TWI740427B - 檢測非結核分枝桿菌的方法及其套組 - Google Patents
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Abstract
一種檢測非結核分枝桿菌的方法，包含下列步驟：提供樣本；提供引子對，引子對係選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、與SEQ ID NO：1具約70%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO：2具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO：1之互補股以及SEQ ID NO：2之互補股所組成的群組；利用引子對與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物；以及分析產物以偵測非結核分枝桿菌的存在。另提供一種檢測非結核分枝桿菌的套組，包含前述所提之引子對。
Description
本揭露係關於一種檢測方法，特別是一種檢測非結核分枝桿菌的方法、引子組及其套組。
分枝桿菌可分為結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和非結核分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacterium,NTM)。非結核分枝桿菌是指除了結核分枝桿菌以及痲瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)以外的分枝桿菌。
由於肺部感染非結核分枝桿菌之病徵與結核病相似，經常被誤診為結核病。由於傳統菌種鑑定與藥敏試驗的檢驗方法過程繁瑣且費時，易延誤病人的治療，因此，非結核分枝桿菌與結核分枝桿菌群的鑑別檢驗，對於早期診斷、早期治療和控制感染風險都有其重要的意義。有鑒於此，目前極需一種檢測方法能夠於臨床上早期檢測出是否受到結核分枝桿菌群之病原的感染，其對於疾病治癒率的提升非常重要。
本揭露之一實施方式為提供一種檢測非結核分枝桿菌的方法，包含下列步驟：提供樣本；提供引子對，引子對係選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約70%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組；利用引子對與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物；以及分析產物以偵測非結核分枝桿菌的存在。
在一實施方式中，提供樣本步驟，包含提供檢體包含非結核分枝桿菌。
在一實施方式中，檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便的其中之一或其組合。
在一實施方式中，利用引子對與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物步驟，包含進行聚合酶連鎖反應使得引子對增幅非結核分枝桿菌中16S核糖體核糖核酸(16S ribosomal ribonucleic acid，16S rRNA)基因序列的一部分序列以獲得產物，其中部分序列為SEQ ID NO:5。
在一實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的方法更包含提供至少一探針，探針係選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:3之互補股、SEQ ID NO:4、與SEQ ID NO:4具約70%至約99%相似度的序列、及SEQ ID NO:4之互補股所組成之群組；利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物。
在一實施方式中，利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物步驟，聚合酶連鎖反應為即時定量聚合酶連鎖反應。
本揭露之另一實施方式為提供一種檢測非結核分枝桿菌的套組，包含引子對，引子對係選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約70%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組。
在一實施方式中，引子對為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。
在一實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的套組更包含檢體，其中檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便的其中之一或其組合。
在一實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的套組更包含目標基因，其中目標基因為非結核分枝桿菌的16S核糖體RNA序列。
在一實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的套組更包含模板，具有約100個鹼基對至約250個鹼基對的長度。
在一實施方式中，模板為SEQ ID NO:5。
在一實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的套組更包含至少一探針係選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:3之互補股、SEQ ID NO:4、與SEQ ID NO:4具約70%至約99%相似度的序列、及SEQ ID NO:4之互補股所組成之群組。
本揭露之另一實施方式為提供一種引子組，包含:正向引子，係選自於由SEQ ID NO:1、與SEQ ID NO:1具約70%至約99%相似度的序列、以及SEQ ID NO:1之互補股所組成的群組；以及反向引子，係選自於由SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:2具約70%至約99%相似度的序列、以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組。
為使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述，但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。在以下描述中，將詳細敘述許多特定細節，以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而，亦可在無此等特定細節之情況下實踐本發明之實施例。
於本文中，除非內文中對於冠詞有所特別限定，否則『一』與『該』可泛指單一個或多個。將進一步理解的是，本文中所使用之『包含』、『包括』、『具有』及相似詞彙，指明其所記載的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件與/或組件，但不排除其它的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件，與/或其中之群組。
本揭露之實施方式提供一種檢測非結核分枝桿菌的方法，包含下列步驟:提供樣本及提供引子對。引子對選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約70%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組。接著，利用前述引子對與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物。最後，分析產物以偵測非結核分枝桿菌的存在。
樣本可包含各種不同來源的檢體，例如血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便的其中之一或其組合。在一些實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的方法中所提供的檢體包含非結核分枝桿菌。在一實施方式中，所述非結核分枝桿菌包括，但不限於
M. avium、
M. intracellulare、
M. chelonae、
M. gordonae、
M. abscessus、
M. fortuitum、
M. terrae、
M. scrofulaceum、或
M. kansasii 。
引子對的選擇如前文所述，並不限於本文所揭露的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。引子對在選擇上除了可包含SEQ ID NO:1的互補股及SEQ ID NO:2的互補股之外，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示的序列亦可容許某種程度的變異。也就是說，與SEQ ID NO:1具約70%至約99%相似度的序列以及與SEQ ID NO:2具約70%至約99%相似度的序列應用於本實施方式中亦有相同的功效。舉例而言，引子對的選擇可包含SEQ ID NO:1之簡併序列及SEQ ID NO:2之簡併序列。此處所述之「簡併序列」係指本文所揭露的寡核苷酸序列中部分核苷酸為其他核苷酸所取代。換言之，SEQ ID NO:1之簡併序列意味著在SEQ ID NO:1序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。而SEQ ID NO:2之簡併序列意味著在SEQ ID NO:2序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。在另一些實施例中，引子對的選擇亦可包含SEQ ID NO:1之衍生序列及SEQ ID NO:2之衍生序列。此處所述「衍生序列」係指本文所揭露的寡核苷酸序列中在3’端或5’端可進行修飾，並且仍保留部分或全部序列。換言之，SEQ ID NO:1之衍生序列意味著在SEQ ID NO:1序列長度可進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。而SEQ ID NO:2之衍生序列意味著在SEQ ID NO:2序列長度可進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。在另一些實施方式中，引子對選自與SEQ ID NO:1具約80%至約99%相似度的序列(例如約85%、約90%、或約95%)以及與SEQ ID NO:2具約80%至約99%相似度的序列(例如約85%、約90%、或約95%)所組成的群組。
在一些實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的方法更包括提供至少一探針，探針係選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:3之互補股、SEQ ID NO:4、與SEQ ID NO:4具約70%至約99%相似度的序列、及SEQ ID NO:4之互補股所組成之群組。於檢測時，探針可僅使用一條序列、或是一條以上的序列(例如兩條、三條、四條等)，都能具有相似的檢測效果。
探針的選擇如前文所述，並不限於本文所揭露的SEQ ID NOs:3、4。探針在選擇上除了可包含SEQ ID NOs:3、4的互補股之外，SEQ ID NOs:3、4所示的序列亦可容許某種程度的變異。也就是說，與SEQ ID NOs:3、4具約70%至約99%相似度的序列應用於本實施方式中亦有相同的功效。舉例而言，探針的選擇可包含SEQ ID NO:3之簡併序列。SEQ ID NO:3之簡併序列意味著在SEQ ID NO:3序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。舉例而言，探針的選擇可包含SEQ ID NO:4之簡併序列。SEQ ID NO:4之簡併序列意味著在SEQ ID NO:4序列長度不變的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。在另一些實施例中，探針的選擇亦可包含SEQ ID NOs:3、4之衍生序列。舉例而言，SEQ ID NO:3之衍生序列意味著在SEQ ID NO:3序列長度在3’端或5’端進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。舉例而言，SEQ ID NO:4之衍生序列意味著在SEQ ID NO:4序列長度在3’端或5’端進行增減的情形下，可容許其寡核苷酸具有約1%至約30%的變異程度。在另一些實施方式中，探針選自與SEQ ID NO:3具約80%至約99%相似度的序列(例如約85%、約90%、或約95%)。
在一實施方式中，利用引子對、探針與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物，包含進行聚合酶連鎖反應使得引子對增幅非結核分枝桿菌群中16s核糖體RNA基因序列的部分序列以獲得產物，其中此部分序列為SEQ ID NO:5 (
M. avium)。聚合酶連鎖反應為一種分子生物學技術。利用具有寡核苷酸序列之引子對擴增特定的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段。應理解的是，本文所揭露的序列可用於各種以聚合酶連鎖反應為基礎的技術。在一實施例中，聚合酶連鎖反應可包含但不限於即時定量聚合酶連鎖反應(real-time PCR)。在一實施例中，若採用的即時聚合酶連鎖反應為探針型的螢光系統，利用引子對與樣本進行聚合酶連鎖反應以獲得產物之前，更包含使用探針對樣本進行雜合反應(hybridization)，使得探針黏合到目標序列上。亦即，引子對、探針與樣本一同進行一聚合酶連鎖反應以獲得一產物。
本揭露之實施方式亦提供一種檢測非結核分枝桿菌的套組(kit)，包含一引子對。上述引子對選自於由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:1具約70%至約99%相似度的序列、與SEQ ID NO:2具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:1之互補股以及SEQ ID NO:2之互補股所組成的群組。在一些實施方式中，引子對為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。在一些實施方式中，引子對為與SEQ ID NO:1具約70%至約99%相似度的序列及與SEQ ID NO:2具約70%至約99%相似度的序列。在一些實施方式中，引子對為SEQ ID NO:1之互補股及SEQ ID NO:2之互補股。
在某些實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的套組可進一步包含檢體。檢體的來源可為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便的其中之一或其組合。舉例來說，此檢測非結核分枝桿菌的套組可應用於各醫療單位，藉由採集個體(例如：人)的體液或排泄物進行檢測。
在一些實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的套組可進一步包含一目標基因，並且此目標基因係指非結核分枝桿菌的16s核糖體RNA基因序列。再者，尚有一些實施方式，檢測非結核分枝桿菌的套組可進一步包含模板，具有約100個鹼基對至約250個鹼基對的長度。舉例來說，此模板可為16s核糖體RNA序列中的部分序列，例如SEQ ID NO:5所示的序列，具有140個鹼基對的長度。但在另一些實施方式中，模板不包含SEQ ID NO:5所示的序列，且為具有約100個鹼基對至約250個鹼基對之長度的人工合成序列，其亦可與本實施方式中的引子對黏合從而被增幅。在一些實施方式中，可直接將SEQ ID NO:5所示的序列構築至不同載體中，並且，以此帶有SEQ ID NO:5的載體作為模板進行擴增時，專一性高且檢測效能極佳。
在一些實施方式中，檢測非結核分枝桿菌的套組可進一步包含至少一探針，探針選自於由SEQ ID NO:3、與SEQ ID NO:3具約70%至約99%相似度的序列、SEQ ID NO:3之互補股、SEQ ID NO:4、與SEQ ID NO:4具約70%至約99%相似度的序列、及SEQ ID NO:4之互補股所組成之群組。在一些實施方式中，探針為SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其組合。
為進一步證實本發明之各種實施方式可用於檢測分枝桿菌的存在，遂進行以下試驗。應注意的是，下述實施例僅提供作為示範目的，而非限制本發明。
引子及探針設計
非結核分枝桿菌群其16s核糖體RNA基因序列具高度保留性。故本試驗利用線上設計程式如primer 3及GenScript Real-time PCR Primer Design針對9種非結核分枝桿菌(
M. avium、
M. intracellulare、
M. chelonae、
M. gordonae、
M. abscessus、
M. fortuitum、
M. terrae、
M. scrofulaceum、或
M. kansasii)與1種結核分枝桿菌(
M. tuberculosis)的16s核糖體RNA序列進行引子及探針的設計。
根據基因銀行(GenBank)資料庫提供的資訊，第1圖繪示16s核糖體RNA基因序列的部分正股序列。本試驗中引子對為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列係針對第151-174個鹼基對的位置進行設計(如右箭號實心方框所示)。SEQ ID NO:2所示之核苷酸序列係針對第271-290個鹼基對的位置進行設計(如左箭號實心方框所示)。而探針為SEQ ID NOs:3、4。SEQ ID NO:3所示之核苷酸序列係針對位於第181-194個鹼基對之間的片段進行設計(如右箭號虛線方框所示)。SEQ ID NO:4所示之核苷酸序列係針對位於第211-223個鹼基對之間的片段進行設計(如左箭號虛線方框所示)。據此，利用引子對SEQ ID NOs:1、2可增幅的產物具有140鹼基對的長度。
具體而言，正向引子SEQ ID NO:1的第5-11、13及15個核苷酸分別為BYBDSDRKS，其中B代表該核苷酸可選自g、c或t(即，非a，且合成比例各約占33%)，Y代表該核苷酸可選自c或t(合成比例各約占50%)，D代表該核苷酸可選自a、g或t(即，非c，且合成比例各約占33%)，S代表該核苷酸可選自g或c(合成比例各約占50%)，R代表g或a(合成比例各約占50%)，K代表g或t(合成比例各約占50%)。在製備正向引子SEQ ID NO:1時，以上各種核苷酸組合都混和在內。
引子對之靈敏度分析
根據前述GenBank資料所示的16s核糖體RNA基因序列，將9種非結核分枝桿菌(
M. avium、
M. intracellulare、
M. chelonae、
M. gordonae、
M. abscessus、
M. fortuitum、
M. terrae、
M. scrofulaceum、及
M. kansasii)分別選殖於pJET1.2/blunt載體(Protech CO., Ltd, GenBank: Y14837.1)，以獲得9種帶有16s核糖體RNA基因序列的標準質體(以下簡稱為16s rRNA標準質體)。
製備反應混合液，包含模板(16s rRNA標準質體)、聚合酶連鎖反應試劑(QuantiNova probe master mix)、濃度為200nM的正向引子(SEQ ID NO：1)、及濃度為300nM的反向引子(SEQ ID NO：2)。聚合酶連鎖反應條件為95℃ 2分鐘，95℃變性(denature)5秒，60℃黏合/擴增(annealing/amplification)5秒，進行45個循環反應。
請參閱第2圖，係根據本揭露一些實施方式，以引子對SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2進行聚合酶連鎖反應檢測結核分枝桿菌群與非結核分枝桿菌的臨床檢體。由左至右分別為第2-6欄為結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)，第7-15、17-19欄為非結核分枝桿菌(M.avium、M.gordonae、M.intracellulare、M.kansasii、M.scrofulaceum、M.terrae、M.abscessus、M.chelonae、M.chelonae、M.fortuitum、M.fortuitum、及M.fortuitum)，第1、16及21欄為分子量標示欄(marker ladder)，第20欄為無模板控制組(no template control，NTC)。電泳結果圖顯示，僅非結核分枝桿菌有專一的一條擴增產物(140bp)，結核分枝桿菌群則沒有擴增產物產生。因此，引子對SEQ ID NOs：1、2可精準區分非結核分枝桿菌與結核分枝桿菌群。
引子對與探針之靈敏度分析
依據市售即時定量聚合酶連鎖反應套組(QuantiNova Probe PCR Kit, Qiagen)操作說明書，反應混合液包含模板(16s rRNA標準質體)、11 μL的即時定量聚合酶連鎖反應試劑(QuantiNova probe master mix)、濃度為200 nM的正向引子(SEQ ID NO:1)、濃度為300 nM的反向引子(SEQ ID NO:2)、濃度為200 nM的探針1-1 (SEQ ID NO:3)、以及濃度為200 nM的探針1-2 (SEQ ID NO:4)，配置成總體積為25 μL的反應混合液。即時定量聚合酶連鎖反應條件為95°C變性5秒，60°C黏合/擴增5秒，並將反應混合液於即時定量聚合酶連鎖反應器(CFX-96, BioRad)進行45個循環反應。
應說明的是，在此試驗中是以不同的模板量進行即時定量聚合酶連鎖反應，以測試引子對SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的靈敏度。依前述反應混合液的配方，製備7組不同模板量的反應混合液，分別帶有10、10
2、10
3、10
4、10
5、10
6及10
7拷貝數(copy number)的16s rRNA標準質體。參照第3圖(為
M. avium的16s rRNA標準質體)，其分別為即時定量聚合酶連鎖反應後所得之增幅曲線圖及標準曲線圖。如第3圖所示，橫軸為反應循環數(cycles)，縱軸為螢光強度(ΔRn)。由此增幅曲線圖可知，10至10
7拷貝數的螢光值皆呈現上升的正趨勢。依據不同拷貝數所得之閾值循環(Ct)值，可以驗證本揭露所設計的引子對與探針組在非結核分枝桿菌的檢測範圍。請參閱第4至12圖，係根據本揭露一些實施方式測試9種非結核分枝桿菌在不同模板量(10~10
7拷貝數)的情形下進行即時定量聚合酶連鎖反應獲得的R
2數值。各組的R
2值皆大於0.94，代表此迴歸模式精準度高。此外，請參閱以下表1-9，9種非結核分枝桿菌偵測5-80個拷貝數時，之最低檢測極限可至每反應5個拷貝數不等，且6次的檢測中6次都有檢測出，偵測率皆為100%。
表1、
M. avium
表2、
M. intracellulare
表3、
M. chelonae
表4、
M. gordonae
表5、
M. abscessus
表6、
M. fortuitum
表7、
M. terrae
表8、
M. scrofulaceum
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 38.9 | 6/6 |
| 40 | 40.3 | 6/6 |
| 20 | 40.6 | 6/6 |
| 10 | 40.5 | 6/6 |
| 5 | 42.7 | 6/6 |
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 34.2 | 6/6 |
| 40 | 36.4 | 6/6 |
| 20 | 38.3 | 6/6 |
| 10 | 39.5 | 6/6 |
| 5 | 40.5 | 6/6 |
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 36.5 | 6/6 |
| 40 | 37.8 | 6/6 |
| 20 | 38.2 | 6/6 |
| 10 | 38.1 | 6/6 |
| 5 | 38.6 | 6/6 |
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 34.0 | 6/6 |
| 40 | 34.6 | 6/6 |
| 20 | 34.8 | 6/6 |
| 10 | 34.9 | 6/6 |
| 5 | 35.0 | 6/6 |
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 39.9 | 6/6 |
| 40 | 41.7 | 6/6 |
| 20 | 41.4 | 6/6 |
| 10 | 41.6 | 6/6 |
| 5 | 42.8 | 6/6 |
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 34.4 | 6/6 |
| 40 | 36.4 | 6/6 |
| 20 | 37.8 | 6/6 |
| 10 | 38.4 | 6/6 |
| 5 | 40.7 | 6/6 |
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 37.1 | 6/6 |
| 40 | 37.3 | 6/6 |
| 20 | 37.2 | 6/6 |
| 10 | 37.6 | 6/6 |
| 5 | 37.6 | 6/6 |
| 拷貝數 | 閾值循環(Ct) | 偵測率 |
| 80 | 33.8 | 6/6 |
| 40 | 34.1 | 6/6 |
| 20 | 34.3 | 6/6 |
| 10 | 34.5 | 6/6 |
| 5 | 34.7 | 6/6 |
臨床測試
以本揭露引子對(SEQ ID NOs：1-2)及探針組(SEQ ID NOs：3-4)檢測臨床檢體(如下表10)，搭配使用ABI Step One擴增儀檢測82例臨床樣本。
結果請參閱第13圖所示，在82例臨床樣本的情形下進行即時定量聚合酶連鎖反應之增幅曲線圖中，確實可準確鑑別結核分枝桿菌群(TB)與非結核分枝桿菌(NTM)，並於結核分枝桿菌群檢體中無擴增反應。
前文概述數個實施例之特徵以使得熟習該項技術者可更好地理解本揭露之態樣。熟習該項技術者應瞭解，可容易地將本揭露內容用作設計或修改用於實現相同目的及/或達成本文引入之實施例的相同優點之其他製程及結構之基礎。熟習該項技術者亦應認識到，此類等效物構造不違背本揭露內容之精神及範疇，且可在不違背本揭露內容之精神及範疇之情況下於此作出各種變化、替代以及變更。
無
請結合附圖閱讀以下詳細描述，將可更容易理解本揭露內容之態樣。但須注意依照本產業的標準做法，各種特徵未按照比例繪製。事實上，各種特徵的尺寸為了清楚的討論而可被任意放大或縮小。
第1圖係根據本揭露一些實施方式，顯示16S rRNA基因序列的部分片段、引子對及探針設計的位置。
第2圖係根據本揭露一些實施方式，以引子對SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2進行檢測之電泳結果圖。
第3圖係根據本揭露一些實施方式，測試在不同模板量的情形下進行即時定量聚合酶連鎖反應之增幅曲線圖。
第4至12圖係根據本揭露一些實施方式測試9種非結核分枝桿菌在不同模板量的情形下進行即時定量聚合酶連鎖反應獲得的R
2數值。
第13圖係根據本揭露一些實施方式，測試在82例臨床樣本的情形下進行即時定量聚合酶連鎖反應之增幅曲線圖。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
無
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
<110> 台達電子工業股份有限公司國立成功大學
<120> 檢測非結核分枝桿菌的方法及其套組
<130> NP-26367-TW
<140> 109110117
<141> 2020-03-26
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引子(Forward primer)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引子(Reverse primer)
<400> 2
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探針1-1(Probe 1-1)
<400> 3
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探針1-2(Probe 1-2)
<400> 4
<210> 5
<211> 140
<212> DNA
<213> 鳥型分枝桿菌(Mycobacterium avium)
<400> 5
Claims (11)
- 一種檢測非結核分枝桿菌的方法，包含下列步驟：提供一樣本；提供一引子對，該引子對係選自於由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所組成的群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NOs：1-2所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NOs：1-2具有90%以上同源性之核苷酸序列；提供兩探針，該些探針係選自於由SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4所組成之群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NOs：3-4所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NOs：3-4具有90%以上同源性之核苷酸序列；利用該引子對、該些探針與該樣本進行一聚合酶連鎖反應以獲得一產物；以及分析該產物以偵測非結核分枝桿菌的存在。
- 如請求項1所述之檢測非結核分枝桿菌的方法，其中提供該樣本步驟，包含提供一檢體包含非結核分枝桿菌。
- 如請求項2所述之檢測非結核分枝桿菌的方法，其中該檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便的其中之一或其組合。
- 如請求項2所述之檢測非結核分枝桿菌的方法，其中利用該引子對與該樣本進行該聚合酶連鎖反應以獲得該產物步驟，包含進行聚合酶連鎖反應使得該引子對增幅該非結核分枝桿菌中16S核糖體RNA基因序列的一部分序列以獲得該產物，其中該部分序列為SEQ ID NO：5。
- 如請求項1所述之檢測非結核分枝桿菌的方法，其中利用該引子對、該探針與該樣本進行該聚合酶連鎖反應以獲得該產物步驟，該聚合酶連鎖反應為即時定量聚合酶連鎖反應。
- 一種檢測非結核分枝桿菌的套組，包含：一引子對，該引子對係選自於由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所組成的群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NOs：1-2所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NOs：1-2具有90%以上同源性之核苷酸序列；以及兩探針，該些探針係選自於由SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4所組成之群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列或其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NOs：3-4所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NOs：3-4具有90%以上同源性之核苷酸序列。
- 如請求項6所述之檢測非結核分枝桿菌的套組，其中該引子對為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。
- 如請求項6所述之檢測非結核分枝桿菌的套組，更包含一檢體，其中該檢體為血液、痰液、支氣管肺泡沖洗液、尿液、糞便的其中之一或其組合。
- 如請求項6所述之檢測非結核分枝桿菌的套組，更包含一目標基因，其中該目標基因為非結核分枝桿菌的16S核糖體RNA序列。
- 如請求項6所述之檢測非結核分枝桿菌的套組，更包含一模板，具有約100個鹼基對至約250個鹼基對的長度。
- 如請求項10所述之檢測非結核分枝桿菌的套組，其中該模板為SEQ ID NO：5。
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| TW109110117A TWI740427B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 檢測非結核分枝桿菌的方法及其套組 |
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|---|---|---|---|
| TW109110117A TWI740427B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 檢測非結核分枝桿菌的方法及其套組 |
Publications (2)
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ID=78778206
Family Applications (1)
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| TW109110117A TWI740427B (zh) | 2020-03-26 | 2020-03-26 | 檢測非結核分枝桿菌的方法及其套組 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| TW201002825A (en) * | 2008-04-16 | 2010-01-16 | Asiagen Corp | Novel method and kit for diagnosis of mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium |
| TW201400621A (zh) * | 2012-06-22 | 2014-01-01 | Taichung Veterans General Hospital Vacrs | 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法 |
-
2020
- 2020-03-26 TW TW109110117A patent/TWI740427B/zh active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201002825A (en) * | 2008-04-16 | 2010-01-16 | Asiagen Corp | Novel method and kit for diagnosis of mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterium |
| TW201400621A (zh) * | 2012-06-22 | 2014-01-01 | Taichung Veterans General Hospital Vacrs | 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法 |
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|---|---|
| TW202136519A (zh) | 2021-10-01 |
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