CN109112216A - 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法 - Google Patents
三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法。所述试剂盒包含三组引物和探针的组合,其中两组引物和探针的组合是以选自人类SEPT9基因序列范围内的两个区域为靶点设计的引物和探针的组合,另一组引物和探针的组合是以内部参照基因为靶点设计的引物和探针的组合。所述试剂盒能够更敏感和准确地确定特定区域DNA甲基化水平或状态。
Description
技术领域
本公开属于医药生物领域,具体而言,主要涉及DNA甲基化检测试剂盒和方法,特别是人的液体活组织检查中与大肠癌相关的目标基因Septin9(SEPT9)的DNA甲基化检测方法以及用于检测目标基因SEPT9的DNA甲基化的试剂盒。
背景技术
大肠癌(CRC)是全世界第三大常见癌症,每年有600,000人死亡。对于CRC,早期识别和早期干预是降低死亡率的最佳方法。目前的筛查方法是结肠镜检查和大便隐血和免疫组织化学检测(gFOBT/FIT)。由于结肠镜检查的不适以及对肠道制品的厌恶,这些筛查方法并未充分使用。因此,使用可靠的非侵入性血液基础检测来评估CRC风险对于早期发现CRC可能是有价值的。
DNA甲基化改变是癌症中最早的分子变化之一。肿瘤抑制基因的高甲基化已被确定为抑制基因表达并促进癌细胞生长和扩张的机制。
在CRC中,SEPT9,SFRP2,TFPI2,NDRG4,BMP3和其它基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接续鸟苷(G))的超甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此,一个或多个这些基因的甲基化状态分析,可用于辅助诊断大肠癌的状态。
目前用于诊断及检测结果的困难度来自于组织活检的侵入性。液体活检可解决这个问题,其中用于分析的生物样本,可从血液,尿液,唾液,痰液或组织样本等获得。
传统的诊断癌症方法相比,液体活检有一些主要的优势:
1.易取得,液体活检也可从尿液,唾液和胸腔积液获得;
2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性;
3.能取样所有可能的癌细胞,而不非仅局限于肿瘤活检的某部分;
4.允许早期发现癌症;
5.能用于监测肿瘤动态(治疗前,治疗间和治疗后);
6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。
人类生物样本包含,源自所有组织(包括癌症组织)的细胞、蛋白质、外来体和游离DNA(cfDNA)、游离RNA(cfRNA)。游离DNA的浓度非常低,在血浆约至1-10ng/mL。肿瘤突变DNA可以在来自癌症患者的生物样本的cfDNA中检测到,被称为循环肿瘤DNA(circulatingtumor DNA,即ctDNA)。这些ctDNA为大约134-144bp的DNA片段,而其浓度更可小于cfDNA。
临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和疗法选择的主要挑战,仍在于开发灵敏的检测方法在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号,特别是对于ctDNA浓度可能至pg/mL程度的早期诊断。此外,目前可用的检测试剂盒受到DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差或用于检测甲基化DNA的设计不佳的定量PCR方法的限制。
Epigenomics AG(德国柏林,以下称为“Epigenomics”)已经发布了由FDA、cFDA和European Medicines Agency(EMA)批准的检测细胞游离DNA中的Septin 9(SEPT9)甲基化的试剂盒。该试剂盒用于从患者血浆中提取游离DNA、处理游离DNA以及使用定量PCR(qPCR)检测测定特定SEPT9区域的甲基化水平。Epigenomics描述的方法可以从3.5mL样本中分离出其中含量大约为9ng/mL的cfDNA,其测定可以检测到其中大约14pg/mL的甲基化SEPT9DNA。对于每名患者该检测需要超过30ng的cfDNA。然而考虑到每次从癌症患者血样中分离出来的总cfDNA约为40ng,这是一个很大的数量。此外,Epigenomics的方法是一个二重qPCR检测,它只测量一个SEPT9甲基化区域和一个内部参照基因ACTB的甲基化状态。该试剂盒所使用的引物可以结合SEPT9的非甲基化区域,并分别利用探针识别甲基化DNA和阻断剂识别未甲基化DNA。该检测方法需要较大量的cfDNA进行SEPT9甲基化状态检测,同时不够严谨的qPCR检测会产生较大量假阳性结果,这些因素可能会导致误诊。
因此,迫切需要更敏感和准确地检测DNA甲基化水平或状态的方法,以帮助CRC诊断测定。
发明内容
本公开的工作流程开始于对现有检测生物样本中目标基因的DNA甲基化的方法的一个或多个步骤的改进,包括:样品游离DNA亚硫酸氢盐处理和甲基化特异性qPCR(图1)。
一方面,本公开提供了一种试剂盒,其包含三组引物和探针的组合,其中两组引物和探针的组合是以选自下列人类基因序列范围内的两个区域为靶点设计的引物和探针的组合,另一组引物和探针的组合是以内部参照基因为靶点设计的引物和探针的组合:
另一方面,本公开提供了一种检测生物样本中SEPT9基因特定区域的DNA甲基化的方法,包括以下步骤:
(1)对从生物样本得到的DNA进行亚硫酸氢盐处理;
(2)用三组引物和探针的组合对经步骤(1)处理过的DNA进行甲基化特异性qPCR(MS-qPCR),其中两组引物和探针的组合以选自下列人类基因序列范围内的两个区域为靶点设计,另一组引物和探针的组合的靶点为内部参照基因:
(3)根据步骤(2)中的甲基化特异性qPCR的结果确定该SEPT9基因特定区域的DNA甲基化水平或状态。
附图说明
图1显示根据本公开一个实施方式的DNA甲基化qPCR分析的工作流程。
图2A显示位于chr17:77,373,402的CpG甲基化位点在大肠癌病人正常组织与肿瘤组织间的甲基化状态比较(Illumina甲基化芯片检测结果)。其中每个细线两端分别为正常组织与肿瘤组织的甲基化水平。
图2B显示使用UCSC基因组浏览器(UCSC genome browser)预测的位于SEPT9基因区域的CpG岛(本文称之为CpG3)。CpG3位于染色体17:77,372,607-77,374,424。其中特定的235bp区域(染色体17:77,373,340-77,373,574)的甲基化状态显示了与大肠癌的相关性。CpG以灰色突出显示,SEPT9转录本的ATG起始密码子以粗体显示。SEPT9_1和SEPT9_2引物和探针结合的特定区域用下划线标出并用箭头标出。*标记处的C为Illumina甲基化芯片检测出的与大肠癌高度相关的甲基化位点。
图3显示根据本公开的一个实施方式的SEPT9基因甲基化三重检测方法(Curaclound qPCR)与epiProcolon v2.0高灵敏PCR试剂盒比较的结果。其中符号“?”是由于检测图中有较多杂带以至于主带不太确定造成的。
具体实施方式
在下文中将更加详细地描述本公开,但是以下具体实施方式本质上仅是例示性,且并不欲限制本公开及其用途。此外,本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。
为使本领域具有普通知识的人员可了解本公开的特点及效果,以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明,否则文中使用的所有技术及科学上的字词,皆具有本领域技术人员对于本公开所了解的通常意义,当有冲突情形时,应以本说明书的定义为准。
I.定义
如本文所用,术语“患者”、“个体”或“受试者”可以在本文中可互换使用,并且可以指哺乳动物,特别是人类。所述受试者可能有轻度、中度或重度疾病。所述患者可能是未治(treatment ),易治或难治。所述患者可能是基于特定症状或家族病史需要治疗或需要诊断的个体。
如本文所用,术语“样本”、“患者样本”、“生物样本”等包括从患者、个体或受试者获得的各种样本类型,并且可用于诊断或监测检测。所述患者样本可以从健康受试者、患病患者或患有CRC相关症状的患者获得。而且,从患者获得的样本可以被分割,并且只有一部分可以用于诊断。此外,所述样本或其一部分可以在保持样本用于以后分析的条件下储存。该定义具体包括血液和其他生物来源的液体样本(包括但不限于外周血、血清、血浆、尿、唾液、痰、粪便和滑液),固体组织样本(如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代)。该定义还包括在获取后以任何方式操作的样本,如通过离心、过滤、沉淀、透析、色谱法、试剂处理、洗涤或富集某些细胞群。这些术语还包括临床样本、培养细胞、细胞上清液、组织样本、器官等。所述样本还可以包含新鲜冷冻和/或福尔马林固定的石蜡包埋组织块,例如由临床或病理活组织检查制备的块,其被制备用于病理分析或通过免疫组织化学研究。
如本文所用,术语“测量”、“确定”、“检测”或“检查”在全文中可互换使用,并且可以指包括获得患者样本和/或检测患者样本中的生物标志物甲基化状态或水平的方法。在一个实施方式中,这些术语是指获得患者样本并检测样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。在另一个实施方式中,术语“测量”、“确定”或“检测”是指检测患者样本中一种或多种生物标志物的甲基化状态或水平。测量可以通过本领域已知的方法和本文进一步描述的方法完成,包括但不限于,甲基化特异性定量聚合酶链式反应(qPCR)。此外,术语“测量”在全文中可以与术语“检测”互换使用。
如本文所用,术语“甲基化”是指在胞嘧啶的C5或N4位置、腺嘌呤的N6位置的胞嘧啶甲基化或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA是未甲基化的,因为体外DNA扩增方法不保留扩增模板的甲基化模式。然而,“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以分别指其原始模板是未甲基化或甲基化的扩增DNA。
如本文所用,术语“CpG岛”是指具有高密度CpG的基因组DNA的连续区域。
如本文所用,术语“甲基化状态”或“甲基化水平”是指特定核苷酸或部分DNA中的核苷酸处的甲基化的存在、不存在和/或量。
如本文所用,术语“超甲基化”是指对应于在测试DNA样本的DNA序列中的一个或多个CpG二核苷酸处的5-mCyt相对于在正常对照DNA样本中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的存在增加的甲基化状态。如本文所用,“超甲基化”或“甲基化水平升高”是指与对照样本相比,该DNA区域存在统计学显着(例如,本公开的生物标志物)的甲基化程度增加。或者,“高甲基化”或“甲基化水平升高”可能指随着时间的推移患者体内水平增加。
如本文所用,术语“低甲基化水平”是指对应于在测试DNA样本的DNA序列中的一个或多个CpG二核苷酸处的5-mCyt相对于在正常对照DNA样本中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的存在减少的甲基化状态。
应该理解的是,无论在何处使用语言“包括”描述实施例,还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的其他类似实施例。
如本文短语(诸如“A和/或B”)中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”,“A或B”,“A”和“B”。同样地,在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在包含以下每个实施例:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);和C(单独)。
II.试剂盒
本公开提供了一种试剂盒,其用于检测或测量本文所述的生物标志物的甲基化状态或水平。
本公开的试剂盒包含三组引物和探针的组合,其中两组引物和探针的组合是以选自下列人类基因序列范围内的两个区域为靶点设计的引物和探针的组合,另一组引物和探针的组合是以内部参照基因为靶点设计的引物和探针的组合:
本公开的试剂盒可以用于进行甲基化特异性qPCR来确定生物样本DNA特定区域位点甲基化水平或状态。
本公开的试剂盒中,SEPT9基因序列范围内的所述两个区域可以是为进行甲基化特异性qPCR来确定甲基化水平或状态而选择的甲基化区域。
本公开的试剂盒中,优选地,所述两组引物和探针的组合是以SEQ ID NO:1中两个区域为靶点设计的两组引物和探针的组合。
SEQ ID NO:1的序列如下:
CATTCAGCTGAGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTG。
本公开的试剂盒中,优选地,所述两组引物和探针的组合中,一组引物和探针的组合是以SEQ ID NO:2为靶点设计的引物和探针的组合,以及另一组引物和探针的组合是以SEQ ID NO:3为靶点设计的引物和探针的组合。
SEQ ID NO:2的序列如下:
TCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTT。
SEQ ID NO:3的序列如下:
GCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAG。
本公开的试剂盒中,优选地,所述内部参照基因为β肌动蛋白基因(ACTB)。
本公开的试剂盒中,优选地,其包括下列引物和探针的组合:
本公开的试剂盒中,优选地,所述引物为经修饰的引物。更优选地,所述引物在其末端被修饰。还更优选地,所述引物的3'末端的两个核苷酸通过硫代核苷酸化进行修饰。
本公开的试剂盒中,优选地,所述探针在5'末端含有TaqMan荧光团,并在3'末端附着荧光猝灭剂。
本公开的试剂盒可进一步包括:
(1)用于在其中接收样本的容器(例如小瓶,试管等),和
(2)一个或多个附加容器,其含有用于检测基因甲基化的一个或多个多核苷酸引物和探针。
所述试剂盒可进一步包含任选连接至多核苷酸(例如探针)的可检测标记。
此外,本公开的试剂盒可以进一步包括用于检测甲基化的试剂,其包括例如亚硫酸氢钠和设计成与本公开内容的生物标志物序列产物的序列杂交的多核苷酸。鉴于本文提供的本公开方法的描述,本领域技术人员可以容易地确定容器中必需试剂的分配。
用于进行测定的其他材料也可以包含在本公开的试剂盒中,包括试管,移液管等。
本公开的试剂盒还可以包括在本文描述的任何测定中使用一种或多种这些试剂的书面说明。
III.检测生物样本中SEPT9基因特定区域的DNA甲基化的方法
另一方面,本公开提供了一种检测生物样本中SEPT9基因特定区域的DNA甲基化的方法,包括以下步骤:
(1)对从生物样本得到的DNA进行亚硫酸氢盐处理;
(2)用三组引物和探针的组合对经步骤(1)处理过的DNA进行甲基化特异性qPCR(MS-qPCR),其中,两组引物和探针的组合以选自下列人类基因序列范围内的两个区域为靶点设计,另一组引物和探针的组合的靶点为内部参照基因:
(3)根据步骤(2)中的甲基化特异性qPCR的结果确定该SEPT9基因特定区域的DNA甲基化水平或状态。
本公开的方法中,优选地,所述两组引物和探针的组合以SEQ ID NO:1中两个区域为靶点设计。
本公开中,一组引物和探针的组合是指针对一个特定靶点设计的引物和探针的组合,其中,所述引物用于扩增包括该靶点的目的片段,所述探针用于识别该靶点。例如,上述以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3为靶点设计的两组引物和探针的组合意指如下两组引物和探针的组合:其中一组引物和探针的组合是针对SEQ ID NO:2设计的引物和探针的组合,而另一组引物和探针的组合是针对SEQ ID NO:3设计的引物和探针的组合。
本公开的方法中,优选地,所述两组引物和探针的组合中的一组引物和探针的组合以SEQ ID NO:2为靶点设计,以及所述两组引物和探针的组合中的另一组引物和探针的组合以SEQ ID NO:3为靶点设计。
图2B显示了上述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列。
本公开的方法中,优选地,步骤(2)中,使用下列引物和探针的组合:
本公开的方法中,优选地,所述内部参照基因为β肌动蛋白基因(ACTB)。
本公开的方法中,优选地,步骤(1)中所述生物样本是人的液体活组织检查样本。上述收集生物样本和进行DNA提取的步骤可以使用本领域普通技术人员熟知的任何技术手段来实现。
本公开的方法中,优选地,步骤(1)中,所述从生物样本得到的DNA是游离DNA(cfDNA)。
本公开的方法中,优选地,步骤(1)中,所述从生物样本得到的DNA是使用柱式Qiagen QIAamp体液游离核酸提取试剂盒(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)进行DNA提取得到的。本公开已经证明可从10mL人血样品中获得约40ng游离DNA。
本公开的方法中,优选地,步骤(1)中,使用ZymoReserach公司EZ DNAMethylation-Lightning试剂盒进行亚硫酸氢盐处理以将DNA转化以用于MS-qPCR。
本公开的方法中,优选地,步骤(2)中所述DNA进行甲基化特异性qPCR在一个反应体系(例如,一个反应管)中完成。
本公开的方法中,优选地,步骤(2)中所述引物为经修饰的引物。更优选地,所述引物在其末端被修饰。还更优选地,所述引物的3'末端的两个核苷酸通过硫代核苷酸化进行修饰。
上述步骤(2)中,甲基化特异性qPCR中使用的探针可以在5'末端含有TaqMan荧光团,并在3'末端附着荧光猝灭剂。
本公开的检测DNA甲基化的方法是相对于现有甲基化检测方法已作出显著改进的三重SEPT9甲基化MS-qPCR测定法,图1概略显示了其工作流程,其中,MS-qPCR分析包括两组引物和探针,这些引物和探针可与位于SEPT9的外显子1区域中的多个5-mCyt(5-甲基化胞嘧啶)(如图2B所示CpG3中235bp区域)特异性结合。此外,根据本公开设计的引物可以含有两个3'硫代核苷酸键,这可以增加引物的保存期限,并在整个试验期间,增加对甲基化SEPT9的结合特异性。
IV.特点
本公开所提供的SEPT9基因特定区域的甲基化检测方法具有以下特点:
1)所检测区域的甲基化状态能极好地区分正常组织与大肠癌肿瘤组织。通过癌症基因组图谱网络(TCGA)中大肠癌甲基化位点数据分析,我们找到一个位于SEPT9基因区域的CpG位点,该位点的甲基化状态在大肠癌病人正常组织与癌组织间具有极显著差异(图2A)。本公开所提供的SEPT9基因特定区域甲基化检测包含了该位点的检测。
2)本公开中开发的测定方法和随后上述的试剂盒可以将生物标记的检测特异性提高至皮克(pg)-纳克(ng)级别的DNA分子(见实施例1)。灵敏性的增加是通过使用经多次优化的甲基化特异性的引物及探针来实现。更合适的引物及探针结合位点使得PCR扩增效率更好,因而也提高了检测灵敏度。
3)引物及探针经过优化设计及多次筛选,提高了检测的特异性。本公开所提供的SEPT9基因特定区域甲基化检测是通过三重qPCR实现的,优化设计的甲基化特异引物及探针减少了非特异性扩增,因而提高了检测的特异性(见实施例2)。
4)本公开中开发的癌症检测测定对大肠癌是特异性的。为了提高检测的准确性,本公开所设计的引物及探针均特异性识别甲基化DNA区域,而Epigenomics公司的产品仅探针能特异性识别甲基化DNA区域,此外,本公开所提供的检测方法使用了两组引物和探针组合对SEPT9基因两个区域进行甲基化状态检测,相比较Epigenomics公司仅使用一组引物和探针组合对SEPT9基因一个区域进行甲基化状态检测,本公开所提供的SEPT9基因特定区域甲基化检测方法具有更低的假阳性比例(见实施例3)。在优选配置中,这两个区域的检测可以在一个反应中完成。
实施例
下面通过实施例来进一步说明本公开的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本公开,不应视为对本公开的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。本公开中DNA提取的工作流程使用柱式Qiagen QIAamp循环核酸试剂盒进行,本公开已经证明可从10mL人血样品中获得约40ng DNA。DNA提取后,使用ZymoReserach Methylation-Lightning试剂盒进行亚硫酸氢盐处理以将DNA转化以提供qPCR。
实施例1SEPT9基因甲基化三重检测方法灵敏度测试
实验材料
1.甲基化人类基因组DNA(购自NEB公司,货号N4007)
2.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司,货号D5031)
3.SEPT9扩增子1(SEPT9_1)及扩增子2(SEPT9_2)对应引物及探针(见下表)
4.ACTB扩增引物及探针(见下表)
5.AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司,货号4311806)
其中,上述各引物的3'末端两个核苷酸通过硫代核苷酸化进行修饰;DNA探针在5'末端含有TaqMan荧光团,并在3'末端附着荧光猝灭剂。
实验方法
1.DNA片段化处理
为了模拟游离DNA片段长度,本实验采用超声波处理甲基化人类基因组DNA,使其片段化,处理后DNA片段长度范围50bp-400bp,峰值为180bp左右。
2.片段化DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对片段化的甲基化人类基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。实验步骤按照试剂盒说明书进行。
3.三重qPCR扩增
使用Thermo Fisher公司Quant Studio 3instrument进行qPCR扩增,选择Taqman分析法。DNA模板分别为1pg,10pg,25pg,50pg,100pg,1ng以及10ng亚硫酸氢盐处理过的DNA。每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL,其中含1xPCR缓冲液,400nMSEPT9引物(SEPT9_1和SEPT9_2两对引物),250nM SEPT9探针(SEPT9_1和SEPT9_2两种探针),200nM ACTB引物,100nM ACTB探针以及50nM ROX染料。PCR程序为:一个循环95℃10min,然后50个循环95℃ 15s,65℃ 30sec。PCR反应结束后,将Ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中,设定为0.1)。Ct值小于40的扩增被认定为阳性。
实验结果
实验结果表明,当DNA模板量低至25pg时,该三重qPCR检测依旧能在三个重复实验中全部检测出SEPT9扩增子1(SEPT9_1)及扩增子2(SEPT9_2)的阳性扩增。当DNA模板量低至10pg时,该三重qPCR检测能在三个重复中检测出SEPT9扩增子1(SEPT9_1)的阳性扩增(Ct=38.36)。
qPCR扩增效率是鉴定该PCR是否正常扩增的标准,介于90-110%之间表明该PCR具有较好的扩增效率。该数值是根据标准曲线的斜率(Slope)计算而得。扩增效率=10(-1/斜率)–1。下表1显示本公开的三重SEPT9试验的Ct值以及扩增效率。
表1
从上表1可以看出,本公开的三重SEPT9试剂较敏感,可用于检测25pg-10ng的DNA输入。本公开的SEPT9扩增子1(SEPT9_1),扩增子2(SEPT9_2)及ACTB的扩增效率均处于良好范围。
讨论
本实验使用不同DNA模板量,采用了本公开所设计的引物和探针对SEPT9的两个甲基化区域进行特异甲基化扩增。实验结果表明该方法可以检测到低至25pg的模板DNA(见上表1),低于同类产品Epigenomic epiProcolon v2.0assay所报道的最低检测量,后者为49pg。应当注意的是,本公开采用的是三重qPCR,每个qPCR设置三个重复,结果要求三个ACTB重复均为阳性,并且三份重复中至少两份对于两个SEPT9扩增子都是阳性的,才判定该样品对于SEPT9甲基化是阳性的。而epiProcolon v2.0assay为二重qPCR,只有一个SEPT9扩增子,三份重复中有两份SEPT9阳性扩增则判定该样本为SEPT9甲基化阳性。和二重qPCR相比,三重qPCR由于所受影响因素更多,且对可重复性要求更高,理论上更难获得更高的灵敏度,但本公开的三重qPCR检测灵敏度高于在同类产品所使用的两重qPCR方法,这主要得益于本公开的引物和探针设计。更合适的引物及探针结合位点使得PCR扩增效率更好,因而也提高了检测灵敏度。
实施例2SEPT9基因甲基化三重检测方法与epiProcolon v2.0高灵敏PCR试剂盒比较
实验材料
1.非甲基化人类基因组DNA(购自Promega公司,货号G3041)
2.甲基化人类基因组DNA(购自NEB公司,货号N4007)
3.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司,货号D5031)
4.SEPT9扩增子1(SEPT9_1)及扩增子2(SEPT9_2)对应引物及探针(同实施例1)
5.ACTB扩增引物及探针(同实施例1)
6.AmpliTaq GoldTM DNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司,货号4311806)
7.epiProcolon v2.0高灵敏PCR试剂盒(购自Epigenomics公司,货号M5-02-002)
实验方法
1.DNA片段化处理
将非甲基化人类基因组DNA及甲基化人类基因组DNA经超声波处理,使其片段化,处理后DNA片段长度范围50bp-400bp,峰值为180bp左右。
2.片段化DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对片段化的甲基化人类基因组DNA及非甲基化人类基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。实验步骤按照试剂盒说明书进行。
3.qPCR扩增
3.1三重qPCR扩增
将0pg,5pg,50pg或500pg经亚硫酸氢盐处理的甲基化人类基因组DNA分别混入一定量亚硫酸氢盐处理的非甲基化人类基因组DNA中,使得每个样品总DNA量为5ng。使用Thermo Fisher公司Quant Studio 3instrument进行qPCR扩增,选择Taqman分析法。每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL,其中含1xPCR缓冲液,400nM SEPT9引物(SEPT9_1和SEPT9_2两对引物),250nM SEPT9探针(SEPT9_1和SEPT9_2两种探针),200nMACTB引物,100nM ACTB探针以及50nM ROX染料。PCR程序为:一个循环95℃ 10min,然后50个循环95℃ 15s,65℃ 30sec。PCR反应结束后,将Ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中,设定为0.1)。Ct值小于40的扩增被认定为阳性。
3.2epiProcolon v2.0高灵敏PCR
用同样的模板DNA采用epiProcolon v2.0高灵敏PCR试剂盒进行扩增。PCR体系及方法按照试剂盒说明书进行。该体系为30μL反应体系,含1xPCR混合液及DNA聚合酶,反应程序为94℃变性20分钟(0.95℃/s变温速度),然后45个循环62℃ 5秒(1.9℃/s变温速度),55.5℃ 35秒(1.9℃/s变温速度),93℃ 30s(0.95℃/s变温速度),最后40℃保温5秒(1.9℃/s变温速度)。PCR反应结束后,将Ct阈值设定在线性扩增区间。在本实验中,Ct值小于40的扩增被认定为阳性。
4.PCR产物电泳检测
使用Agilent D1000ScreenTape System对PCR产物进行检测。
实验结果
下表2显示本公开的三重SEPT9试验和epiProcolon v2.0高灵敏PCR试验进行比较的结果。
表2
实验结果显示,低至50pg甲基化DNA在三重qPCR扩增和epiProcolon v2.0高灵敏PCR中均检测到SEPT9甲基化阳性,但5pg甲基化DNA在两种方法中均检测不到SEPT9甲基化(上表2)。随后的电泳检测发现在epiProcolon v2.0高灵敏PCR产物中出现大量非特异性扩增条带,而本公开所采用的三重qPCR扩增产物只有特异性扩增条带,没有(或只有微弱)非特异性扩增条带(图3)。
讨论
虽然三重qPCR扩增在更小的反应体系(10μL)中使用了更多种类的引物和探针,但PCR扩增特异性非常好,几乎没有非特异扩增,而epiProcolon v2.0高灵敏PCR尽管含有较少种类的引物和探针,却出现了大量非特异性扩增。产生这样区别的主要原因应该是本公开所设计的引物及探针特异性更好,这也印证了实施例1中所述,更合适的引物及探针结合位点使得PCR扩增效率更好。
实施例3使用SEPT9甲基化三重qPCR检测及epiProcolon v2.0高灵敏PCR试剂盒检测正常对照样本
实验材料
1.健康人血浆(购自Bloodworks NW公司)
2.QIAamp循环系统核酸提取试剂盒(购自Qiagen公司,货号55114)
3.EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒(购自Zymo Research公司,货号D5031)
4.SEPT9扩增子1(SEPT9_1)及扩增子2(SEPT9_2)对应引物及探针(同实施例1)
5.ACTB扩增引物及探针(同实施例1)
6.AmpliTaq GoldTM DNA聚合酶及缓冲试剂(购自Thermo Fisher公司,货号4311806)
7.epiProcolon v2.0高灵敏PCR试剂盒(购自Epigenomics公司,货号M5-02-002)
实验方法
1.血浆游离DNA提取
使用QIAamp循环系统核酸提取试剂盒从10份血浆样本中提取游离DNA,步骤按照试剂盒说明书进行。
2.片段化DNA甲基化转化
使用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒对提取的10份血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化。样本均分为两份分别用于三重qPCR扩增和epiProcolon v2.0高灵敏PCR扩增。
3.qPCR扩增
3.1三重qPCR扩增
对亚硫酸氢盐处理过的血浆游离DNA使用Thermo Fisher公司Quant Studio3instrument进行qPCR扩增,选择Taqman分析法。每个模板的PCR扩增做三个重复。每个反应体系10μL,其中含1xPCR缓冲液,400nM SEPT9引物(SEPT9_1和SEPT9_2两对引物),250nMSEPT9探针(SEPT9_1和SEPT9_2两种探针),200nM ACTB引物,100nM ACTB探针以及50nM ROX染料。PCR程序为:一个循环95℃ 10min,然后50个循环95℃ 15s,65℃ 30sec。PCR反应结束后,将Ct阈值设定在线性扩增区间(本实验中,设定为0.1)。Ct值小于40的扩增被认定为阳性。
3.2epiProcolon v2.0高灵敏PCR
用同等量的血浆游离DNA采用epiProcolon v2.0高灵敏PCR试剂盒进行扩增。PCR体系及方法按照试剂盒说明书进行。该体系为30μL反应体系,含1xPCR混合液及DNA聚合酶,反应程序为94℃变性20分钟(0.95℃/s变温速度),然后45个循环62℃ 5秒(1.9℃/s变温速度),55.5℃ 35秒(1.9℃/s变温速度),93℃ 30s(0.95℃/s变温速度),最后40℃保温5秒(1.9℃/s变温速度)。PCR反应结束后,将Ct阈值设定在线性扩增区间。在本实验中,Ct值小于40的扩增被认定为阳性。
实验结果
下表3显示使用本公开的三重测定(CuraClound三重检测)或epiProcolon v2.0高灵敏PCR检测平行进行对从十个健康个体获得十个血浆样品进行检测的结果。
表3
该实验所使用10份血浆全部为健康人样本。使用本公开所设计的三重qPCR扩增,结果10份样本全部为SEPT9甲基化阴性,而使用epiProcolon v2.0高灵敏PCR检测结果为9例SEPT9甲基化阴性,1例SEPT9甲基化阳性(上表3)。
讨论
本公开所采用的三重qPCR扩增采用两对甲基化特异引物及探针对SEPT9的两个甲基化区域进行特异扩增,要求ACTB在三个重复中全部有特异扩增,并且SEPT9的两个扩增子都至少在两份重复实验中为阳性,才会将该样本认定为SEPT9甲基化阳性。而epiProcolonv2.0高灵敏PCR仅使用一对特异引物及探针对SEPT9的一个甲基化区域进行扩增,只要三个重复中有两个阳性SEPT9扩增子即将该样本认定为SEPT9甲基化阳性。可见后者出现假阳性的可能更高。我们的此项实验也证实了这一点,在此次实验中epiProcolon v2.0高灵敏PCR的假阳性率为10%,而本公开所设计的三重qPCR扩增假阳性率为0。
根据本公开的检测方法,可以通过MS-qPCR测得Ct(Circle Threshold)值。当测得Ct值超过或等于40,受试者SEPT9基因的DNA甲基化位点的甲基化状态被判定为无法检出,因此当前受试者患大肠癌风险较低。当测得Ct值小于40,受试者SEPT9基因的DNA甲基化位点甲基化水平为阳性,因此有较高患大肠癌风险。
甲基化因为发生于肿瘤发生的超早期阶段,故被用于肿瘤早期监测;而因为其灵敏度高,假阳性一直是行业痛点。站在体检者的角度,过高的假阳性造成的心理负担可能是诱发其它疾病的隐患,违背了医学伦理。我们致力于钻研灵敏度高,同时假阳性低的试剂盒,力求不放过任何一个正在早期发生的肿瘤,真正实现大肠癌早发现,早干预,早治疗,提高生存率和生存质量。
参考文献
1.Siegel,R.L.,Miller,K.D.&Jemal,A.Cancer Statistics,2017.CA Cancer JClin 67,7–30(2017).
2.Siravegna,G.,Marsoni,S.,Siena,S.&Bardelli,A.Integrating liquidbiopsies into the management of cancer.Nat Rev Clin Oncol 1–18(2017).doi:10.1097/PAS.0000000000000827
3.Sidransky,D.Emerging molecular markers of cancer.Nat.Rev.Cancer 2,210–9(2002).
4.Underhill,H.R.et al.Fragment Length of Circulating Tumor DNA.PLoSGenet.12,1–24(2016).
5.Wan,J.C.M.et al.Liquid biopsies come of age:towards implementationof circulating tumour DNA.Nat.Rev.Cancer 17,223–238(2017).
6.Diaz,L.A.&Bardelli,A.Liquid biopsies:Genotyping circulating tumorDNA.J.Clin.Oncol.32,579–586(2014).
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市新合生物医疗科技有限公司
<120> 三重qPCR检测DNA甲基化的试剂盒和方法
<130> DI18-0410-XC37
<150> US 62/712,181
<151> 2018-07-30
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<211> 235
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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cgcgggcgcg gcgccccagc cagcgcgcag ggcccgggcc ccgccggggg cgcttcctcg 120
ccgctgccct ccgcgcgacc cgctgcccac cagccatcat gtcggacccc gcggtcaacg 180
cgcagctgga tgggatcatt tcggacttcg aaggtgggtg ctgggctggc tgctg 235
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<212> DNA
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atgggatcat tt 72
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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cag 63
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<220>
<223> SEPT9反向引物
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actcctccga cgactaactc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> SEPT9 DNA探针
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<212> DNA
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<220>
<223> ACTB DNA探针
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tggtgatgga ggaggtttag gcagt 25
Claims (10)
1.一种试剂盒,其包含三组引物和探针的组合,其中两组引物和探针的组合是以选自下列人类基因序列范围内的两个区域为靶点设计的引物和探针的组合,另一组引物和探针的组合是以内部参照基因为靶点设计的引物和探针的组合:
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述两组引物和探针的组合是以SEQ ID NO:1中的两个区域为靶点设计的两组引物和探针的组合,优选地,所述两组引物和探针的组合中,一组引物和探针的组合是以SEQ ID NO:2为靶点设计的引物和探针的组合,以及另一组引物和探针的组合是以SEQ ID NO:3为靶点设计的引物和探针的组合,和/或
所述内部参照基因为β肌动蛋白基因。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其包括下列引物和探针的组合:
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒,其中,所述引物为经修饰的引物,优选地,所述引物在其末端被修饰,更特别地,所述引物的3'末端的两个核苷酸通过硫代核苷酸化进行修饰。
5.一种检测生物样本中SEPT9基因特定区域的DNA甲基化的方法,包括以下步骤:
(1)对从生物样本得到的DNA进行亚硫酸氢盐处理;
(2)用三组引物和探针的组合对经步骤(1)处理过的DNA进行甲基化特异性qPCR,其中两组引物和探针的组合以选自下列人类基因序列范围内的两个区域为靶点设计,另一组引物和探针的组合的靶点为内部参照基因:
(3)根据步骤(2)中的甲基化特异性qPCR的结果确定该SEPT9基因特定区域的DNA甲基化水平或状态。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述两组引物和探针的组合以SEQ ID NO:1中两个区域为靶点设计,优选地,所述两组引物和探针的组合中,一组引物和探针的组合以SEQID NO:2为靶点设计,以及另一组引物和探针的组合以SEQ ID NO:3为靶点设计,和/或
所述内部参照基因为β肌动蛋白基因。
7.根据权利要求5所述的方法,其中,步骤(2)中,使用下列引物和探针的组合:
8.根据权利要求5所述的方法,其中,步骤(1)中所述生物样本是人的液体活组织检查样本,和/或
步骤(1)中,所述从生物样本得到的DNA是使用柱式Qiagen QIAamp体液游离核酸提取试剂盒进行DNA提取得到的,和/或
步骤(1)中,使用EZ DNA Methylation-Lightning试剂盒进行亚硫酸氢盐处理以将DNA转化以用于甲基化特异性qPCR。
9.根据权利要求5所述的方法,其中,步骤(2)中所述DNA进行甲基化特异性qPCR在一个反应体系中完成。
10.根据权利要求5所述的方法,其中,步骤(2)中所述引物为经修饰的引物,优选地,所述引物在其末端被修饰,更特别地,所述引物的3'末端的两个核苷酸通过硫代核苷酸化进行修饰。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109504780A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-03-22 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
CN110305940A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-10-08 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒 |
CN110964823A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒和检测方法 |
CN111647655A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-09-11 | 南京普派医疗科技有限公司 | 一种多靶点粪便dna甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法 |
CN112159844A (zh) * | 2020-05-25 | 2021-01-01 | 浙江中创生物医药有限公司 | 结直肠癌dna甲基化的检测方法及试剂 |
CN112322743A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-02-05 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 检测人sept9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用 |
CN114410810A (zh) * | 2022-01-06 | 2022-04-29 | 广州蔚捷生物医药科技有限公司 | 一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2698436A1 (en) * | 2012-08-14 | 2014-02-19 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Colorectal cancer markers |
US20150072866A1 (en) * | 2012-03-20 | 2015-03-12 | Exact Sciences Corporation | Marker panel for detecting cancer |
CN103789428B (zh) * | 2014-01-22 | 2015-04-15 | 北京神源德生物科技有限公司 | 引物对及其应用及检测sept9dna甲基化状态的试剂盒 |
CN105506133A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-04-20 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 用于检测sept9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法 |
CN107385056A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-24 | 上海时代基因医学科技有限公司 | 一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用 |
CN107475366A (zh) * | 2017-07-03 | 2017-12-15 | 博尔诚(北京)科技有限公司 | 一种用于检测疾病的组合物及其试剂盒和用途 |
CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
-
2018
- 2018-09-11 CN CN201811056731.2A patent/CN109112216B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150072866A1 (en) * | 2012-03-20 | 2015-03-12 | Exact Sciences Corporation | Marker panel for detecting cancer |
EP2698436A1 (en) * | 2012-08-14 | 2014-02-19 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Colorectal cancer markers |
CN103789428B (zh) * | 2014-01-22 | 2015-04-15 | 北京神源德生物科技有限公司 | 引物对及其应用及检测sept9dna甲基化状态的试剂盒 |
CN105506133A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-04-20 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 用于检测sept9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法 |
CN107475366A (zh) * | 2017-07-03 | 2017-12-15 | 博尔诚(北京)科技有限公司 | 一种用于检测疾病的组合物及其试剂盒和用途 |
CN107385056A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-24 | 上海时代基因医学科技有限公司 | 一种检测SEPT9基因不同Cpg岛甲基化的试剂盒及应用 |
CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
QIONG HE等: "Development of a multiplex MethyLight assay for the detection of multigene methylation in human colorectal cancer", 《CANCER GENET CYTOGENET》 * |
吴涛等: "结直肠癌AREG基因的表达与甲基化水平", 《世界华人消化杂志》 * |
深圳市百迈生命科学有限公司: "修饰引物常见类型及应用", 《 HTTP://WWW.BM-LS.COM/ZILIAO/2015/77.HTML》 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109504780A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-03-22 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
CN109504780B (zh) * | 2019-01-21 | 2021-09-14 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
CN110305940A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-10-08 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒 |
CN110964823A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-07 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒和检测方法 |
CN111647655A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-09-11 | 南京普派医疗科技有限公司 | 一种多靶点粪便dna甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法 |
CN112159844A (zh) * | 2020-05-25 | 2021-01-01 | 浙江中创生物医药有限公司 | 结直肠癌dna甲基化的检测方法及试剂 |
CN112159844B (zh) * | 2020-05-25 | 2022-05-03 | 浙江中创生物医药有限公司 | 结直肠癌dna甲基化的检测方法及试剂 |
CN112322743A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-02-05 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 检测人sept9基因甲基化的试剂盒及其使用方法、应用 |
CN114410810A (zh) * | 2022-01-06 | 2022-04-29 | 广州蔚捷生物医药科技有限公司 | 一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109112216B (zh) | 2022-04-08 |
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