JP2021531832A - 液体生検多重癌遺伝子バイオマーカーを用いた乳癌の早期診断および治療後のモニタリング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1−1.分子サブタイプ別の乳癌細胞株培養
分子サブタイプ別の乳癌細胞株を下記表1のように韓国細胞株銀行から購買した後に培養した。
乳癌細胞株が分泌するエクソソームを抽出するために、エクソソームが除去されたFBS(exosome−depleted FBS)が含まれた細胞培養液を使用した。培養液を交替する前に、PBS(Phosphate Buffered Saline,pH7.4)で2回洗浄(washing)し、培養液を交替した後、48時間の間5% CO2、37℃条件の細胞培養器で培養することによって、エクソソーム濃縮を誘導し、amicon Ultra−15 centrifugal filter(ultracel−3K)を用いて培養液の体積を1/10に濃縮した後、SBI Exoquick TC試薬を用いてエクソソームを得た。
(株)ジェノリューションで生産販売するエクソソーム内RNA抽出試薬を使用してエクソソーム内RNAを抽出した。この際、エクソソーム内RNAを抽出する原理は、培養液内のエクソソームを分解(lysis)させ、エクソソームから流れ出たタンパク質、DNA、およびRNA(mRNA、miRNA、rRNA等)の中からRNAのみを分離し、この際、タンパク質とDNAが汚染されないように最適化して純度を高め、RNAs抽出濃度(RNA prep yield)を最大化できる抽出過程(protocol)を構築した。
乳癌細胞株培養液から抽出したエクソソーム内RNA濃度を定量するために、nano−drop(波長260nmで吸光度)を使用して濃度測定をし、260/280ratioと260/230ratioを通じてRNA純度および汚染度を確認して、正常範囲内に属するRNAを実験に使用した。
乳癌細胞株由来のエクソソームRNA100ngをtemplateとして逆転写反応(reverse transcription)とcDNA増幅過程(polymerase chain reaction)をone−stepで進めるBioline社製One−step qRT−PCR試薬(SensiFASTTM Probe Lo−ROX One−Step Kit)を使用し、各遺伝子probeは、IDT(Integrated DNA Technologies)社製品であって、情報は、下記表2の通りである。
乳癌の早期診断バイオマーカー候補として癌の生成および増殖(tumor initiation and proliferation)に関与する遺伝子、癌の進行(tumor progression)に関与する遺伝子、腫瘍免疫反応(tumor immune response)に関与する遺伝子、および癌幹細胞(cancer stem cells)と抗癌剤耐性(chemoresistant)遺伝子の中から約10個の候補遺伝子を選定し、癌細胞株由来のエクソソーム(cancer cell line−derived exosomes)を対象に予備実験を進め、RNAs濃度100ngを基準して、real−time qRT−PCR Ct値が35以上である遺伝子を除外させ、乳癌細胞株由来のエクソソームで一定レベル以上の発現を示す6個の遺伝子を選定した。
2−1.健常者と癌患者血液サンプルの準備
本研究で使用された健常者と癌患者の血液サンプルは、冷凍(−80℃)保管されたサンプルであって、SSTチューブに採血した血清(serum)を使用した。具体的に、健常者の場合、癌タンパク診断用バイオマーカーが正常範囲であるサンプルを使用し、癌患者の場合、大学病院で癌診断(確診)を受けたサンプルを使用した。エクソソーム内のRNAを抽出するために必要とする血清の最小体積は、200ulであり、サンプルは、乳癌患者poolingサンプルを下記のように準備した。
健常者と乳癌患者の血清を対象にエクソソーム内のRNAを抽出するためには、(株)ジェノリューションで生産販売する自動化装備であるNextractor(登録商標)NX−48を使用し、試薬は、装備に最も適合した同じ会社製品のエクソソーム内RNA抽出試薬を使用した。エクソソーム内RNAを抽出する原理は、実施例1−3に記載されたものと同一である。
血清から自動化装備で抽出したエクソソーム内RNA濃度を定量する方法は、実施例1−4に記載されたものと同一である。
血清から抽出したexo RNA 100ngをtemplateとして実施例1−5と同じ方法でqRT−PCRを行った。
図2に示されたように、乳癌由来のエクソソームで確保した5個のバイオマーカー遺伝子を健常者と乳癌患者poolingサンプルを対象に発現レベルを確認した結果、正常人と乳癌患者との間で有意な差異を示す。
この技術が乳癌再発のモニタリングに有用であるという科学的根拠となる検出敏感度を実験的に証明するために、正常血液に乳癌細胞株(MDA−MB−231:ER−/PR−/HER2−)をスパイクテストして検出可能な癌細胞数を予測してみた。
Claims (29)
- (a)正常人および被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム(exosome)からmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(Adenine nucleotide translocase 2;ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(Voltage−dependent anion−selective channel 1;VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン(β−catenin)、および形質転換成長因子ベータ3(transforming growth factor−beta 3;TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2およびVDAC1遺伝子のmRNAレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌と判定する段階を含む、乳癌の早期診断のための情報提供方法。 - 前記乳癌は、Luminal A、Luminal B、HER2 type、およびTriple negative/basal−likeよりなる分子サブタイプ(molecular subtype)群から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の情報提供方法。
- (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2、VDAC1、およびHCCR1遺伝子のmRNAレベルがカベオリン−1、ベータ−カテニン、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプLuminal Aタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプLuminal Aタイプの乳癌の早期診断のための情報提供方法。 - 前記分子サブタイプLuminal Aタイプは、ER陽性(Estrogen Receptor−positive)、PR陽性(Progesterone Receptor−positive)、およびHER2陰性(Human Epidermal growth factor Receptor 2−negative)であることを特徴とする、請求項3に記載の情報提供方法。
- (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2、VDAC1、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルがHCCR1、カベオリン−1、およびベータ−カテニン遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプLuminal Bタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプLuminal Bタイプの乳癌の早期診断のための情報提供方法。 - 前記分子サブタイプLuminal Bタイプは、ER陽性、PR陽性、およびHER2陽性であることを特徴とする、請求項5に記載の情報提供方法。
- (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2、VDAC1、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルがHCCR1、カベオリン−1、およびベータ−カテニン遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプHER2 typeの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプHER2 typeの乳癌の早期診断のための情報提供方法。 - 前記分子サブタイプHER2 typeは、ER陰性、PR陰性、およびHER2陽性であることを特徴とする、請求項7に記載の情報提供方法。
- (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記カベオリン−1遺伝子のmRNAレベルがANT2、VDAC1、HCCR1、ベータ−カテニン、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプTriple negative/basal−likeタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプTriple negative/basal−likeタイプの乳癌の早期診断のための情報提供方法。 - 前記分子サブタイプTriple negative/basal−likeタイプは、ER陰性、PR陰性、およびHER2陰性であることを特徴とする、請求項9に記載の情報提供方法。
- 前記被検者は、乳癌患者であることを特徴とする、請求項3、5、7および9のいずれか1項に記載の情報提供方法。
- 前記生物学的試料は、血液または尿であることを特徴とする、請求項1、3、5、7および9のいずれか1項に記載の情報提供方法。
- 前記ANT2およびVDAC1遺伝子は、癌の生成および増殖に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項1、3、5、7および9のいずれか1項に記載の情報提供方法。
- 前記HCCR1遺伝子は、癌の進行に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項1、3、5、7および9のいずれか1項に記載の情報提供方法。
- 前記TGF−β3遺伝子は、腫瘍免疫反応に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項1、3、5、7および9のいずれか1項に記載の情報提供方法。
- 前記カベオリン−1およびベータ−カテニン遺伝子は、癌幹細胞および抗癌剤耐性に関与する遺伝子であることを特徴とする、請求項1、3、5、7および9のいずれか1項に記載の情報提供方法。
- アデニンヌクレオチド転位酵素2(Adenine nucleotide translocase 2;ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(Voltage−dependent anion−selective channel 1;VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン(β−catenin)、および形質転換成長因子ベータ3(transforming growth factor−beta 3;TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する物質を含む、エクソソーム(exosome)を用いた乳癌の早期診断用組成物。
- 前記エクソソームは、血液または尿から分離したことを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
- 前記mRNAレベルを測定する物質は、mRNAを増幅させることができるプライマーまたはプローブであることを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
- アデニンヌクレオチド転位酵素2(Adenine nucleotide translocase 2;ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(Voltage−dependent anion−selective channel 1;VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン(β−catenin)、および形質転換成長因子ベータ3(transforming growth factor−beta 3;TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する物質を含む、エクソソーム(exosome)を用いた乳癌の早期診断用キット。
- 前記エクソソームは、血液または尿から分離したことを特徴とする、請求項20に記載のキット。
- 前記mRNAレベルを測定する物質は、mRNAを増幅させることができるプライマーまたはプローブであることを特徴とする、請求項20に記載のキット。
- (a)正常人および被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム(exosome)からmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(Adenine nucleotide translocase 2;ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(Voltage−dependent anion−selective channel 1;VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン(β−catenin)、および形質転換成長因子ベータ3(transforming growth factor−beta 3;TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2およびVDAC1遺伝子のmRNAレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌が再発したものと判定する段階を含む、乳癌治療後の再発モニタリング方法。 - アデニンヌクレオチド転位酵素2(Adenine nucleotide translocase 2;ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(Voltage−dependent anion−selective channel 1;VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン(β−catenin)、および形質転換成長因子ベータ3(transforming growth factor−beta 3;TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する物質を含む、エクソソーム(exosome)を用いた乳癌治療後の再発モニタリングキット。
- (a)正常人および被検者の生物学的試料から分離したエクソソーム(exosome)からmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(Adenine nucleotide translocase 2;ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(Voltage−dependent anion−selective channel 1;VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン(β−catenin)、および形質転換成長因子ベータ3(transforming growth factor−beta 3;TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2およびVDAC1遺伝子のmRNAレベルが正常人に比べて増加したとき、乳癌と判定する段階を含む、乳癌の早期診断方法。 - (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2、VDAC1、およびHCCR1遺伝子のmRNAレベルがカベオリン−1、ベータ−カテニン、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプLuminal Aタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプLuminal Aタイプの乳癌の早期診断方法。 - (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2、VDAC1、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルがHCCR1、カベオリン−1、およびベータ−カテニン遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプLuminal Bタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプLuminal Bタイプの乳癌の早期診断方法。 - (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記ANT2、VDAC1、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルがHCCR1、カベオリン−1、およびベータ−カテニン遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプHER2 typeの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプHER2 typeの乳癌の早期診断方法。 - (a)被検者の生物学的試料から分離したエクソソームからmRNAを抽出する段階;
(b)前記抽出されたmRNAを鋳型としてアデニンヌクレオチド転位酵素2(ANT2)、電位依存性陰イオン選択性チャネル1(VDAC1)、HCCR1(Human Cervical cancer oncogene)、カベオリン−1(caveolin−1)、ベータ−カテニン、および形質転換成長因子ベータ3(TGF−β3)遺伝子よりなる群から選ばれた1つ以上のmRNAレベルを測定する段階;および
(c)前記カベオリン−1遺伝子のmRNAレベルがANT2、VDAC1、HCCR1、ベータ−カテニン、およびTGF−β3遺伝子のmRNAレベルに比べて増加したとき、分子サブタイプTriple negative/basal−likeタイプの乳癌と判定する段階を含む、分子サブタイプTriple negative/basal−likeタイプの乳癌の早期診断方法。
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PASQUALE SANSONE ET AL.: "Packaging and transfer of mitochondrial DNA via exosomes regulate escape from dormancy in hormonal t", PNAS, 2017, PP.E9066-E9075, JPN6022006608, ISSN: 0004711797 * |
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