CN113444782A - 检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种检测非结核分枝杆菌的方法，包含下列步骤：提供样本；提供引物对，引物对系选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:1之互补链以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组；利用引物对与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物；以及分析产物以侦测非结核分枝杆菌的存在。另提供一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒，包含前述所提之引物对。
Description
【技术领域】
本公开系关于一种检测方法，特别是一种检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒。
【现有技术】
分枝杆菌可分为结核分枝杆菌群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和非结核分枝杆菌 (Non-tuberculous mycobacterium,NTM)。非结核分枝杆菌是指除了结核分枝杆菌以及痲疯分枝杆菌 (Mycobacterium leprae)以外的分枝杆菌。
由于肺部感染非结核分枝杆菌之病征与结核病相似，经常被误诊为结核病。由于传统菌种鉴定与药敏试验的检验方法过程繁琐且费时，易延误病人的治疗，因此，非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌群的鉴别检验，对于早期诊断、早期治疗和控制感染风险都有其重要的意义。有鉴于此，目前极需一种检测方法能够于临床上早期检测出是否受到结核分枝杆菌群之病原的感染，其对于疾病治愈率的提升非常重要。
【发明内容】
本公开之一实施方式为提供一种检测非结核分枝杆菌的方法，包含下列步骤：提供样本；提供引物对，引物对系选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、与SEQ ID NO:2 具约70％至约99％同源性的序列、SEQ IDNO:1之互补链以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组；利用引物对与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物；以及分析产物以侦测非结核分枝杆菌的存在。
在一实施方式中，提供样本步骤，包含提供检体包含非结核分枝杆菌。
在一实施方式中，检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便的其中之一或其组合。
在一实施方式中，利用引物对与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物步骤，包含进行聚合酶连锁反应使得引物对增幅非结核分枝杆菌中16S核糖体核糖核酸(16Sribosomal ribonucleic acid，16S rRNA)基因序列的一部分序列以获得产物，其中部分序列为SEQ ID NO:5。
在一实施方式中，检测非结核分枝杆菌的方法更包含提供至少一探针，探针系选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:3 之互补链、SEQ ID NO:4、与SEQ ID NO:4具约70％至约99％同源性的序列、及SEQ ID NO:4之互补链所组成之群组；利用引物对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物。
在一实施方式中，利用引物对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物步骤，聚合酶连锁反应为实时定量聚合酶连锁反应。
本公开之另一实施方式为提供一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒，包含引物对，引物对系选自于由SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:1之互补链以及SEQID NO:2 之互补链所组成的群组。
在一实施方式中，引物对为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。
在一实施方式中，检测非结核分枝杆菌的试剂盒更包含检体，其中检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便的其中之一或其组合。
在一实施方式中，检测非结核分枝杆菌的试剂盒更包含目标基因，其中目标基因为非结核分枝杆菌的16S核糖体RNA序列。
在一实施方式中，检测非结核分枝杆菌的试剂盒更包含模板，具有约100个碱基对至约250个碱基对的长度。
在一实施方式中，模板为SEQ ID NO:5。
在一实施方式中，检测非结核分枝杆菌的试剂盒更包含至少一探针系选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3 具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:3之互补链、SEQ ID NO:4、与SEQ ID NO:4具约70％至约 99％同源性的序列、及SEQ ID NO:4之互补链所组成之群组。
本公开之另一实施方式为提供一种引物组，包含:正向引物，系选自于由SEQ IDNO:1、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、以及SEQ ID NO:1之互补链所组成的群组；以及反向引物，系选自于由SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列、以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组。
【图式简单说明】
请结合附图阅读以下详细描述，将可更容易理解本公开内容之态样。但须注意依照本产业的标准做法，各种特征未按照比例绘制。事实上，各种特征的尺寸为了清楚的讨论而可被任意放大或缩小。
图1系根据本公开一些实施方式，显示16S rRNA基因序列的部分片段、引物对及探针设计的位置。
图2系根据本公开一些实施方式，以引物对SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2进行检测之电泳结果图。
图3系根据本公开一些实施方式，测试在不同模板量的情形下进行实时定量聚合酶连锁反应之增幅曲线图。
图4至12系根据本公开一些实施方式测试9种非结核分枝杆菌在不同模板量的情形下进行实时定量聚合酶连锁反应获得的R2数值。
图13系根据本公开一些实施方式，测试在82例临床样本的情形下进行实时定量聚合酶连锁反应之增幅曲线图。
【实施方式】
为使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明的实施态样与具体实施例提出说明性的描述，但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所公开的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节，以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，亦可在无此等特定细节之情况下实践本发明之实施例。
于本文中，除非内文中对于冠词有所特别限定，否则『一』与『该』可泛指单一个或多个。将进一步理解的是，本文中所使用之『包含』、『包括』、『具有』及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、组件与/或组件，但不排除其它的特征、区域、整数、步骤、操作、组件、组件，与/或其中之群组。
本公开之实施方式提供一种检测非结核分枝杆菌的方法，包含下列步骤:提供样本及提供引物对。引物对选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1 具约70％至约99％同源性的序列、与SEQ ID NO:2具约 70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:1之互补链以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组。接着，利用前述引物对与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物。最后，分析产物以侦测非结核分枝杆菌的存在。
样本可包含各种不同来源的检体，例如血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便的其中之一或其组合。在一些实施方式中，检测非结核分枝杆菌的方法中所提供的检体包含非结核分枝杆菌。在一实施方式中，所述非结核分枝杆菌包括，但不限于鸟分支杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、龟分枝杆菌(M. chelonae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、偶发分枝杆菌(M. fortuitum)、土地分支杆菌(M.terrae)、瘰疬分支杆菌(M.scrofulaceum)、或堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)。
引物对的选择如前文所述，并不限于本文所公开的 SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。引物对在选择上除了可包含SEQ ID NO:1的互补链及SEQ ID NO:2的互补链之外，SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2所示的序列亦可容许某种程度的变异。也就是说，与SEQ ID NO:1 具约70％至约99％同源性的序列以及与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列应用于本实施方式中亦有相同的功效。举例而言，引物对的选择可包含SEQ ID NO:1 之简并序列及SEQ ID NO:2之简并序列。此处所述之「简并序列」系指本文所公开的寡核苷酸序列中部分核苷酸为其他核苷酸所取代。换言之，SEQ ID NO:1之简并序列意味着在SEQ ID NO:1序列长度不变的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约30％的变异程度。而SEQ ID NO:2之简并序列意味着在SEQ ID NO:2序列长度不变的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约30％的变异程度。在另一些实施例中，引物对的选择亦可包含SEQ ID NO:1之衍生序列及SEQ ID NO:2之衍生序列。此处所述「衍生序列」系指本文所公开的寡核苷酸序列中在3’端或5’端可进行修饰，并且仍保留部分或全部序列。换言之，SEQ ID NO:1之衍生序列意味着在SEQ ID NO:1 序列长度可进行增减的情形下，可容许其寡核苷酸具有约 1％至约30％的变异程度。而SEQ ID NO:2之衍生序列意味着在SEQ ID NO:2序列长度可进行增减的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约30％的变异程度。在另一些实施方式中，引物对选自与SEQ ID NO:1具约80％至约 99％同源性的序列(例如约85％、约90％、或约95％)以及与SEQ ID NO:2具约80％至约99％同源性的序列(例如约85％、约90％、或约95％)所组成的群组。
在一些实施方式中，检测非结核分枝杆菌的方法更包括提供至少一探针，探针系选自于由SEQ ID NO:3、与 SEQ ID NO:3具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:3之互补链、SEQ ID NO:4、与SEQ ID NO:4具约70％至约99％同源性的序列、及SEQ ID NO:4之互补链所组成之群组。于检测时，探针可仅使用一条序列、或是一条以上的序列(例如两条、三条、四条等)，都能具有相似的检测效果。
探针的选择如前文所述，并不限于本文所公开的SEQ ID NOs:3、4。探针在选择上除了可包含SEQ ID NOs:3、 4的互补链之外，SEQ ID NOs:3、4所示的序列亦可容许某种程度的变异。也就是说，与SEQ ID NOs:3、4具约70％至约99％同源性的序列应用于本实施方式中亦有相同的功效。举例而言，探针的选择可包含SEQ ID NO:3 之简并序列。SEQ ID NO:3之简并序列意味着在SEQ ID NO:3序列长度不变的情形下，可容许其寡核苷酸具有约 1％至约30％的变异程度。举例而言，探针的选择可包含SEQ ID NO:4之简并序列。SEQ ID NO:4之简并序列意味着在SEQ ID NO:4序列长度不变的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约30％的变异程度。在另一些实施例中，探针的选择亦可包含SEQ ID NOs:3、4之衍生序列。举例而言，SEQ ID NO:3之衍生序列意味着在SEQ ID NO:3 序列长度在3’端或5’端进行增减的情形下，可容许其寡核苷酸具有约1％至约30％的变异程度。举例而言，SEQ ID NO:4之衍生序列意味着在SEQ ID NO:4序列长度在3’端或5’端进行增减的情形下，可容许其寡核苷酸具有约 1％至约30％的变异程度。在另一些实施方式中，探针选自与SEQ ID NO:3具约80％至约99％同源性的序列(例如约85％、约90％、或约95％)。
在一实施方式中，利用引物对、探针与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物，包含进行聚合酶连锁反应使得引物对增幅非结核分枝杆菌群中16s核糖体RNA基因序列的部分序列以获得产物，其中此部分序列为SEQ ID NO:5 (鸟分支杆菌)。聚合酶连锁反应为一种分子生物学技术。利用具有寡核苷酸序列之引物对扩增特定的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)片段。应理解的是，本文所公开的序列可用于各种以聚合酶连锁反应为基础的技术。在一实施例中，聚合酶连锁反应可包含但不限于实时定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)。在一实施例中，若采用的实时聚合酶连锁反应为探针型的荧光系统，利用引物对与样本进行聚合酶连锁反应以获得产物之前，更包含使用探针对样本进行杂合反应 (hybridization)，使得探针黏合到目标序列上。亦即，引物对、探针与样本一同进行一聚合酶连锁反应以获得一产物。
本公开之实施方式亦提供一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒(kit)，包含一引物对。上述引物对选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、与SEQ ID NO:2具约70％至约 99％同源性的序列、SEQ ID NO:1之互补链以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组。在一些实施方式中，引物对为SEQ ID NO:1及SEQ IDNO:2。在一些实施方式中，引物对为与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列及与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列。在一些实施方式中，引物对为SEQ ID NO:1之互补链及 SEQ ID NO:2之互补链。
在某些实施方式中，检测非结核分枝杆菌的试剂盒可进一步包含检体。检体的来源可为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便的其中之一或其组合。举例来说，此检测非结核分枝杆菌的试剂盒可应用于各医疗单位，藉由采集个体(例如：人)的体液或排泄物进行检测。
在一些实施方式中，检测非结核分枝杆菌的试剂盒可进一步包含一目标基因，并且此目标基因系指非结核分枝杆菌的16s核糖体RNA基因序列。再者，尚有一些实施方式，检测非结核分枝杆菌的试剂盒可进一步包含模板，具有约100个碱基对至约250个碱基对的长度。举例来说，此模板可为16s核糖体RNA序列中的部分序列，例如SEQ ID NO:5所示的序列，具有140个碱基对的长度。但在另一些实施方式中，模板不包含SEQ ID NO:5所示的序列，且为具有约100个碱基对至约250个碱基对之长度的人工合成序列，其亦可与本实施方式中的引物对黏合从而被增幅。在一些实施方式中，可直接将SEQ ID NO:5所示的序列构筑至不同载体中，并且，以此带有SEQ ID NO:5 的载体作为模板进行扩增时，专一性高且检测效能极佳。
在一些实施方式中，检测非结核分枝杆菌的试剂盒可进一步包含至少一探针，探针选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:3之互补链、SEQ ID NO:4、与SEQ ID NO:4 具约70％至约99％同源性的序列、及SEQ ID NO:4之互补链所组成之群组。在一些实施方式中，探针为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其组合。
为进一步证实本发明之各种实施方式可用于检测分枝杆菌的存在，遂进行以下试验。应注意的是，下述实施例仅提供作为示范目的，而非限制本发明。
引物及探针设计
非结核分枝杆菌群其16s核糖体RNA基因序列具高度保守性。故本试验利用在线设计程序如primer 3及GenScript Real-time PCR Primer Design针对 9种非结核分枝杆菌(鸟分支杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈登分枝杆、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、土地分支杆菌、瘰疬分支杆菌、或堪萨斯分枝杆菌)与1种结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的16s核糖体RNA序列进行引物及探针的设计。
根据基因银行(GenBank)数据库提供的信息，图1 绘示16s核糖体RNA基因序列的部分正股序列。本试验中引物对为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。SEQ ID NO:1 所示之核苷酸序列系针对第151-174个碱基对的位置进行设计(如右箭号实心方框所示)。SEQ ID NO:2所示之核苷酸序列系针对第271-290个碱基对的位置进行设计 (如左箭号实心方框所示)。而探针为SEQ ID NOs:3、4。 SEQ ID NO:3所示之核苷酸序列系针对位于第181-194 个碱基对之间的片段进行设计(如右箭号虚线方框所示)。 SEQ ID NO:4所示之核苷酸序列系针对位于第211-223 个碱基对之间的片段进行设计(如左箭号虚线方框所示)。据此，利用引物对SEQ ID NOs:1、2可增幅的产物具有 140碱基对的长度。
具体而言，正向引物SEQ ID NO:1的第5-11、13 及15个核苷酸分别为BYBDSDRKS，其中B代表该核苷酸可选自g、c或t(即，非a，且合成比例各约占33％)，Y 代表该核苷酸可选自c或t(合成比例各约占50％)，D代表该核苷酸可选自a、g或t(即，非c，且合成比例各约占33％)，S代表该核苷酸可选自g或c(合成比例各约占 50％)，R代表g或a(合成比例各约占50％)，K代表g 或t(合成比例各约占50％)。在制备正向引物SEQ ID NO:1时，以上各种核苷酸组合都混和在内。
引物对之灵敏度分析
根据前述GenBank资料所示的16s核糖体RNA基因序列，将9种非结核分枝杆菌(鸟分支杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈登分枝杆、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、土地分支杆菌、瘰疬分支杆菌、及堪萨斯分枝杆菌)分别选殖于pJET1.2/blunt载体(Protech CO.,Ltd, GenBank:Y14837.1)，以获得9种带有16s核糖体 RNA基因序列的标准质粒(以下简称为16s rRNA标准质粒)。
制备反应混合液，包含模板(16s rRNA标准质粒)、聚合酶连锁反应试剂(QuantiNova probe master mix)、浓度为200nM的正向引物(SEQ ID NO:1)、及浓度为300nM的反向引物(SEQ ID NO:2)。聚合酶连锁反应条件为95℃2分钟，95℃变性(denature)5秒，60℃黏合/扩增(annealing/amplification) 5秒，进行45个循环反应。
请参阅图2，系根据本公开一些实施方式，以引物对 SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2进行聚合酶连锁反应检测结核分枝杆菌群与非结核分枝杆菌的临床检体。由左至右分别为第2-6栏为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)，第7-15、16-19栏为非结核分枝杆菌(鸟分支杆菌、戈登分枝杆、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分支杆菌、土地分支杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、偶发分枝杆菌、及偶发分枝杆菌)，第1、16及21栏为分子量标示栏 (marker ladder)，第20栏为无模板对照组(notemplate control，NTC)。电泳结果图显示，仅非结核分枝杆菌有专一的一条扩增产物(140bp)，结核分枝杆菌群则没有扩增产物产生。因此，引物对SEQ ID NOs:1、 2可精准区分非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌群。
引物对与探针之灵敏度分析
依据市售实时定量聚合酶连锁反应试剂盒 (QuantiNova Probe PCR Kit,Qiagen)操作说明书，反应混合液包含模板(16s rRNA标准质粒)、11μL 的实时定量聚合酶连锁反应试剂(QuantiNova probe master mix)、浓度为200nM的正向引物(SEQ ID NO:1)、浓度为300nM的反向引物(SEQ ID NO:2)、浓度为200nM的探针1-1(SEQ ID NO:3)、以及浓度为200nM的探针1-2(SEQ ID NO:4)，配制成总体积为25μL的反应混合液。实时定量聚合酶连锁反应条件为95℃变性5秒，60℃黏合/扩增5秒，并将反应混合液于实时定量聚合酶连锁反应器(CFX-96, BioRad)进行45个循环反应。
应说明的是，在此试验中是以不同的模板量进行实时定量聚合酶连锁反应，以测试引物对SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的灵敏度。依前述反应混合液的配方，制备7组不同模板量的反应混合液，分别带有10、102、103、104、 105、106及107拷贝数(copy number)的16srRNA 标准质粒。参照图3(为鸟分支杆菌的16s rRNA标准质粒)，其分别为实时定量聚合酶连锁反应后所得之增幅曲线图及标准曲线图。如图3所示，横轴为反应循环数 (cycles)，纵轴为荧光强度(ΔRn)。由此增幅曲线图可知，10至107拷贝数的荧光值皆呈现上升的正趋势。依据不同拷贝数所得之阈值循环(Ct)值，可以验证本公开所设计的引物对与探针组在非结核分枝杆菌的检测范围。请参阅图4至12，系根据本公开一些实施方式测试9种非结核分枝杆菌在不同模板量(10～107拷贝数)的情形下进行实时定量聚合酶连锁反应获得的R2数值。各组的R2值皆大于0.94，代表此回归模式精准度高。此外，请参阅以下表 1-9，9种非结核分枝杆菌侦测5-80个拷贝数时，之最低检测极限可至每反应5个拷贝数不等，且6次的检测中6 次都有检测出，侦测率皆为100％。
表1、鸟分支杆菌
表2、胞内分枝杆菌
| 拷贝数 | 阈值循环(Ct) | 侦测率 |
| 80 | 34.2 | 6/6 |
| 40 | 36.4 | 6/6 |
| 20 | 38.3 | 6/6 |
| 10 | 39.5 | 6/6 |
| 5 | 40.5 | 6/6 |
表3、龟分枝杆菌
| 拷贝数 | 阈值循环(Ct) | 侦测率 |
| 80 | 36.5 | 6/6 |
| 40 | 37.8 | 6/6 |
| 20 | 38.2 | 6/6 |
| 10 | 38.1 | 6/6 |
| 5 | 38.6 | 6/6 |
表4、戈登分枝杆菌
| 拷贝数 | 阈值循环(Ct) | 侦测率 |
| 80 | 34.0 | 6/6 |
| 40 | 34.6 | 6/6 |
| 20 | 34.8 | 6/6 |
| 10 | 34.9 | 6/6 |
| 5 | 35.0 | 6/6 |
表5、脓肿分枝杆菌
表6、偶发分枝杆菌
| 拷贝数 | 阈值循环(Ct) | 侦测率 |
| 80 | 34.4 | 6/6 |
| 40 | 36.4 | 6/6 |
| 20 | 37.8 | 6/6 |
| 10 | 38.4 | 6/6 |
| 5 | 40.7 | 6/6 |
表7、土地分支杆菌
| 拷贝数 | 阈值循环(Ct) | 侦测率 |
| 80 | 37.1 | 6/6 |
| 40 | 37.3 | 6/6 |
| 20 | 37.2 | 6/6 |
| 10 | 37.6 | 6/6 |
| 5 | 37.6 | 6/6 |
表8、瘰疬分支杆菌
| 拷贝数 | 阈值循环(Ct) | 侦测率 |
| 80 | 33.8 | 6/6 |
| 40 | 34.1 | 6/6 |
| 20 | 34.3 | 6/6 |
| 10 | 34.5 | 6/6 |
| 5 | 34.7 | 6/6 |
表9、堪萨斯分枝杆菌
| 拷贝数 | 阈值循环(Ct) | 侦测率 |
| 80 | 37.7 | 6/6 |
| 40 | 39.3 | 6/6 |
| 20 | 40.4 | 6/6 |
| 10 | 40.8 | 6/6 |
| 5 | 41.7 | 6/6 |
临床测试
以本公开引物对(SEQ ID NOs:1-2)及探针组(SEQ ID NOs:3-4)检测临床检体(如下表10)，搭配使用ABI Step One扩增仪检测82例临床样本。
表10、各分枝杆菌阳性临床检体数量
结果请参阅图13所示，在82例临床样本的情形下进行实时定量聚合酶连锁反应之增幅曲线图中，确实可准确鉴别结核分枝杆菌群(TB)与非结核分枝杆菌(NTM)，并于结核非枝杆菌群检体中无扩增反应。
前文概述数个实施例之特征以使得熟习该项技术者可更好地理解本公开之态样。熟习该项技术者应了解，可容易地将本公开内容用作设计或修改用于实现相同目的及/ 或达成本文引入之实施例的相同优点之其他制程及结构之基础。熟习该项技术者亦应认识到，此类等效物构造不违背本公开内容之精神及范畴，且可在不违背本公开内容之精神及范畴之情况下于此作出各种变化、替代以及变更。
序列表
<110> 台达电子工业股份有限公司
蔡佩珍
<120> 检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒
<130> NP-26367-TW
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物(Forward primer)
<400> 1
catgbybdsd rgkgsaaagc tttt 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物(Reverse primer)
<400> 2
gccgtatctc agtcccagtg 20
<210> 3
<211> 14
<212> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针1-1(Probe 1-1)
<400> 3
tgggatgggc ccgc 14
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针1-2(Probe 1-2)
<400> 4
ccattacccc accaac 16
<210> 5
<211> 140
<212> DNA
<213> 鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)
<400> 5
catgtcttct ggtggaaagc ttttgcggtg tgggatgggc ccgcggccta tcagcttgtt 60
ggtggggtga cggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg tgtccggcca 120
cactgggact gagatacggc 140
Claims (14)
1.一种检测非结核分枝杆菌的方法，包含下列步骤：
提供一样本；
提供一引物对，该引物对系选自于由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:1之互补链以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组；
利用该引物对与该样本进行一聚合酶连锁反应以获得一产物；以及
分析该产物以侦测非结核分枝杆菌的存在。
2.如权利要求1所述之检测非结核分枝杆菌的方法，其中提供该样本步骤，包含提供一检体包含非结核分枝杆菌。
3.如权利要求2所述之检测非结核分枝杆菌的方法，其中该检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便的其中之一或其组合。
4.如权利要求2所述之检测非结核分枝杆菌的方法，其中利用该引物对与该样本进行该聚合酶连锁反应以获得该产物步骤，包含进行聚合酶连锁反应使得该引物对增幅该非结核分枝杆菌中16S核糖体RNA基因序列的一部分序列以获得该产物，其中该部分序列为SEQID NO:5。
5.如权利要求1所述之检测非结核分枝杆菌的方法，更包含:
提供至少一探针，该探针系选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:3之互补链、SEQ ID NO:4、与SEQ ID NO:4具约70％至约99％同源性的序列、及SEQ ID NO:4之互补链所组成之群组；以及
利用该引物对、该探针与该样本进行该聚合酶连锁反应以获得该产物。
6.如权利要求5所述之检测非结核分枝杆菌的方法，其中利用该引物对、该探针与该样本进行该聚合酶连锁反应以获得该产物步骤，该聚合酶连锁反应为实时定量聚合酶连锁反应。
7.一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒，包含一引物对，该引物对系选自于由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:1之互补链以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组。
8.如权利要求7所述之检测非结核分枝杆菌的试剂盒，其中该引物对为SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2。
9.如权利要求7所述之检测非结核分枝杆菌的试剂盒，更包含一检体，其中该检体为血液、痰液、支气管肺泡冲洗液、尿液、粪便的其中之一或其组合。
10.如权利要求7所述之检测非结核分枝杆菌的试剂盒，更包含一目标基因，其中该目标基因为非结核分枝杆菌的16S核糖体RNA序列。
11.如权利要求7所述之检测非结核分枝杆菌的试剂盒，更包含一模板，具有约100个碱基对至约250个碱基对的长度。
12.如权利要求11所述之检测非结核分枝杆菌的试剂盒，其中该模板为SEQ ID NO:5。
13.如权利要求7所述之检测非结核分枝杆菌的试剂盒，更包含至少一探针系选自于由SEQ ID NO:3、与SEQ ID NO:3具约70％至约99％同源性的序列、SEQ ID NO:3之互补链、SEQID NO:4、与SEQ ID NO:4具约70％至约99％同源性的序列、及SEQ ID NO:4之互补链所组成之群组。
14.一种引物组，包含:
一正向引物，系选自于由SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1具约70％至约99％同源性的序列、以及SEQ ID NO:1之互补链所组成的群组；以及
一反向引物，系选自于由SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:2具约70％至约99％同源性的序列、以及SEQ ID NO:2之互补链所组成的群组。
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| Title |
|---|
| J.-U. KIM ET AL.: "Direct identification of mycobacteria from clinical specimens by multiplex real-time PCR", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 118, 31 December 2015 (2015-12-31), pages 1498 * |
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