CN106939354A - miRNA‑4530作为肺癌诊断标志物的应用 - Google Patents

miRNA‑4530作为肺癌诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miRNA‑4530作为肺癌诊断标志物的应用。本发明提供了检测待测样本外泌体中miRNA‑4530表达量的物质在制备诊断或辅助诊断所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。本发明还提供了检测待测样本外泌体中miRNA‑4530表达量的物质在制备筛查或辅助筛查所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。本发明的实验证明了，通过在肺癌细胞系A549致癌小鼠血液外泌体的验证，确定了miRNA‑4530有望成为临床肺癌诊断的生物标志物。

Description

miRNA-4530作为肺癌诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种miRNA-4530作为肺癌诊断标志物的应用。
背景技术
通过基因芯片、高通量测序法和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)等方法发现血液循环中的miRNA对NSCLC的诊断有较高价值。其中Roth等发现血液中的miR-361-3p和miR-625有助于从良性肺部病变中识别恶性肺癌。而血液中miR-21的上调是诊断肺鳞状细胞癌的可靠生物学标志，肺腺癌患者血液中miR-200b-5p、miR-502-5p、miR-629、miR-17和miR-100较肺部肉芽肿患者和健康吸烟者明显增高。此外，Rodriguez等发现肺部肿瘤患者血液中外泌体含有的miR-122-5p等miRNA含量明显高于支气管肺泡灌洗液。Munagala等发现肺癌外泌体中miR-21和miR-155升高对于肺癌复发诊断是潜在的生物学标志。
微小RNA(microRNA，miRNA)作为一种在某些肿瘤中异常表达的非编码的小RNA，可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。然而，由于依靠组织活检来取得肿瘤组织再分析其miRNA的方法具有创伤性，因此限制了其进一步的应用。外泌体(exosomes)是一种直径在50-90nm的亚细胞双层膜颗粒，其中含有miRNA，且肿瘤在生长过程中还会不断地将外泌体释放到周围环境中去，因此检测体液外泌体及外泌体RNA有助于肿瘤诊断和预后判断。Taylor等首先提出通过检测血液外泌体miRNA来诊断卵巢癌，并进一步用于判断预后。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质的用途。
本发明提供了检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备诊断或辅助诊断所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。
本发明还提供了检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备筛查或辅助筛查所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。
所述表达量为相对表达量，为相对于内参基因的表达量，内参基因为has-5.8s。
上述应用中，所述待测样本为离体血清。
上述应用中，所述检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质包括用于扩增miRNA-4530的引物对。
若miRNA-4530在待测样本外泌体中的表达显著高于在非肺癌样本中的表达，则待测样本为或候选为肺癌样本，反之，则不为或候选不为。
本发明还提供了检测待测人血清外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备诊断或辅助诊断所述待测人是否肺癌患者的产品中的应用。
本发明还提供了检测待测人血清外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备筛查或辅助筛查所述待测人是否肺癌患者的产品中的应用。
上述应用中，所述检测待测人血清外泌体中miRNA-4530表达量的物质包括用于扩增miRNA-4530的引物对。
上述应用中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
所述血清为离体血清。
本发明的另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，为上述检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质或所述检测待测人血清外泌体中miRNA-4530表达量的物质。
上述产品为如下1)-4)中任意一种：
1)诊断或辅助诊断所述待测样本是否肺癌样本的产品；
2)筛查或辅助筛查所述待测样本是否肺癌样本的产品；
3)诊断或辅助诊断所述待测人是否肺癌患者的产品；
4)筛查或辅助筛查所述待测人是否肺癌患者的产品。
miRNA-4530作为肺癌诊断标记物中的应用也是本发明保护的范围。
本发明为了建立利用外泌体进行肺癌诊断和预后判断生物标志物的方法，采用永生化的人支气管上皮细胞BEP2D及α粒子辐射诱发该细胞发生癌变的细胞系BERP35T44-1，分离外泌体，并利用miRNA芯片技术获得了在癌变细胞系BERP35T44-1细胞外泌体中表达明显增高的miRNA，在31例临床肺癌病人的血清中进行了检测，与正常人群相比，miRNA-4530表达均显著增高。miRNA-4530为临床肺癌诊断奠定基础，可用于制备诊断试剂盒。
附图说明
图1为hsa-5.8s基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图。
图2为miR-4530基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图。
图3为miRNA-4530在人肺癌血清中高表达。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与肺癌细胞相关的miRNA的发现
永生化的人支气管上皮细胞BEP2D记载在如下文献中：楼铁柱、项晓琼、吴德昌.238Puα粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究.中国肺癌杂志，2000，3(6)：428-431.2；
肿瘤细胞BERP35T44-1具有较高的血清抗性，较强的锚着独立生长能力，较快的增殖速度，且具有一定的迁移能力，记载在如下文献中：α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化成瘤细胞的生物学特性研究；胡迎春；军事医学科学院，2003年中国人民解放军军事医学科学院的硕士论文。
1.细胞培养：BEP2D细胞和BERP35T44-1细胞培养于LHC-8无血清培养基中，置37C、5％CO培养箱中传代培养。
2.外泌体的提取：收取107生长状态良好的BEP2D及BERP35T44-1细胞培养上清，采用多步差速离心法分离外泌体：4℃，300g离心10分钟去除细胞；4℃，2000g离心20分钟和4℃，10000g离心30分钟去除细胞碎片；最后，4℃，100000g超速离心60分钟所获得的沉淀即为外泌体。
3.外泌体的电镜分析：向外泌体沉淀中加入1ml PBS，吹打溶解后取20μl滴加于载样铜网上，室温静置1分钟，用滤纸从侧面吸干液体，再滴加2％磷钨酸溶液(PH6.8)30μl于铜网上，室温负染1分钟。滤纸吸干负染液，白炽灯下烤2分钟，透射电镜下观察照相。
4.外泌体RNA的提取：向外泌体沉淀中加入500μl Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，得到BEP2D细胞外泌体RNA和BERP35T44-1细胞外泌体RNA。
用超微量分光光度计测定总RNA浓度。以A260nm/A280nm比值评估纯度。为了确定提取出的总RNA中有miRNA存在，选用RNU6B为内参，利用实时荧光定量PCR的方法对总RNA中的miRNA进行检测。
5.miRNA芯片实验：BEP2D、BERP35T44-1两种细胞的外泌体，共2个总RNA样品进行miRNA芯片实验。miRNA芯片实验由LC Sciences公司采用人的LC Sciences microRNAMicroarray-Single基因表达谱芯片完成。
用人的LC Sciences microRNA Microarray-Single基因表达谱芯片(由杭州联川生物信息技术有限公司提供)检测BEP2D细胞外泌体RNA和BERP35T44-1细胞外泌体RNA，经检测后发现RNA质量完好，进行标记杂交试验。杂交芯片经扫描仪扫描，数据信号提取，LOWESS过滤进行归一化处理以及差异表达分析等。得到人支气管上皮细胞BEP2D外泌体基因表达谱和肿瘤细胞BERP35T44-1外泌体基因表达谱。
比较两个基因表达谱，结果与人支气管上皮细胞BEP2D基因表达谱相比，肿瘤细胞BERP35T44-1基因表达谱表达上调的miRNA有140个，表达下调的miRNA有169个。数据显示，miRNA-4530上调倍数为18.36倍。
实施例2、miRNA-4530的表达量在诊断肺癌患者中的应用
一、提取RNA
肺癌患者血清来源：肺癌患者血清全部由解放军总医院提供，均为首诊肺癌，患者尚未接受过任何包括手术及放化疗等治疗。诊断明确，病理清楚。
正常对照血清来源：正常对照血清全部由解放军总医院体检中心提供，均为健康人群常规查体获得。
分别提取肺癌患者血清外泌体RNA和正常对照血清外泌体的RNA。
1、样本信息如下表1：
表1
二、引物设计与验证
使用DNAMAN设计颈环反转录引物和qPCR上游引物，下游引物使用通用引物，目的片段长度约60bp左右，退火温度60℃(序列见表2)。引物验证使用与定量PCR相同的条件，以cDNA混合样品为模板，结果熔解曲线均为单一峰，琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，PCR扩增特异性较好。定量结果见图1、图2。
表2 miR-4530序列及qPCR引物序列
三、RT-PCR法(逆转录合成cDNA)
将提取好的RNA从-80℃冰箱中取出，放在冰上溶解，使用FastQuant RT Kit(withgDNAase)(TIANGEN)合成第一链cDNA。
再分别以cDNA为模板，用上游引物和下游引物进行相对定量PCR。
相对定量PCR体系如表3：
表3
相对定量PCR反应使用Roche96荧光定量PCR仪进行定量PCR：
表4
实验组相对对照组(has-5.8s)样本中目的基因的表达量以2-ΔΔCt法计算，结果见表5。
表5.各样本中目的基因的表达量(相对于has-5.8s的相对表达量)
用Gram Pad软件表5的数据进行统计学处理，结果如图3所示。
用Sas软件对表5的数据进行统计学处理，结果如下表6-7所示：
表6为31例肺癌病人组miRNA-4530结果
表7为5例正常对照组miRNA-4530结果
不满足正态性，本例采用成组设计定量资料的秩和检验：Z＝-3.4307，P＝0.0006，两组差别有统计学意义。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
<120> miRNA-4530作为肺癌诊断标志物的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gcagcaggac gagagtgaaa 20
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (10)

1.检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备诊断或辅助诊断所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。
2.检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备筛查或辅助筛查所述待测样本是否肺癌样本的产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质包括用于扩增miRNA-4530的引物对。
4.检测待测人血清外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备诊断或辅助诊断所述待测人是否肺癌患者的产品中的应用。
5.检测待测人血清外泌体中miRNA-4530表达量的物质在制备筛查或辅助筛查所述待测人是否肺癌患者的产品中的应用。
6.根据权利要求4或5的应用，其特征在于：
所述检测待测人血清外泌体中miRNA-4530表达量的物质包括用于扩增miRNA-4530的引物对。
7.根据权利要求3或6所述的应用，其特征在于：
所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。
8.一种产品，为权利要求1-7中任一的应用中的所述检测待测样本外泌体中miRNA-4530表达量的物质或所述检测待测人中miRNA-4530表达量的物质。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述产品为如下1)-4)中任意一种：
1)诊断或辅助诊断所述待测样本是否肺癌样本的产品；
2)筛查或辅助筛查所述待测样本是否肺癌样本的产品；
3)诊断或辅助诊断所述待测人是否肺癌患者的产品；
4)筛查或辅助筛查所述待测人是否肺癌患者的产品。
10.miRNA-4530作为肺癌诊断标记物中的应用。
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