌の早期診断用組成物を提供する。
また、本発明は、アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン（β－ｃａｔｅｎｉｎ）、および形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のｍＲＮＡレベルを測定する物質を含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌の早期診断用キットを提供する。
前記エクソソームは、血液または尿から分離され得るが、これに制限されず、前記ｍＲＮＡレベルを測定する物質は、ｍＲＮＡを増幅させることができるプライマーまたはプローブであることを特徴とするが、これに制限されない。
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．乳癌の早期診断用多重遺伝子バイオマーカー選別
１－１．分子サブタイプ別の乳癌細胞株培養
分子サブタイプ別の乳癌細胞株を下記表１のように韓国細胞株銀行から購買した後に培養した。
Figure 0007187081000001
培養条件は、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）と１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）を使用して５％ＣＯ２、３７℃の条件の細胞培養器で培養した。
１－２．乳癌細胞株由来のエクソソーム抽出
乳癌細胞株が分泌するエクソソームを抽出するために、エクソソームが除去されたＦＢＳ（ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ）が含まれた細胞培養液を使用した。培養液を交替する前に、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で２回洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）し、培養液を交替した後、４８時間の間５％ ＣＯ２、３７℃条件の細胞培養器で培養することによって、エクソソーム濃縮を誘導し、ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ（ｕｌｔｒａｃｅｌ－３Ｋ）を用いて培養液の体積を１／１０に濃縮した後、ＳＢＩ Ｅｘｏｑｕｉｃｋ ＴＣ試薬を用いてエクソソームを得た。
１－３．エクソソーム内ＲＮＡｓ抽出
（株）ジェノリューションで生産販売するエクソソーム内ＲＮＡ抽出試薬を使用してエクソソーム内ＲＮＡを抽出した。この際、エクソソーム内ＲＮＡを抽出する原理は、培養液内のエクソソームを分解（ｌｙｓｉｓ）させ、エクソソームから流れ出たタンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）の中からＲＮＡのみを分離し、この際、タンパク質とＤＮＡが汚染されないように最適化して純度を高め、ＲＮＡｓ抽出濃度（ＲＮＡ ｐｒｅｐ ｙｉｅｌｄ）を最大化できる抽出過程（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を構築した。
１－４．抽出したエクソソーム内ＲＮＡ定量
乳癌細胞株培養液から抽出したエクソソーム内ＲＮＡ濃度を定量するために、ｎａｎｏ－ｄｒｏｐ（波長２６０ｎｍで吸光度）を使用して濃度測定をし、２６０／２８０ｒａｔｉｏと２６０／２３０ｒａｔｉｏを通じてＲＮＡ純度および汚染度を確認して、正常範囲内に属するＲＮＡを実験に使用した。
１－５．ｑＲＴ－ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
乳癌細胞株由来のエクソソームＲＮＡ１００ｎｇをｔｅｍｐｌａｔｅとして逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）とｃＤＮＡ増幅過程（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）をｏｎｅ－ｓｔｅｐで進めるＢｉｏｌｉｎｅ社製Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ試薬（ＳｅｎｓｉＦＡＳＴＴＭ Ｐｒｏｂｅ Ｌｏ－ＲＯＸ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ）を使用し、各遺伝子ｐｒｏｂｅは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製品であって、情報は、下記表２の通りである。
Figure 0007187081000002
実験に使用されたｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ装備は、ＡＢＩ社ＳｔｅｐＯｎｅ ｐｌｕｓ装備を使用し、すべてのサンプルは、結果の信頼度を高めるためにｄｕｐｌｉｃａｔｅで進めた。
１－６．選別および分析結果
乳癌の早期診断バイオマーカー候補として癌の生成および増殖（ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関与する遺伝子、癌の進行（ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）に関与する遺伝子、腫瘍免疫反応（ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に関与する遺伝子、および癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）と抗癌剤耐性（ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ）遺伝子の中から約１０個の候補遺伝子を選定し、癌細胞株由来のエクソソーム（ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ）を対象に予備実験を進め、ＲＮＡｓ濃度１００ｎｇを基準して、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｃｔ値が３５以上である遺伝子を除外させ、乳癌細胞株由来のエクソソームで一定レベル以上の発現を示す６個の遺伝子を選定した。
前記６個の遺伝子のうちＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子は、癌の生成および増殖に関与し、ＨＣＣＲ１遺伝子は、癌の進行に関与し、ＴＧＦ－β３は、腫瘍免疫反応に関与し、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１およびβ－ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子は、癌幹細胞と抗癌剤耐性に関与する。
前記選定された６個の遺伝子を乳癌分子サブタイプ別に細胞株２個ずつ（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ／ＢＴ４７４、ＺＲ－７５－１／ＳＫ－ＢＲ３、ＭＤＡ－ＭＢ４５３／ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＴ２０）で独立して３回以上発現レベルを分析した。この際、ＲＮＡｓ濃度を正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）するためのｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）遺伝子としては、２個の遺伝子（ｂ－ａｃｔｉｎおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ）を使用し、各遺伝子の発現が最も低い亜型の発現を１に定めて、相対的発現レベルを比較した。
分析結果、繰り返して６個のターゲット遺伝子のうち５個の遺伝子が特定分子サブタイプで有意な差異を示す結果を得ることによって、乳癌分子サブタイプ別の早期診断に非常に有用なバイオマーカーとしての機能をするものと期待される。
具体的に、図１に示されたように、癌の生成および増殖において重要な役割をするＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１遺伝子の場合、ＥＲおよびＰＲ陽性とＨＥＲ２陽性においてそれぞれ正の相関関係を示し、癌の進行に関与するＨＣＣＲ１遺伝子の場合、ＥＲおよびＰＲ陽性と正の相関関係を示した。また、癌幹細胞と抗癌剤耐性に重要な機能をするｃａｖｅｏｌｉｎ－１およびβ－ｃａｔｅｎｉｎの場合、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ分子サブタイプ（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２－）と深い相関関係を予想したが、期待とは異なってｃａｖｅｏｌｉｎ－１のみがｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ分子サブタイプで特異的に高い発現が観察され、ＴＧＦ－β３の場合は、ＨＥＲ２陽性と正の相関関係を示した。
これを総合してみると、乳癌の分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプ（ＥＲ＋／ＰＲ＋／ＨＥＲ２－）の場合、ＥＲおよびＰＲのみが陽性であるから、ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、およびＨＣＣＲ１遺伝子と正の相関関係を示し、したがって、前記３個の遺伝子がＬｕｍｉｎａｌ Ａタイプ関連遺伝子マーカーであることを確認することができた。また、乳癌の分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプ（ＥＲ＋／ＰＲ＋／ＨＥＲ２＋）の場合、ＥＲおよびＰＲは陽性であり、ＨＥＲ２も陽性であるから、ＨＥＲ２陰性である場合、ＨＣＣＲ１遺伝子は、正の相関関係が示さないので除外される代わりに、ＴＧＦ－β３の場合は、ＨＥＲ２陽性と正の相関関係を示すので、ＥＲ、ＰＲ陽性とＨＥＲ２陽性と正の相関関係にあるＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１およびＴＧＦ－β３遺伝子がＬｕｍｉｎａｌ Ｂタイプ関連遺伝子マーカーであることを確認することができた。
また、乳癌の分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅ（ＥＲ－／ＰＲ－／ＨＥＲ２＋）の場合、ＨＥＲ２のみが陽性であるから、ＨＥＲ２と正の相関関係にあるＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１およびＴＧＦ－β３遺伝子も、ＨＥＲ２ ｔｙｐｅ関連遺伝子マーカーであることを確認することができ、そして、乳癌の分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプの場合は、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２が全部陰性であるから、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１遺伝子のみが特異的に高く発現されたところ、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１遺伝子がＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅタイプの遺伝子マーカーであることを確認することができた。
最終的に、分子サブタイプ別に最も明確な差異を示す５個の遺伝子マーカーを下記表３に整理した。
Figure 0007187081000003
前記５個の遺伝子組合せは、分子サブタイプ別の乳癌の早期診断を可能にするだけでなく、高い検出感度の技術的特徴により乳癌治療後の再発有無をモニタリングするのに非常に有用に使用されるものと期待される。これに加えて、治療予後が最も悪いｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ分子サブタイプで特異的に発現する遺伝子バイオマーカーの発現レベルは、乳癌治療予後を間接的に予測できるものと期待される。
実施例２．正常人と乳癌の早期診断用多重遺伝子バイオマーカーの比較
２－１．健常者と癌患者血液サンプルの準備
本研究で使用された健常者と癌患者の血液サンプルは、冷凍（－８０℃）保管されたサンプルであって、ＳＳＴチューブに採血した血清（ｓｅｒｕｍ）を使用した。具体的に、健常者の場合、癌タンパク診断用バイオマーカーが正常範囲であるサンプルを使用し、癌患者の場合、大学病院で癌診断（確診）を受けたサンプルを使用した。エクソソーム内のＲＮＡを抽出するために必要とする血清の最小体積は、２００ｕｌであり、サンプルは、乳癌患者ｐｏｏｌｉｎｇサンプルを下記のように準備した。
Figure 0007187081000004
上記のように準備されたサンプルは、２００ｕｌずつ分注して－８０℃に保管し、すべてのサンプルが同一に１回のｆｒｅｅｚｉｎｇとｔｈａｗｉｎｇを経ることを原則とした。
２－２．エクソソーム内のＲＮＡｓ抽出
健常者と乳癌患者の血清を対象にエクソソーム内のＲＮＡを抽出するためには、（株）ジェノリューションで生産販売する自動化装備であるＮｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）ＮＸ－４８を使用し、試薬は、装備に最も適合した同じ会社製品のエクソソーム内ＲＮＡ抽出試薬を使用した。エクソソーム内ＲＮＡを抽出する原理は、実施例１－３に記載されたものと同一である。
２－３．抽出したエクソソーム内のＲＮＡ定量
血清から自動化装備で抽出したエクソソーム内ＲＮＡ濃度を定量する方法は、実施例１－４に記載されたものと同一である。
２－４．ｑＲＴ－ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
血清から抽出したｅｘｏ ＲＮＡ １００ｎｇをｔｅｍｐｌａｔｅとして実施例１－５と同じ方法でｑＲＴ－ＰＣＲを行った。
２－５．比較結果
図２に示されたように、乳癌由来のエクソソームで確保した５個のバイオマーカー遺伝子を健常者と乳癌患者ｐｏｏｌｉｎｇサンプルを対象に発現レベルを確認した結果、正常人と乳癌患者との間で有意な差異を示す。
この際、分子サブタイプ別のｐｏｏｌｉｎｇサンプルでなく、ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅに該当するｃａｖｅｏｌｉｎ－１は、正常人と乳癌患者との間で相対的に低い差異を示す。したがって、分子サブタイプ別のサンプルで再び確認してみる必要があり、乳癌分子サブタイプと関係なく、最も大きい差異を示すＡＮＴ２およびＶＤＡＣ１が、乳癌の早期診断に有用なものと判断される。
実施例３．多重遺伝子バイオマーカーを通した乳癌治療後の再発有無のモニタリングの可能性確認
この技術が乳癌再発のモニタリングに有用であるという科学的根拠となる検出敏感度を実験的に証明するために、正常血液に乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１：ＥＲ－／ＰＲ－／ＨＥＲ２－）をスパイクテストして検出可能な癌細胞数を予測してみた。
体重６０ｋｇの女性の血液が３．６Ｌであると仮定するとき、１ｃｍ３サイズの腫瘍（癌細胞数：１×１０９）が存在する場合、血液１ｍｌには、２．２２×１０６個の癌細胞が分泌するエクソソームが存在すると仮定した
Figure 0007187081000005
一般的に血液１ｍｌを遠心分離すると、約０．５ｍｌの血清を得ることができるので、１ｃｍ３サイズの腫瘍が存在する人為的な条件で健常者の血清０．２５ｍｌに乳癌細胞株１×１０５～１×１０７個が４８時間の間分泌したエクソソームをスパイクテストしたとき、遺伝子分析が可能な範囲を確認してみた。
Figure 0007187081000006
スパイクテストに使用した乳癌細胞株由来のエクソソームは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＥＲ－／ＰＲ－／ＨＥＲ２－）細胞が分泌するエクソソームであるので、分析する遺伝子は、ｃａｖｅｏｌｉｎ－１で実施した。
その結果、図３に示されたように、５×１０５個以上の乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）が４８時間の間分泌したエクソソームをスパイクテストした場合に、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲのＣｔ値が３５未満であって、遺伝子検出可能な範囲であると判断された（一般的にｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲのＣｔ値が３５以上である場合は、遺伝子発現値を信頼しない）。実際に腫瘍を有している場合、血液内エクソソームは、４８時間よりさらに長い時間の間蓄積されるので、実際に、この技術は、１ｃｍ３未満のサイズの腫瘍を有している検査者を区別できる高い検出感度の技術であって、単純に乳癌の早期診断に活用され得るだけでなく、乳癌治療後の再発有無をモニタリングするのに非常に有用なものと予測される。
以上、本発明内容の特定部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は、単に好適な実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
本発明の乳癌分子サブタイプ別の早期診断に適用可能な最小限の多重癌遺伝子バイオマーカー技術を用いる場合、４つの分子サブタイプの乳癌を早期診断することが可能であり、発現程度によって乳癌進行程度を判断することができ、高い検出感度の技術的特徴によりエクソソーム内多重遺伝子発現分析を用いて乳癌治療後の再発有無をモニタリングすることが可能である。これに加えて、現在施行される乳癌再発のモニタリングのための定期検診検査項目は、高費用だけでなく、検査者の不便さを招き、多くの時間を必要とするという短所があるが、本発明において開発される製品は、高い検出度で低費用で検査者の苦痛なしに簡単に且つ短時間に結果を得ることができるという点から非常に有用であるので、乳癌治療後に再発有無のモニタリングのための遺伝子体外診断用医療機器の開発に広く活用され得るものと期待される。

Claims (19)

  1. （ａ）正常人及び被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、及び電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記ＡＮＴ２及びＶＤＡＣ１遺伝子のｍＲＮＡレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌と判定する段階を含む、乳癌の早期診断のための情報提供方法であって、
    ここで、該乳癌は、ＥＲ陽性（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、ＰＲ陽性（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、およびＨＥＲ２陰性（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｎｅｇａｔｉｖｅ） Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ；ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性 Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ；及びＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陽性 ＨＥＲ２ ｔｙｐｅ 分子サブタイプ （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ）から選択される１種又はそれ以上である、情報提供方法。
  2. （ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、及びＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１、ベータ－カテニン、及び形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、及びＨＣＣＲ１遺伝子のｍＲＮＡレベルがカベオリン－１、ベータ－カテニン、及びＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陰性の分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ａの乳癌の早期診断のための情報提供方法。
  3. （ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン、及び形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、及びＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルがカベオリン－１、及びベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、及びＨＣＣＲ１遺伝子のｍＲＮＡレベルが、カベオリン－１、及びベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性の分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＬｕｍｉｎａｌ Ｂの乳癌の早期診断のための情報提供方法。
  4. （ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１、ベータ－カテニン、及び形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記ＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、及びＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルが、ＨＣＣＲ１、カベオリン－１、及びベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、及びベータ－カテニン遺伝子のｍＲＮＡレベルが、ＨＣＣＲ１及びカベオリン－１遺伝子のｍＲＮＡレベルと比較して増加したとき、分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅの乳癌の早期診断のための情報提供方法。
  5. 前記分子サブタイプＨＥＲ２ ｔｙｐｅは、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、及びＨＥＲ２陽性であることを特徴とする、請求項４に記載の情報提供方法。
  6. （ａ）被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからｍＲＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン、及び形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦ－β３）遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記カベオリン－１遺伝子のｍＲＮＡレベルがＡＮＴ２、ＶＤＡＣ１、ＨＣＣＲ１、ベータ－カテニン、及びＴＧＦ－β３遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅの乳癌の早期診断のための情報提供方法。
  7. 前記分子サブタイプＴｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅは、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、及びＨＥＲ２陰性であることを特徴とする、請求項６に記載の情報提供方法。
  8. 前記被検者は、乳癌患者であることを特徴とする、請求項２、３、４及び６のいずれか１項に記載の情報提供方法。
  9. 前記生物学的試料は、血液または尿であることを特徴とする、請求項１、２、３、４及び６のいずれか１項に記載の情報提供方法。
  10. 前記ＡＮＴ２及びＶＤＡＣ１遺伝子は、癌の生成及び増殖に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項１、２、３、４及び６のいずれか１項に記載の情報提供方法。
  11. 前記ＨＣＣＲ１遺伝子は、癌の進行に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項２、３、４及び６のいずれか１項に記載の情報提供方法。
  12. 前記ＴＧＦ－β３遺伝子は、腫瘍免疫反応に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項２、３、４及び６のいずれか１項に記載の情報提供方法。
  13. 前記カベオリン－１及びベータ－カテニン遺伝子は、癌幹細胞及び抗癌剤耐性に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項２、３、４及び６のいずれか１項に記載の情報提供方法。
  14. アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ-カテニン、及び形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子のそれぞれのｍＲＮＡに特異的なプライマー又はプローブを含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌の早期診断用組成物であって、
    該乳癌は、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陰性 ＬｕｍｉｎａｌＡ、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性 ＬｕｍｉｎａｌＢ、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陽性 ＨＥＲ２ｔｙｐｅ、及びＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陰性 Ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅ分子サブタイプからなる群より選択される１種またはそれ以上である、早期診断用組成物。
  15. 前記エクソソームは、血液または尿から分離したことを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
  16. アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ-カテニン、及び形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子のそれぞれのｍＲＮＡに特異的なプライマー又はプローブを含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌の早期診断用キットであって、該乳癌は、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陰性 ＬｕｍｉｎａｌＡ、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性 ＬｕｍｉｎａｌＢ、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陽性 ＨＥＲ２タイプ、及びＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陰性 Ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅ分子サブタイプからなる群より選択される１種またはそれ以上である、早期診断用キット。
  17. 前記エクソソームは、血液または尿から分離したことを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
  18. （ａ）正常人及び被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）からｍＲＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出されたｍＲＮＡを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、及び電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記ＡＮＴ２及びＶＤＡＣ１遺伝子のｍＲＮＡレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌が再発したものと判定する段階を含む、乳癌治療後の再発モニタリング方法であって、
    ここで、該乳癌は、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陰性 Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ；ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性 Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ；及びＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陽性 ＨＥＲ２ ｔｙｐｅ 分子サブタイプから選択される１種又はそれ以上である、再発モニタリング方法 。
  19. アデニンヌクレオチド転位酵素２（Ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ２；ＡＮＴ２）、電位依存性陰イオン選択性チャネル１（Ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｎｎｅｌ １；ＶＤＡＣ１）、ＨＣＣＲ１（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、カベオリン－１（ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ベータ－カテニン、及び形質転換成長因子ベータ３（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ ３；ＴＧＦ－β３）遺伝子のそれぞれのｍＲＮＡに特異的なプライマー又はプローブを含む、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いた乳癌治療後の再発モニタリングキットであって、該乳癌は、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陰性 ＬｕｍｉｎａｌＡ、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性、およびＨＥＲ２陽性 ＬｕｍｉｎａｌＢ、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陽性 ＨＥＲ２ｔｙｐｅ、及びＥＲ陰性、ＰＲ陰性、およびＨＥＲ２陰性 Ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ／ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅ分子サブタイプからなる群より選択される１種またはそれ以上である、乳癌治療後の再発モニタリングキット。
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