CN114410810A - 一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用，通过设计得到的特异性引物组合探针组，实现了对14种非结核分枝杆菌的快速和准确的检测和鉴定，对引物组进行多重荧光PCR扩增得到的扩增产物进行熔解曲线分析，获得熔解温度，依据熔解温度能够快速准确的对14种非结核分枝杆菌进行检测。且本发明中的PCR‑HRM检测方法具有较高的检测通量，显著缩短了非结核分枝杆菌的检测时间，此外，本发明中的PCR‑HRM检测方法还具有真实性高、准确性高、特异性强、灵敏度高以及抗干扰物能力强的优点，比临床一般要求的灵敏度敏感10‑20倍。

Description

一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及了一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是分枝杆菌属内除结核分枝杆菌(MTB)复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。非结核分枝杆菌主要包括鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、戈尔登分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)、蟾蜍分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、猿猴分枝杆菌(Mycobacterium.simiae)、苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、玛尔摩分枝杆菌(Mycobacterium malmoense)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intercelleulare)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)和亚洲分枝杆菌(Mycobacterium arisiense)。NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官，并可引起全身播散性疾病，具有较大的危害性。
NTM病与结核病具有相似的临床表现，包括全身中毒症状和局部损害症状。因此，在无菌种鉴定结果的情况下，NTM病常被误诊为结核病及支气管扩张等。NTM病因感染菌种、受累组织和器官的不同，其临床表现也不相同，临床上快速鉴别并区分NTM的具体种属存在一定的困难。
因此，开发一种快速检测且能够有效鉴别NTM具体种属的检测产品对于NTM的早期诊断和及时治疗具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用，本发明中的检测方法操作简单，可快速得到检测结果，且本发明中的检测方法采用两管检测试剂，一管试剂可以检测7种菌种，大大提高了检测通量，显著缩短了非结核分枝杆菌的检测时间。且本发明中的检测方法具有较好的准确性和特异性，较高的敏感度以及较强的抗干扰物能力。
本发明的第一个方面，提供了一种检测非结核分枝杆菌的荧光定量PCR-HRM引物组，所述非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和亚洲分枝杆菌。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物组的核苷酸序列为：
NMT引物对：
NMT-F：5'-AGAAGACCGACGACGTBGC-3'(SEQ ID NO:1)；
NMT-R：5'-RTCTSGGTGAYCTTYTCSAC-3'(SEQ ID NO:2)；
其中，NMT引物对可以靶向识别非结核分枝杆菌。
人源内标基因引物对：
人源内标基因-F：5'-TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT-3'(SEQ ID NO:10)；
人源内标基因-R：5'-AACACACAATAACAAACACAAATTCAC-3'(SEQ ID NO:11)。
本发明的第二个方面，提供一种检测非结核分枝杆菌的荧光定量PCR-HRM探针组，所述非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和亚洲分枝杆菌。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述探针组的核苷酸序列为：
戈尔登分枝杆菌探针：gordonae-P2探针：
Figure BDA0003458467310000021
Figure BDA0003458467310000022
其中，gordonae-P2探针为反义探针；
脓肿分枝杆菌：abscessus-P2探针：
Figure BDA0003458467310000023
Figure BDA0003458467310000024
鸟分枝杆菌复合群：avium-HSP-P1探针：
Figure BDA0003458467310000025
Figure BDA0003458467310000026
亚洲分枝杆菌：arisiense-HSP-P1探针：
Figure BDA0003458467310000027
Figure BDA0003458467310000028
偶发分枝杆菌：fortuitum-HSP-P2探针：
Figure BDA0003458467310000029
Figure BDA00034584673100000210
嗜血分枝杆菌：haemophilum-HSP-P2探针：
Figure BDA00034584673100000211
Figure BDA00034584673100000212
胞内分枝杆菌：intercelleulare-HSP-P2探针：
Figure BDA00034584673100000213
Figure BDA00034584673100000214
堪萨斯分枝杆菌：kansasii-HSP-P2探针：
Figure BDA00034584673100000215
Figure BDA00034584673100000216
玛尔摩分枝杆菌：malmoense-HSP-P2探针：
Figure BDA00034584673100000217
Figure BDA00034584673100000218
瘰疬分枝杆菌：scrofulaceum-HSP-P3探针：
Figure BDA00034584673100000219
Figure BDA00034584673100000220
苏尔加分枝杆菌：szulgai-HSP-P1探针：
Figure BDA00034584673100000221
Figure BDA00034584673100000222
蟾蜍分枝杆菌：xenopi-HSP-P2探针：
Figure BDA00034584673100000223
猿猴分枝杆菌：simiae-HSP-P1探针：
Figure BDA00034584673100000224
龟分枝杆菌：chelonae-HSP-P1探针：
Figure BDA00034584673100000225
Figure BDA00034584673100000226
人源内标基因-P3探针：
Figure BDA00034584673100000227
或者为这些序列的核苷酸互补序列，其中，标粗的碱基为按照本领域的常规技术手段进行硫化修饰后的碱基，防止探针被非限制性核酸内切酶降解。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述探针组的序列两端标记的荧光基团和淬灭基团各不相同。
在本发明的一些更优选的实施方式中，gordonae、abscessus、kansasii和malmoense探针序列标记的荧光基团都为FAM，avium、arisiense、scrofulaceum和szulgai探针序列标记的荧光基团为HEX，fortuitum、haemophilum、xenopi和simiae探针序列标记的荧光基团为TAMRA，intercelleulare、chelonae和人源内标基因探针标记的荧光基团为CY5；gordonae、abscessus、kansasii、malmoenseavium、arisiense和scrofulaceum的淬灭基团是BHQ1，szulgai和fortuitum的淬灭基团是BHQ2，haemophilum、xenopi、simiaeintercelleulare、chelonae和人源内标基因探针的淬灭基团是BHQ3。
本发明的第三个方面，提供一种非结核分枝杆菌的荧光定量PCR-HRM检测试剂盒，所述非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和亚洲分枝杆菌。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述PCR-HRM试剂盒中含有本发明的第一个方面中的引物组和/或本发明第二个方面的探针组。
在本发明的一些优选实施方式中，所述PCR-HRM检测试剂盒中还包括脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、Buffer混合液、阳性对照、阴性对照和DNA聚合酶中的一种或几种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述Buffer混合液为HS HiTaq Buffer(Mg2+Plus)，购自菲鹏生物股份有限公司。
在本发明的一些优选实施方式中，所述DNA聚合酶为Hotstart HiTaq DNAPolymerase(5U/μl)，购自菲鹏生物股份有限公司。
本发明的第四个方面，提供了一种本发明第一方面所述的引物组和/或本发明第二方面所述的探针组在制备荧光定量PCR-HRM检测试剂盒中的应用。
根据本发明第四方面的内容，在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR-HRM检测试剂盒的使用具体包括以下步骤：
(1)提取待测样品中的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，使用本发明第三方面所述的荧光定量PCR-HRM检测试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)结果判定：对扩增产物进行HRM分析，根据扩增产物实际熔解曲线的Tm值与非结核分枝杆菌的标准熔解曲线Tm值做对比，判定待测样品中是否具有相应的非结核分枝杆菌；其中所述非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和亚洲分枝杆菌。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述阳性质控品为以非结核分枝杆菌和人源内标基因的通用引物扩增标准菌株，利用本发明第一方面的引物组PCR扩增获得目的片段，然后将各目的片段运用多片段重组方式构建成质粒载体，从而获得阳性表达质粒。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述阴性质控品为TE溶液。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述多重荧光定量PCR扩增体系包括PCR反应体系1和PCR反应体系2，如表1和表2所示：
表1 PCR反应体系1的组成
各组分名称 终浓度 含量(μL)
HS HiTaq Buffer(Mg<sup>2+</sup>Plus) 1× 5
dNTPs 375μmol/L 1
SEQ ID NO:1 1μmol/L 1
SEQ ID NO:2 1μmol/L 1
SEQ ID NO:3 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:4 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:5 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:6 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:7 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:8 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:9 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:10 1μmol/L 1
SEQ ID NO:11 1μmol/L 1
SEQ ID NO:12 0.2μmol/L 1
GC增强剂 1× 4
ddH<sub>2</sub>O / 21
表2 PCR反应体系2的组成
Figure BDA0003458467310000041
Figure BDA0003458467310000051
在本发明的一些优选实施方式中，dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
在本发明的一些优选实施方式中，多重荧光定量PCR扩增反应的程序为：90～97℃，5～15min；90～97℃，10～20s，50～70℃，50～70s；45个循环。
在本发明的一些更优选的实施方式中，PCR扩增反应的程序为：95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s，45个循环。
在本发明的一些优选实施方式中，高分辨率熔解曲线(HRM)分析的程序为：90～97℃，1～3min；30～50℃，2～6min；40～80℃，采集荧光信号进行分析，荧光信号采集的速率为0.1℃/步。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述荧光信号的采集通道为FAM、HEX、TAMRA和CY5。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤(3)中所述的结果判定的方法为：
PCR反应体系1的结果判定方法：
(1)若FAM通道检测到Tm(55.0±3℃)特征峰，表示gordonae检测结果为阳性，说明待测样品中含有gordonae；若没有检测到Tm(55.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有gordonae；
(2)若FAM通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示abscessus检测结果为阳性，说明待测样品中含有abscessus；若没有检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有abscessus；
(3)若HEX通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示avium检测结果为阳性说明待测样品中含有avium；若没有检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有avium；
(4)若HEX通道检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，表示arisiense检测结果为阳性说明待测样品中含有arisiense；若没有检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有arisiense；
(5)若TAMRA通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示fortuitum检测结果为阳性说明待测样品中含有fortuitum；若没有检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有fortuitum；
(6)若TAMRA通道检测到Tm(60.0±3℃)特征峰，表示haemophilum检测结果为阳性说明待测样品中含有haemophilum；若没有检测到Tm(60.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有haemophilum；
(7)若Cy5通道检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，表示intercelleulare检测结果为阳性说明待测样品中含有intercelleulare；若没有检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有intercelleulare；
(8)若Cy5通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示人源内标基因检测结果为阳性；若没有检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有人源内标基因
PCR反应体系2的结果判定：
(1)若FAM通道检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，表示kansasii检测结果为阳性说明待测样品中含有kansasii；若没有检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有kansasii；
(2)若FAM通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示malmoense检测结果为阳性说明待测样品中含有malmoense；若没有检测到(51.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有malmoense；
(3)若HEX通道检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，表示scrofulaceum检测结果为阳性说明待测样品中含有scrofulaceum；若没有检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有scrofulaceum；
(4)若HEX通道检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，表示szulgai检测结果为阳性说明待测样品中含有szulgai；若没有检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有szulgai；
(5)若TAMRA通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示xenopi检测结果为阳性说明待测样品中含有xenopi；若没有检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有xenopi；
(6)若TAMRA通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示simiae检测结果为阳性说明待测样品中含有simiae；若没有检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有simiae；
(7)若Cy5通道检测到Tm(47.0±3℃)特征峰，表示chelonae检测结果为阳性说明待测样品中含有chelonae；若没有检测到Tm(47.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有chelonae；
(8)若Cy5通道检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，表示人源内标基因检测结果为阳性，说明待测样品中含有人源内标基因；若没有检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，则说明待测样品中不含有人源内标基因。
本发明的有益效果是：
1、本发明建立了可快速检测非结核分枝杆菌的PCR-HRM检测方法，该检测方法操作简单，可快速得到检测结果，且本发明中的方法采用两管检测试剂，一管试剂可以检测7种菌种，大大提高了检测通量，显著缩短了非结核分枝杆菌的检测时间。
2、本发明中的PCR-HRM检测方法的操作过程均为闭管反应，显著降低了污染，本发明中的方法含有人源内标基因的检测，保证了整个试剂盒扩增过程的有效性，保证了测试结果的真实性。
3、本方法中结合了PCR和HRM的优点，实现在单色荧光通道中同时进行两个目标靶点的检测和分析，且具有较高的准确性和特异性，可以准确、快速和高通量地对菌种进行分析，有利于在临床实践中推广。
4、本发明中PCR-HRM检测方法具有较高的灵敏度和较好的精密度，比临床要求的灵敏度(1000copies/mL)敏感10-20倍，检测重复性参考品时，检测结果均一致，CV≤5.0％。且本发明中的PCR-HRM检测方法抗干扰物能力强，内源性干扰物人全血、粘蛋白和血红素对检测结果均没有干扰，可以用于预测疾病风险和健康管理。
附图说明
图1为gordonae阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图2为abscessus阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图3为avium阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图4为arisiense阳性标准样品的熔解曲线图(其中，，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图5为fortuitum阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图6为haemophilum阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图7为intercelleulare阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图8为kansasii阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图9为malmoense阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图10为scrofulaceum阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图11为szulgai阳性标准样品熔解曲线图的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图12为xenopi阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图13为simiae阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)；
图14为chelonae阳性标准样品的熔解曲线图(其中，A线表示阳性标准样品的熔解曲线，B线为阴性质控品的熔解曲线)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 引物和探针的设计合成
根据Genebank公布的非结核分枝杆菌中的鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、亚洲分枝杆菌以及人源内标基因的基因组序列，比对分析各基因组序列的差异，设计探针和引物。
最终设计得到的引物对及对应的探针序列如下所示：
NMT的引物对：
上游引物NMT-F：5'-AGAAGACCGACGACGTBGC-3'(SEQ ID NO:1)；
下游引物NMT-R：5'-RTCTSGGTGAYCTTYTCSAC-3'(SEQ ID NO:2)；
NMT的探针组：
戈尔登分枝杆菌：gordonae-P2(反义)探针：5'-CCACCGTGCTGGCGCAGG-3'(SEQ IDNO:3)；
脓肿分枝杆菌：abscessus-P2探针：5'-TTCTTGCCCAGGCCCTGGTCAAG-3'(SEQ IDNO:4)；
鸟分枝杆菌复合群：avium-HSP-P1探针：5'-CACGGTGCTCGCCCAGGCGTTGG-3'(SEQID NO:5)；
亚洲分枝杆菌：arisiense-HSP-P1探针：5'-ACGACGGCGACGGTGCTGGCC-3'(SEQ IDNO:6)；
偶发分枝杆菌：fortuitum-HSP-P2探针：5'-TTCTGGCACAGGCCCTGGTT-3'(SEQ IDNO:7)；
嗜血分枝杆菌：haemophilum-HSP-P2探针：5'-CACGACGGCGACGGTGCTG-3'(SEQ IDNO:8)；
胞内分枝杆菌：intercelleulare-HSP-P2探针：5'-CTGGCTCAGGCGTTGGTCC-3'(SEQID NO:9)；
堪萨斯分枝杆菌：kansasii-HSP-P2探针：5'-CTCGCGCAGGCGTTGGTCAAAGA-3'(SEQID NO:13)；
玛尔摩分枝杆菌：malmoense-HSP-P2探针：5'-CTGGCGCAGGCGCTGGTCAA-3'(SEQ IDNO:14)；
瘰疬分枝杆菌：scrofulaceum-HSP-P3探针：5'-CCACGGTGCTGGCCCAGGC-3'(SEQ IDNO:15)；
苏尔加分枝杆菌：szulgai-HSP-P1探针：5'-CTCGCCCAGGCGCTGGTGCG-3'(SEQ IDNO:16)；
蟾蜍分枝杆菌：xenopi-HSP-P2探针：5'-ACGGCGACCGTGCTGGCGC-3'(SEQ ID NO:17)；
猿猴分枝杆菌：simiae-HSP-P1探针：5'-CTCGCTCAGGCGCTCGTCAA-3'(SEQ ID NO:18)；
龟分枝杆菌：chelonae-HSP-P1探针：5'-TGCTGGCCCAGGCGCTGGTCAAGG-3'(SEQ IDNO:19)；
其中，标粗的碱基为按照本领域的常规技术手段进行硫化修饰后的碱基，防止探针被非限制性核酸内切酶降解。
其中，gordonae、abscessus、kansasii和malmoense探针序列标记的荧光基团都为FAM，avium、arisiense、scrofulaceum和szulgai探针序列标记的荧光基团为HEX，fortuitum、haemophilum、xenopi和simiae探针序列标记的荧光基团为TAMRA，intercelleulare、chelonae和人源内标基因探针标记的荧光基团为CY5；gordonae、abscessus、kansasii、malmoenseavium、arisiense和scrofulaceum的淬灭基团是BHQ1，szulgai和fortuitum的淬灭基团是BHQ2，haemophilum、xenopi、simiaeintercelleulare、chelonae和人源内标基因探针的淬灭基团是BHQ3。
实施例2 一种非结核分枝杆菌荧光定量PCR-HRM检测试剂盒
本实施例中的非结核分枝杆菌荧光定量PCR-HRM检测试剂盒的组成成分如表3和表4所示：
表3 试剂盒1的组成成分
Figure BDA0003458467310000091
表4 试剂盒2的组成成分
Figure BDA0003458467310000092
注：质粒用1×TE缓冲液溶解后，紫外分光光度法测定浓度，然后用1×TE缓冲液将其稀释至1×105copies/μL。
其中，PCR反应体系1和2中包括实施例1中的NMT的引物对和NMT探针组以及人源内标基因引物和探针。
其中，人源内标基因引物的核苷酸序列为：
上游引物：人源内标基因F：5'-TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT-3'(SEQ ID NO:10)；
下游引物：人源内标基因R：5'-AACACACAATAACAAACACAAATTCAC-3'(SEQ ID NO:11)；
人源内标基因-P3探针：
Figure BDA0003458467310000093
PCR反应体系中各组分的名称、终浓度和含量分别为表1和表2所示：
表1 PCR反应体系1的组成
各组分名称 终浓度 含量(μL)
HS HiTaq Buffer(Mg<sup>2+</sup>Plus) 1× 5
dNTPs 375μmol/L 1
SEQ ID NO:1 1μmol/L 1
SEQ ID NO:2 1μmol/L 1
SEQ ID NO:3 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:4 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:5 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:6 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:7 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:8 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:9 0.2μmol/L 1
SEQ ID NO:10 1μmol/L 1
SEQ ID NO:11 1μmol/L 1
SEQ ID NO:12 0.2μmol/L 1
GC增强剂 1× 4
ddH<sub>2</sub>O / 21
表2 PCR反应体系2的组成
Figure BDA0003458467310000101
Figure BDA0003458467310000111
根据表1和表2所示的PCR反应体系配制多重荧光定量PCR扩增体系。
其中，dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。
其中，GC增强剂为10％(w/v)甜菜碱，1％(w/v)PEG6000，1％(w/v)氯化镁和0.1％(w/v)氯化铜。
其中，在本实施例中，各NMT引物对的终浓度均为1μmol/L，各NMT探针的终浓度均为0.2μmol/L。
本实施例中的HS HiTaq Buffer(Mg2+Plus)购自菲鹏生物股份有限公司。
DNA聚合酶采用本领域常规的多重荧光PCR适用酶种，在本实施例中，DNA聚合酶购自菲鹏生物股份有限公司的Hotstart HiTaq DNA Polymerase(5U/μl)。
本实施例中的试剂盒还可以含有阳性质控品和阴性质控品。
在本实施例中，阳性质控品为以NMT和人源内标基因引物扩增标准菌株，然后利用上述实施例中的引物组PCR扩增获得目的片段，将各段目的片段运用多片段重组方式构建成质粒载体，从而获得阳性表达质粒。
在本实施例中，阴性质控品设置为TE溶液。
实施例3 标准阳性样品的制备以及PCR-HRM检测
(1)标准阳性样品核酸中DNA的提取：
待测样品分别为鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)，次要菌种有堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、戈尔登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、猿猴分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、玛尔摩分枝杆菌(Mycobacterium malmoense)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intercelleulare)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacteriumscrofulaceum)和亚洲分枝杆菌(Mycobacterium arisiense)(浓度大约在2.0×105copies/mL)以及人源内标基因。
待测样品DNA提取试剂及其仪器：采用广州蔚捷生物医药科技有限公司的磁珠法核酸提取或纯化试剂盒进行核酸提取。核酸提取仪器是蔚捷Auto-Extractor32核酸提取仪。具体操作按照试剂盒使用说明书进行。
(2)标准阳性样品的PCR-HRM检测：
根据表1和表2中的PCR反应体系按照本领域的常规技术手段进行PCR扩增，并进行PCR-HRM分析。
荧光PCR仪：ABI 7500 Real-Time PCR System。
在本实施例中，扩增程序设置为：95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s，45个循环。
在本实施例中，高分辨率熔解曲线分析程序为：95℃，1min；40℃，4min；40～80℃，采集FAM、HEX、TAMRA、CY5通道的荧光信号进行分析，荧光信号采集频率为0.1℃/步。
其中，目标靶点检测信号为FAM、HEX、TAMRA以及CY5通道的熔解曲线，人源内标基因检测信号为CY5通道的熔解曲线。
(3)阳性标准样品的PCR-HRM分析：
图1～图14分别为gordonae、abscessus、avium、arisiense、fortuitum、haemophilum、intercelleulare、kansasii、malmoense、scrofulaceum、szulgai、xenopi、simiae和chelonae的熔解曲线图，从图中可以看出，gordonae的特征熔解温度为56.6±3℃，abscessus的特征熔解温度为65±3℃，avium的特征熔解温度为51±3℃，arisiense的特征熔解温度为62±3℃，fortuitum的特征熔解温度为51±3℃，haemophilum的特征熔解温度为60±3℃，intercelleulare的特征熔解温度为46±3℃，人源内标基因的特征熔解温度为65±3℃，kansasii的特征熔解温度为64±3℃，malmoense的特征熔解温度为51±3℃，scrofulaceum的特征熔解温度为62±3℃，szulgai的特征熔解温度为46±3℃，xenopi的特征熔解温度为65±3℃，simiae的特征熔解温度为51±3℃，chelonae的特征熔解温度为47±3℃。
结果判断标准：
阳性对照：PCR反应体系1和PCR反应体系2的FAM、HEX、TAMRA、CY5通道均有两个熔解曲线特征峰，其特征峰的Tm值及对应检测菌种如表5和表6所示；
阴性对照：检测靶标均为阴性，即FAM、HEX、TAMRA、CY5通道中无熔解曲线特征峰。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
各检测位点在各通道中的Tm值的范围如表5和表6所示。
表5 PCR反应体系1的熔解峰Tm值
Figure BDA0003458467310000121
表6 PCR反应体系2的熔解峰Tm值
Figure BDA0003458467310000122
Figure BDA0003458467310000131
Tm值以仪器自动判读所得为准，当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时，可通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm值。不同仪器Tm可能有所偏差，以当次试验阳性对照为准。
根据表5和表6中的内容可以得到以下结论：
PCR反应体系1中的结果判断：
a、若FAM通道检测到Tm(55.0±3℃)特征峰，表示gordonae检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若FAM通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示abscessus检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；
b、若HEX通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示avium检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若HEX通道检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，表示arisiense检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；
c、若TAMRA通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示fortuitum检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若TAMRA通道检测到Tm(60.0±3℃)特征峰，表示haemophilum检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；
d、若Cy5通道检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，表示intercelleulare检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若Cy5通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示人源内标基因检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性，未提取到DNA或者存在扩增抑制，重新进行核酸提取；
PCR反应体系2的结果判断：
a、若FAM通道检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，表示kansasii检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若FAM通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示malmoense检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；
c、若HEX通道检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，表示scrofulaceum检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若HEX通道检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，表示szulgai检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；
c、若TAMRA通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示xenopi检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若TAMRA通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示simiae检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；
d、若Cy5通道检测到Tm(47.0±3℃)特征峰，表示chelonae检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性；若Cy5通道检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，表示人源内标基因检测结果为阳性，若该温度范围无熔解曲线特征峰或Tm不在该范围之间，则为阴性，未提取到DNA，重新进行核酸提取。
上述实施例中的PCR-HRM检测试剂盒的检测效果评估
1、特异性测试：
为了检测本发明用于检测非结核分枝杆菌的PCR-HRM检测试剂盒的特异性，进行了以下试验：
(1)实验方案：
采用实施例3中的标准阳性样品的制备方法提取鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)以及次要菌种堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、龟分枝杆菌(Mycobacteriumchelonae)、戈尔登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、猿猴分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、玛尔摩分枝杆菌(Mycobacterium malmoense)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intercelleulare)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)和亚洲分枝杆菌(Mycobacteriumarisiense)灭活培养物(浓度大约在2.0×105copies/mL)核酸中的DNA，将提取的DNA作为PCR扩增的模板。唾液链球菌肺孢子菌、白念珠菌、肺炎克雷伯菌、唾液链球菌、肺孢子菌、白念珠菌、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、奈瑟氏菌属、表皮葡萄球菌灭活的培养物(浓度大约在2.0×105copies/mL)和2例阴性咽拭子样本作为阴性对照组，以上阳性对照组和阴性对照组均按照实施例2中的PCR扩增反应进行扩增，按照实施例3中的PCR-HRM分析方法对上述PCR的扩增产物进行分析。
(2)实验结果
根据不同样品的熔解峰Tm的值来确定PCR-HRM的检测结果，从表7中可以看出，在样本S1～S28中，均在Cy5通道中存在人源内标基因，表示样本S1～S28中均提取到了DNA，不需要重新进行核酸提取。在样本S1～S14中，分别在PCR反应体系1中的FAM通道中检测到了gordonae和abscessus，在PCR反应体系1中的HEX通道中检测到了avium和arisiense，PCR反应体系1中的TAMRA通道中检测到了fortuitum和haemophilum，PCR反应体系1中的Cy5通道中检测到了intercelleulare和人源内标基因，在PCR反应体系2中的FAM通道中检测到了kansasii和malmoense，在PCR反应体系2中的HEX通道中检测到了scrofulaceum和szulgai，在PCR反应体系2中的TAMRA通道中检测到了xenopi和simiae，在PCR反应体系2中的Cy5通道中检测到了chelonae和人源内标基因，在PCR反应体系1和PCR反应体系2中均未检测到S15和S28的样品中的阴性对照样品，检测到的均是人源内标基因，表明，本发明实施例中的PCR-HRM检测方法对于14种非结核基团的细菌和人源内表基因的检测结果均为阳性，对阴性对照组的检测结果均为阴性。表明，本发明实施例中的引物组和探针组检测靶标的准确率达100％，本发明实施例中的PCR-HRM检测试剂盒具有较好的特异性。
表7 样本S1～S28中的PCR-HRM检测结果
Figure BDA0003458467310000141
Figure BDA0003458467310000151
Figure BDA0003458467310000161
2、灵敏度检测：
为了检测本发明实施例中的PCR-HRM检测试剂盒的灵敏度，进行了以下实验：
(1)实验方案
采用实施例3中的标准阳性样品的核酸提取方法分别提取鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)以及次要菌种有堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、戈尔登分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)、蟾蜍分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、猿猴分枝杆菌(Mycobacteriumsimiae)、苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、玛尔摩分枝杆菌(Mycobacteriummalmoense)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintercelleulare)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)和亚洲分枝杆菌(Mycobacterium arisiense)培养物(浓度大约在2.0×105copies/mL)核酸中的DNA。
然后用1％DEPC水分别进行倍比稀释，稀释后的浓度分别是1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL、500copies/mL、200copies/mL、100copies/mL、50copies/mL和10copies/mL；按照实施例2中的PCR反应体系进行扩增，按照实施例3中的PCR-HRM分析方法对PCR的扩增产物进行分析。
实施方法：每份样品测定20次，统计每个通道(FAM、HEX、TAMRA、CY5)中是否有特征熔解峰。
(2)实验结果
本发明实施例中的PCR-HRM检测方法对各个菌株的检测限如表9所示：
表8 多重荧光定量PCR-HRM检测试剂盒对各个菌株的检测限分析
Figure BDA0003458467310000162
Figure BDA0003458467310000171
从表8可以看出，本发明实施例中的PCR-HRM检测方法对gordonae的检测限为100copies/mL，对abscessus的检测限为50copies/mL，对avium的检测限为100copies/mL，对arisiense的检测限为50copies/mL，对fortuitum的检测限为100copies/mL，对haemophilum的检测限为50copies/mL，对intercelleulare的检测限为100copies/mL，对kansasii的检测限为100copies/mL，对malmoense的检测限为100copies/mL，对scrofulaceum的检测限为50copies/mL，对szulgai的检测限为100copies/mL，对xenopi的检测限为100copies/mL，对simiae的检测限为50copies/mL，对chelonae的检测限为100copies/mL，比目前一般临床要求的1000copies/mL敏感10-20倍。
3、精密度测试
(1)实验方案
样本设置：采用实施例2中的标准阳性样品的核酸提取方法提取鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)和胞内分枝杆菌(Mycobacterium intercelleulare)以及一例阴性样本的核酸中的DNA。鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)和胞内分枝杆菌(Mycobacterium intercelleulare)各设置3个浓度(1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL和500copies/mL)。
PCR扩增试剂为3个批次配置的PCR反应体系。
实施方法：每个样本分别用每个批次的PCR反应体系检测20次。
(2)实验结果
本发明实施例中的PCR-HRM检测试剂盒的精密度测试结果如表9所示：
表9 PCR-HRM检测试剂盒的精密度测试
Figure BDA0003458467310000181
从表9中可以看出，使用不同批号的PCR扩增试剂得到的检测结果是一致的，表明，本发明实施例中的PCR-HRM检测试剂盒检测重复性参考品时检测结果均一致，CV≤5.0％。
4、干扰物验证
(1)实验方案
样本设置：为验证样本中可能存在的内源性物质对检测结果的影响，将咽拭子样本(1例avium阳性样本，1例intercelleulare阳性样本和1例阴性样本)均等分为四份，分别为加入内源性干扰物人全血一例、加入粘蛋白一例、加入血红素一例和不加任何物质一例进行核酸提取后检测。
实施方法：样本和干扰物充分混合后，静止1小时，采用实施例3中的标准阳性样品的核酸提取方法对核酸进行提取；按照实施例2中的PCR扩增反应进行扩增，分别用每个批次的PCR反应体系进行扩增；按照实施例3中的PCR-HRM分析方法对PCR的扩增产物进行分析。评价实验结果是否正确，以及平行结果的CV(CV≤5％，结果可靠)。
(2)实验结果
内源性物质干扰实验的具体实验结果参见表10；
表10 内源性物质干扰实验检测结果
Figure BDA0003458467310000182
Figure BDA0003458467310000191
实验结果表明，咽拭子中可能存在的内源性干扰物内源性干扰物人全血、粘蛋白和血红素加入样本，检测结果均正确，没有出现抑制现象，表明本实施例中的PCR-HRM试剂盒具有较好的抗干扰物的能力。
实施例是对技术方案内容的细化和解释，或是最优化的技术方案，即给一个或几个具体的实施方案。实施例应尽量详细和具体，能按此再现发明技术，如原料的产地、名称、型号、操作程序、组成、配方、用途、效果、参数、条件、手段等都应尽可能的说明清楚。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州蔚捷生物医药科技有限公司
<120> 一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用
<130>
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaagaccga cgacgtbgc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
rtctsggtga ycttytcsac 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaccgtgct ggcgcagg 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcttgccca ggccctggtc aag 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cacggtgctc gcccaggcgt tgg 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgacggcga cggtgctggc c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttctggcaca ggccctggtt 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacgacggcg acggtgctg 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctggctcagg cgttggtcc 19
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tagggagtat ataggttggg gaagtt 26
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aacacacaat aacaaacaca aattcac 27
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
actgcgtgtg gggtggtgat ggagga 26
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctcgcgcagg cgttggtcaa aga 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctggcgcagg cgctggtcaa 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccacggtgct ggcccaggc 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ctcgcccagg cgctggtgcg 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acggcgaccg tgctggcgc 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctcgctcagg cgctcgtcaa 20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgctggccca ggcgctggtc aagg 24

Claims (10)

1.一种检测非结核分枝杆菌的荧光定量PCR-HRM引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：
NMT引物对：
NMT-F：5'-AGAAGACCGACGACGTBGC-3'；
NMT-R：5'-RTCTSGGTGAYCTTYTCSAC-3'。
2.一种检测非结核分枝杆菌的荧光定量PCR-HRM探针组，其特征在于，所述探针组的核苷酸序列为：
戈尔登分枝杆菌：gordonae-P2探针：5'-CCACCGTGCTGGCGCAGG-3'；
脓肿分枝杆菌：abscessus-P2探针：5'-TTCTTGCCCAGGCCCTGGTCAAG-3'；
鸟分枝杆菌复合群：avium-HSP-P1探针：5'-CACGGTGCTCGCCCAGGCGTTGG-3'；
亚洲分枝杆菌：arisiense-HSP-P1探针：5'-ACGACGGCGACGGTGCTGGCC-3'；
偶发分枝杆菌：fortuitum-HSP-P2探针：5'-TTCTGGCACAGGCCCTGGTT-3'；
嗜血分枝杆菌：haemophilum-HSP-P2探针：5'-CACGACGGCGACGGTGCTG-3'；
胞内分枝杆菌：intercelleulare-HSP-P2探针：5'-CTGGCTCAGGCGTTGGTCC-3'；
堪萨斯分枝杆菌：kansasii-HSP-P2探针：5'-CTCGCGCAGGCGTTGGTCAAAGA-3'；
玛尔摩分枝杆菌：malmoense-HSP-P2探针：5'-CTGGCGCAGGCGCTGGTCAA-3'；
瘰疬分枝杆菌：scrofulaceum-HSP-P3探针：5'-CCACGGTGCTGGCCCAGGC-3'；
苏尔加分枝杆菌：szulgai-HSP-P1探针：5'-CTCGCCCAGGCGCTGGTGCG-3'；
蟾蜍分枝杆菌：xenopi-HSP-P2探针：5'-ACGGCGACCGTGCTGGCGC-3'；
猿猴分枝杆菌：simiae-HSP-P1探针：5'-CTCGCTCAGGCGCTCGTCAA-3'；
龟分枝杆菌：chelonae-HSP-P1探针：5'-TGCTGGCCCAGGCGCTGGTCAAGG-3'；
人源内标基因-P3探针：5'-ACTGCGTGTGGGGTGGTGATGGAGGA-3'。
3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团，各探针序列标记的荧光基团和淬灭基团不相同；其中，gordonae、abscessus、kansasii和malmoense探针序列标记的荧光基团都为FAM，avium、arisiense、scrofulaceum和szulgai探针序列标记的荧光基团为HEX，fortuitum、haemophilum、xenopi和simiae探针序列标记的荧光基团为TAMRA，intercelleulare、chelonae和人源内标基因探针标记的荧光基团为CY5；gordonae、abscessus、kansasii、malmoenseavium、arisiense和scrofulaceum的淬灭基团是BHQ1，szulgai和fortuitum的淬灭基团是BHQ2，haemophilum、xenopi、simiaeintercelleulare、chelonae和人源内标基因探针的淬灭基团是BHQ3。
4.一种非结核分枝杆菌的荧光定量PCR-HRM检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有权利要求1所述的引物组和/或权利要求2或3所述的探针组。
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR-HRM检测试剂盒，其特征在于，所述PCR-HRM检测试剂盒中还包括脱氧核糖核苷三磷酸、Buffer混合液、阳性对照、阴性对照和DNA聚合酶中的一种或几种。
6.权利要求1中所述的引物组和/或权利要求2或3中所述的探针组在制备荧光定量PCR-HRM检测试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR-HRM检测试剂盒的使用具体包括以下步骤：
(1)提取待测样品中的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，使用权利要求4或5所述的荧光定量PCR-HRM检测试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)结果判定：对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据扩增产物实际熔解曲线的Tm值与非结核分枝杆菌的标准熔解曲线Tm值对比，判定待测样品中是否具有相应的非结核分枝杆菌；其中所述非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌，次要菌种包括堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和亚洲分枝杆菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增的反应体系包括PCR反应体系1和PCR反应体系2：
PCR反应体系1为：
Figure FDA0003458467300000021
PCR反应体系2为：
Figure FDA0003458467300000022
Figure FDA0003458467300000031
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的程序为：90～97℃，5～15min；90～97℃，10～20s，50～70℃，50～70s；45个循环；步骤(3)中所述高分辨率熔解曲线分析条件为：90～97℃，1～3min；30～50℃，2～6min；40～80℃，以0.1℃/步的速率采集荧光信号并进行分析，采集荧光信号的通道为FAM、HEX、TAMRA和CY5。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(3)中的结果判定方法为：
PCR反应体系1的结果判定方法：
(1)若FAM通道检测到Tm(55.0±3℃)特征峰，表示gordonae检测结果为阳性；
(2)若FAM通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示abscessus检测结果为阳性；
(3)若HEX通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示avium检测结果为阳性；
(4)若HEX通道检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，表示arisiense检测结果为阳性；
(5)若TAMRA通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示fortuitum检测结果为阳性；
(6)若TAMRA通道检测到Tm(60.0±3℃)特征峰，表示haemophilum检测结果为阳性；
(7)若Cy5通道检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，表示intercelleulare检测结果为阳性；
(8)若Cy5通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示人源内标基因检测结果为阳性；
PCR反应体系2的结果判定：
(1)若FAM通道检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，表示kansasii检测结果为阳性；
(2)若FAM通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示malmoense检测结果为阳性；
(3)若HEX通道检测到Tm(62.0±3℃)特征峰，表示scrofulaceum检测结果为阳性；
(4)若HEX通道检测到Tm(46.0±3℃)特征峰，表示szulgai检测结果为阳性；
(5)若TAMRA通道检测到Tm(65.0±3℃)特征峰，表示xenopi检测结果为阳性；
(6)若TAMRA通道检测到Tm(51.0±3℃)特征峰，表示simiae检测结果为阳性；
(7)若Cy5通道检测到Tm(47.0±3℃)特征峰，表示chelonae检测结果为阳性；
(8)若Cy5通道检测到Tm(64.0±3℃)特征峰，表示人源内标基因检测结果为阳性。
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Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Guangzhou Liwan branch

Pledgor: Guangzhou Weijie Biomedical Technology Co.,Ltd.

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