CN101560568A - 鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其检测套组 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其检测套组，利用巢式聚合酶链式反应(nested PCR)鉴别结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)与非结核性分枝杆菌(nontuberculous mycobacterium)的方法及其检测套组。

Description

鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其检测套组
技术领域
本发明涉及利用巢式聚合酶链式反应(nested PCR)鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其检测套组。
背景技术
结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)为革兰氏阳性细菌中分枝杆菌属(mycobacterium)的一个成员，而非结核性分枝杆菌(Nontuberculousmycobacterium)，或称为非典型分枝杆菌(atypical mycobacterium)；非结核性分枝杆菌(mycobacterium other than tuberculosis)则是分枝杆菌属中除了结核杆菌以外细菌的统称。其中的鸟型结核菌(Mycobacterium aviumcomplex)广泛的自艾滋病患的检体被分离到后，非结核性分枝杆菌才受到重视。
肺结核为世界上主要的致命性传染疾病，目前有三分之一的人口患有肺结核，其中两千万人系活动性肺结核，超过五千万人受到多重抗药性的结核菌所感染，肺结核已成为HIV带原者主要致死的原因且快速致死率高达百分之八十。
肺结核由于结核分枝杆菌所引起，该病菌通过飞沫传染并导致肺部不可逆的破坏，亦可能引发影响包括骨头、关节、肝脏、脾脏、消化道及脑部等多重器官的系统性疾病，而贫穷、营养失衡及人口过多是肺结核持续存在且能广泛分布的主因。
过去以并用抗生素来控制肺结核，而现今多重抗药性的结核菌株对抗生素的并用以及数量具有高度的耐受程度。在较为极端的病例中，以手术移除感染的部位是有其必要性。
传统而言，以观察临床征状、胸部X光检查为基础以及痰液或组织抹片的确认仍是诊断肺结核的“黄金准则”。
非结核性分枝杆菌在环境中普遍存在且种类繁多，目前超过九十余种。该菌可引发移生(colonization)、感染及院内假性群突发(psudo-outbreak)，数据显示因非结核性分枝杆菌所引起院内突发感染的频率正逐步增加，而正确且高标准地消毒医疗仪器以及正确且高标准地使用无菌药剂或药品可防止多数院内感染的最佳法则，因为非结核性分枝杆菌并不会从院内消失，且其感染能力正持续增加中，故所有院内感染的情况均需考虑到是否为非结核性分枝杆菌所引起，且小心监控以确认可能的突发感染。分析菌株的种类及检体来源可协助确认菌群的重要性，一旦怀疑发生突发(out-break)或假性群突发，分生技术应可迅速确认来源及确定适当的控制措施。
证据显示，非结核性分枝杆菌所引发的院内传染正逐步增加，且所导致的状况已由无害的移生转变成具侵害性的感染。此外，非结核性分枝杆菌亦可造成微生物检体的污染而导致不必要的治疗及可能有害的诊断步骤。
Runyon(1959)曾依照菌落生长速度及菌落光照之后的颜色变化，将非结核性分枝杆菌分为以下四群：
第一群：生长缓慢的光照产色菌(photochromogens)，即培养的菌落经照光后成黄色。其中包括M.kansasii(坎萨斯分枝杆菌)、M.marinum、M.simiae、M.asiaticum等致病菌，以M.kansasii(坎萨斯分枝杆菌)为最常见。
第二群：生长缓慢的黑暗产色菌(scotochromogens)，即培养的菌落未经照光即成黄色。其中包括M.scroflaceu、M.xenopi、M.szulgai、M.flavscens等致病菌，及M.gordonae非致病菌，以M.scrofulaceum为最常见。
第三群：生长缓慢的非光照产色菌(nonchromogens)，即培养的菌落经照光亦不改变颜色。其中包括M.avium complex(鸟型分枝杆菌)、M.malmoense、M.shimoidei等可能致病菌及M.gastri、M.terrae、M.trivialez等非致病菌，M.avium complex(鸟型分枝杆菌)为最常见。
第四群：生长迅速的分枝杆菌(rapid-growing)。其中包括M.fortuitum、M.chelonae-abscessus、M.clelollac-chelonae等可能致病菌及M.phlei、M.smegmatis、M.vaccac、M.flavescens等非致病菌。
最近，针对推定的结核性分枝杆菌或非结核性分枝杆菌所引起的院内突发感染均采用分生技术来确认菌种来源及传染模式。核酸探针(DNAprobe)、聚合酶链式反应分析(PCR)以及液态培养基对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌具有较高敏感度且快速的诊断效能。
然而在快速诊断技术敏感度的增加，与其专一性的增加并无相关，举例来说，使用LightCycler(LC)  仪器进行实时聚合酶链式反应分析(real-time PCR assay)提供一种快速、具敏感性及专一性检测结核性分枝杆菌的工具，而PCT专利申请案(PCT patent application)WO2007034118揭露了利用real-time PCR技术可检测出可能存在于生物性检体中属于结核性分枝杆菌菌株的方法，其方法包括：以PCR引物对(pair of primers)进行放大反应、以属于hsp 65基因的FRET核酸探针进行专一性结合，最后检测荧光强度。因无法充分支应仪器设置与保养所需的经费，使得以LC仪器对结核性分枝杆菌进行例行性的诊断至今仍有其限制。
韩国专利申请案KR20030075315揭露了利用多巢式聚合酶链式反应(multiple-nested PCR)  同步快速检测Tubercle Bacillus(TB)及nontuberculous Mycobacteria(NTM)的方法，此方法虽较传统的PCR成功地增加其放大DNA片段的专一性，但需要对目标序列有更多的了解才能达成。
发明内容
本发明提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，其利用单工(uniplex)、复工(duplex)及多任务(multiplex)PCR技术进行扩增放大，再与连接着荧光微珠的TB和/或NTM核酸探针进行杂合反应，进而快速筛选出具感染力的TB和/或NTM的检体。同步或分开使用高效且具菌种专一性的引物可扩增放大针对个别病原株(如同结核性分枝杆菌(TB)、鸟型分枝杆菌(MAC)、坎萨斯分枝杆菌(MK)及生长迅速的分枝杆菌(RGM))多个可供诊断的区域。
本发明涉及TB和NTM所拥有rpoB基因的引物及探针，由上述各病原菌中分离出该基因后，以一个或多个由TB及NTM所设计的引物对在同一反应管中利用uniplex，duplex及multiplex PCR进行扩增放大作用，之后以探针进行杂合反应，再以Luminex仪器系统进行菌株种类的鉴别。此步骤将PCR产物与连接着荧光微珠的核酸探针进行杂合反应，可确认产物中的核酸序列以及通过连接着荧光微珠的核酸探针鉴别TB及NTM。
PCR技术可将少量的细菌DNA增加至可提供分析的数量，适于使用在生长缓慢的菌种。近年来，以16S rRNA，23SrRNA及rpoB gene或在16S-23S rRNA间的三明治区域，该区域的特征在于位在不同TB基因两端具高度保存的区域，而非位在不同TB基因中段具多型性或多变性区域的PCR技术检测TB。这些区域可通过PCR扩增放大，而后用限制酶切割以进行鉴定。许多菌种利用PCR技术进行比较及鉴定，如PCR-限制片段长度多样性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)或巢式PCR。PCR-RFLP不仅可使用在鉴定不同的NTM，亦可判别NTM对rifampin是否具有抗药性。本发明揭露PCR产物进一步可利用限制酶分析(如PCR-RFLP或PCR-单核苷酸多样性(PCR-single nucleotidepolymorphism，PCR-SNP))检测菌株对rifampin是否具有抗药性。
利用与PCR产物相对应且连接独特荧光微珠的核酸探针和PCR产物进行杂合反应可解析混合且经扩增放大的PCR产物。
杂合微珠通过液相反应来检测PCR产物，而此方法在多任务形式(multiplex format)下让最大敏感性能够有效地进行。
10个带有不同病原菌DNA的仿造及临床的检体可作为高效率的实例，这些检体可萃取DNA，且可用于multiplex PCR液相微珠的检测，这样的分析可正确检测病原的存在与否。
这些病原菌包括结核分枝杆菌(TB)及非结核分枝杆菌(NTM)，NTM依照Runyon伦永氏群组分类法由光照产色菌、黑暗产色菌及非光照产色菌所组成，在此，NTM进一步包括鸟型分枝杆菌、坎萨斯分枝杆菌及生长迅速的分枝杆菌。
Uniplex、duplex及multiplex PCR用于决定每个引物对对病原菌的效能，其结果亦可展现出每个引物对对鉴别TB及NTM的个别效果，使用于TB及NTM间的引物对并不会发生交叉干扰的情况。
专门名词定义(Term definition)
核酸(nucleic acid)
以共价键结方式连接至少两个自然发生或经修饰的脱氧核糖核苷或核糖核苷所形成的序列。
报告者(reporter)
一种化学官能团或基团，能以适当的检测系统予以辨识，特别是带有检测官能团的检测分子在进行分子分离之时或之后。其包括多种酵素、荧光物质、冷光物质、生物性冷光物质、放射性物质、使用在多种正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography)的正电子放射金属(positron emitting metals)。
上述所举出的酵素范例包括辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的荧光物质包括伞形酮(umbelliferone)、荧光黄(fluorescein)、异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪氨荧光黄(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯(dansyl chloride)或藻红蛋白(phycoerythrin)；冷光物质的范例包括有色微球体(coloredmicrospheres，CMS)或发光氨(luminol)；生物性冷光物质的范例包括冷光酶(luciferase)、冷光素(luciferin)及水母素(aequorin)以及适当放射性物质的范例包括碘-125、碘-131、铟-111或鎝-99。
Reporter可依前案所揭示的技术采直接或间接的方式进行连接或结合，例如美国专利案US4741,900揭露金属离子可连结在用作诊断、具目标专一性辨识的抗体上。依据不同标的的形式(核酸或抗原)，连接者可为核酸片段或抗体(或其抗体片段)。
标的基因(target gene)
本发明关于核苷酸序列包含具高度专一性的寡核苷酸引物，其依TB及NTM的rpoB基因特定的部份进行合成及杂合反应，而rpoB基因特定的部份具有SEQ ID NO：1-4的序列。
此外，本发明亦提供新的核酸探针序列SEQ ID NO：5-8，用作检测巢式PCR产物，因此，此核酸序列可检测TB或NTM的存在与否。
本发明提供的引物对用在巢式PCR反应以检测经纯化的核酸混合物检体中是否有TB rpoB基因的存在，而核酸混合物检体由可能受感染的样本中萃取而来。巢式PCR(nested PCR)包括两阶段式的聚合酶链式反应，第一阶段应用外部(outer)引物对对特定第一标的核苷酸序列(first targetnucleotide sequence)进行扩增放大，第二阶段应用内部或巢式(inner ornested)引物对对较小的第二标的核苷酸序列(second target nucleotidesequence)进行扩增放大，而第二标的核苷酸序列在第一标的核苷酸序列之间，且标的核苷酸序列系为TB rpoB基因的待测区段。
引物对的标记(labeled primers)
引物对在nested PCR系用来进行第一或第二阶段扩增放大反应，而引物对上的标记则作为直接检测经扩增放大的产物。使用在引物对上的标记包括荧光分子、放射性分子、呈色受质、生物素(biotin)、吖啶酯类化合物(acridinium ester)及氨甲酰吖啶类化合物(acridinium-9-carboxamide)。以生物素作标记已是公开的信息，如同荧光分子及放射性分子标记在寡核苷酸及核苷酸中。本发明内部引物对系以生物素进行标记。
若使用生物素进行标记，则以经连接可检测标记的亲和素(avidin)或链霉亲和素(streptavidin)进行检测，而可检测标记为酵素，如horseradishperoxidase，供作连接的酵素可由商业化公司如Vector Laboratories取得。链霉亲和素与生物素间具有高度亲和力，洗去未与生物素结合的链霉亲和素，在horseradish peroxidase存在下，使用光致发光受质(luminescence-emission substrate)及缓冲液并以Luminometer进行检测。简言之，通过检测化学发光的波长及强度可以进行鉴定及定量。
本发明提供一种用于鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的检测套组，其包含：
a.由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所组成的结核分枝杆菌引物对；
b.由SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；
c.SEQ ID NO：5的结核分枝杆菌的核酸探针；
d.SEQ ID NO：6、7、8的非结核分枝杆菌的核酸探针，
其中各引物对中具有意义的引物连接到可检测的标记上，各核酸探针连接到另一可检测的标记上。
本发明中可检测的标记选自于荧光物质、冷光物质、放射线物质或呈色物质。
本发明中可检测的标记若为生物素，该检测套组可进一步包含亲和素或链霉亲和素与共轭物所形成的复合物。
本发明中共轭物为酵素或光敏物质。
本发明亦提供一种用于检测鸟型分枝杆菌的检测套组，其包含：
a.SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；及
b.如SEQ ID NO：6所示，对鸟型分枝杆菌具专一性的核酸探针，
其中所述的核酸探针连接到可检测的标记上。
本发明进一步提供一种用于检测坎萨斯分枝杆菌的检测套组，其包含：
a.SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；及
b.如SEQ ID NO：7所示，对坎萨斯分枝杆菌具专一性的核酸探针，
其中所述的核酸探针连接到可检测的标记上。
本发明更进一步提供一种用于检测快速生长结核分枝杆菌的检测套组，其包含：
a.SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；及
b.如SEQ ID NO：8所示，对快速生长结核分枝杆菌具专一性的核酸探针，
其中所述的核酸探针连接到可检测的标记上。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1显示临床检体经uniplex PCR反应的PCR产物与TB探针和MAC探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，MAC 61，71，72，73及74代表鸟型分枝杆菌检体。
图2显示临床检体经duplex PCR反应的PCR产物与TB探针和MAC探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，MAC 61，71，72，73及74代表鸟型分枝杆菌检体。
图3显示临床检体经multiplex PCR反应的PCR产物与TB探针和MAC探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，MAC 61，71，72，73及74代表鸟型分枝杆菌检体。
图4显示临床检体经uniplex PCR反应的PCR产物与TB探针和MK探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，K-E11，K-F2，K-F14，K-F15及K-F22代表坎萨斯分枝杆菌检体。
图5显示临床检体经duplex PCR反应的PCR产物与TB探针和MK探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，K-E11，K-F2，K-F14，K-F15及K-F22代表坎萨斯分枝杆菌检体。
图6显示临床检体经multiplex PCR反应的PCR产物与TB探针和MK探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，K-E11，K-F2，K-F14，K-F15及K-F22代表坎萨斯分枝杆菌检体。
图7显示临床检体经uniplex PCR反应的PCR产物与TB探针和RGM探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，RGM1，RGM2，RGM3，RGM4 and RGM5代表生长迅速的分枝杆菌检体。
图8显示临床检体经duplex PCR反应的PCR产物与TB探针和RGM探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，RGM1，RGM2，RGM3，RGM4 and RGM5代表生长迅速的分枝杆菌检体。
图9显示临床检体经multiplex PCR反应的PCR产物与TB探针和RGM探针进行杂合反应，并以Luminex仪器进行分析的结果。TB代表结核性分枝杆菌检体，RGM1，RGM2，RGM3，RGM4 and RGM5代表生长迅速的分枝杆菌检体。
具体实施方式
惟以下所述者，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，举凡依本发明所述特征及精神，均应包括于本发明的权利要求范围内。
材料及方法
1.引物与探针：
(1)Tbc1与TbcR5-TB菌的引物对。
(2)NTM-M5与NTM-RM3-NTM菌的引物对。
(3)TB探针-Mycobacterium tuberculosis的探针。
(4)MAC探针-Mycobacterium avium的探针。
(5)MK探针-Mycobacterium kansasii的探针。
(6)RGM探针-Rapid Growers Mycobacterium的探针。
2.临床检体：
(1)Mycobacterium tuberculosis(TB)
(2)Mycobacterium avium(MAC)
(3)Mycobacterium kansasii(MK)
(4)Rapid Growers Mycobacterium(RGM)
3.纯化临床检体DNA：
(1)取1ml一倍磷酸缓冲溶液(PBS)于微量管(eppendorf)中，用括取环(loop)刮取菌落，与PBS中混合均匀后加防爆夹，旋转振动(vortex)一下，于80-90℃加热30分钟。
(2)之后静置至室温，离心10000g，5分钟。倒掉上清液，加入400μl的TE(Tris 10mM，pH-8.0，EDTA 1mM)以及50μl的溶菌酶(lysozyme)10mg/ml，vortex一下，放入37℃水浴1小时。
(3)取出样本，加入70μl的10％SDS以及6μl的蛋白酶K(proteinaseK)10mg/ml，vortex一下，放入60℃水浴10分钟。
(4)取出sample，加入100μl冰的5M NaCl，并反转数次，再加入80μl的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB，cetyltrimethyl ammonium bromide)/NaCl，并反转数次，放入65℃水浴10分钟。
(5)加等体积的三氯甲烷/异戊醇(chloroform/isoamyl alcohol(24：1)，并反转数次，离心10000g，5分钟，取上清液至新的eppendorf中。
(6)加入500μl的异丙醇(isopropanol)，并放于-20℃冰箱中30分钟。之后离心14000g，20分钟，倒掉上清液。
(7)加入500μl冰的70％酒精，离心14000g，5分钟，倒掉上清液，烘干，加入50μl无菌水。
4.PCR反应：
(1)取0.2ml PCR专用tube，加入以下的物质：
反应剂         体积
DNA            1μl(3ng/μl)
反应混合液     49μl
＊＊反应混合液包含以下的物质
反应剂                       体积
10x聚合酵素延长缓冲液        5μl
引物Tbc1(10μM)              1μl
引物TbcR5(10μM)             1μl(生物素标记)
引物NTM-M5(10μM)            1μl(生物素标记)
引物NTM-RM3(10μM)           1μl
核苷酸(2.5mM)                2.5μl
Taq DNA polymerase(2U/μl)   0.25μl
ddH2O                        37.25μl
(2)待加完上述所列物质并混合均匀之后，便开始以下的扩增放大程序。
扩增放大程序：
  温度   时间 循环数(number of cycle)
    1     95℃     5分钟     1个循环
2     95℃65℃72℃     30秒30秒60秒 30个循环
    3     72℃     5分钟     1个循环
    4     4℃     保持     ---
5.杂合反应
(1)取5μl PCR产物，加入10μl二次水，混合均匀，在95℃反应10分钟。
(2)之后加入各1μl的TB微珠探针(microsphere probe)与MAC微珠探针或是MK微珠探针或是RGM微珠探针以及33μl的1.5倍TMAC，4.5M氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride)，0.15％SDS，75mM pH 8.0 Tris-HCl，6mM pH 8.0 EDTA)。
(3)混合均匀后在46℃反应1小时。
6.检测反应
(1)将完成杂合反应的反应物离心14000rpm，2分钟，去除上清液。
(2)加入50μl的1倍TMAC(3M tetramethylammonium chloride，0.1％SDS，50mM pH 8.0 Tris-HCl，4mM pH 8.0 EDTA)清洗，再离心14000rpm，2分钟，去除上清液。
(3)重复步骤(2)。
(4)将1mg/ml的链霉亲合素-藻红蛋白(streptavidin-phycoerythrin，SA-PE)以1∶250的比例稀释于1倍TMAC，再加入50μl于样品中混合均匀，避光震荡摇晃呈色10分钟。
(5)将样品注入96孔盘中，进行Luminex的测试。
结果
1.将10个Mycobacterium avium(MAC)的临床检体以单工(uniplex)与复工(duplex)PCR反应以及与Mycobacterium tuberculosis(TB)DNA所做的多任务(multiplex)PCR反应的PCR产物与TB探针和MAC探针一起进行Luminex测试，其结果如图1-图3所示。
(1)在Uniplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和MAC探针一起进行杂合反应并通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对MAC检体不会有信号；而MAC探针会对MAC检体有信号，对TB检体不会有信号(如图1)。
(2)在duplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和MAC探针一起进行杂合反应并通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对MAC检体不会有信号；而MAC探针会对MAC检体有信号，对TB检体不会有信号(如图2)。
(3)在multiplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和MAC探针一起进行杂合反应并通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对MAC检体不会有信号；而MAC探针会对MAC检体有信号，对TB检体不会有信号(如图3)。
2.将10个Mycobacterium kansasii(MK)的临床检体以uniplex与duplex PCR反应以及与Mycobacterium tuberculosis(TB)DNA所做的multiplex PCR反应的PCR产物与TB探针和MK探针一起进行Luminex测试，其结果如图4-图6所示。
(1)在Uniplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和MK探针一起进行杂合反应并通过通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对MK检体不会有信号；而MK探针会对MK检体有信号，对TB检体不会有信号(如图4)。
(2)在duplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和MK探针一起进行杂合反应并通过通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对MK检体不会有信号；而MK探针会对MK检体有信号，对TB检体不会有信号(如图5)。
(3)在multiplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和MK探针一起进行杂合反应并通过通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对MK检体不会有信号；而MK探针会对MK检体有信号，对TB检体不会有信号(如图6)。
3.将10个Rapid growers Mycobacterium(RGM)的临床检体以uniplex与duplex PCR反应以及与Mycobacterium tuberculosis(TB)DNA所做的multiplex PCR反应之PCR产物与TB探针和RGM探针一起进行Luminex测试，其结果如图7-图9所示。
(1)在Uniplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和RGM探针一起进行杂合反应并通过通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对RGM检体不会有信号；而RGM探针会对RGM检体有信号，对TB检体不会有信号(如图7)。
(2)在duplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和RGM探针一起进行杂合反应并通过通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对RGM检体不会有信号；而RGM探针会对RGM检体有信号，对TB检体不会有信号(如图8)。
(3)在multiplex PCR reaction的PCR产物与TB探针和RGM探针一起进行杂合反应并通过通过Luminex测试，其结果显示TB探针只会对TB检体有信号，对RGM检体不会有信号；而RGM探针会对RGM检体有信号，对TB检体不会有信号(如图9)。
序列表
<110>亚洲基因科技股份有限公司
<120>鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其检测套组
<130>9P04032-TW
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(MTB)
<221>primer_bind
<222>(1)..(24)
<400>1
cgtacggtcg gcgagctgatccaa    24
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(MTB)
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(25)
<400>2
ttgacccaca agcgccgact gtcgg  25
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>非结核分枝杆菌Nontuberculous mycobacterium(NTM)
<221>primer_bind
<222>(1)..(25)
<400>3
ggagcggatg accacccagg acgtc  25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>非结核分枝杆菌Nontuberculous mycobacterium(NTM)
<221>primer_bind
<222>(1)..(25)
<400>4
cagcgggttg ttctggtcca tgaac  25
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis
<221>Probe
<222>(1)..(17)
<400>5
caaaaccaga tccgggt          17
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>鸟型分枝杆菌Mycobacterium avium complex
<221>Probe
<222>(1)..(20)
<400>6
gccatcacgc cgcagaccct       20
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>坎萨斯分枝杆菌Mycobacterium kansasii
<221>Probe
<222>(1)..(21)
<400>7
 atccgcccgg tggtcgccgc c    21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>快速生长结核分枝杆菌Rapid-Growing Mycobacterium tuberculosis
<221>Probe
<222>(1)..(21)
<400>8
tcggaaccag ccagctgtcg c     21

Claims (9)

1.一种用于鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的检测套组，其特征在于包含：
a.由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所组成的结核分枝杆菌引物对；
b.由SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；
c.SEQ ID NO：5的结核分枝杆菌的核酸探针；
d.SEQ ID NO：6、7、8的非结核分枝杆菌的核酸探针，
其中各引物对中具有意义的引物连接到可检测的标记上，各核酸探针连接到另一可检测的标记上。
2.如权利要求1所述的检测套组，其特征在于可检测的标记选自于荧光物质、冷光物质、放射线物质或呈色物质。
3.如权利要求1所述的检测套组，其特征在于可检测的标记为生物素，该检测套组可进一步包含亲和素或链霉亲和素与共轭物所形成的复合物。
4.如权利要求1所述的检测套组，其特征在于共轭物为酵素或光敏物质。
5.如权利要求1所述的检测套组，其特征在于非结核分枝杆菌依伦永氏分类法选自由以下所组成的群组：光照产色菌、黑暗产色菌、非光照产色菌及快速生长结核分枝杆菌。
6.如权利要求5所述的检测套组，其特征在于非结核分枝杆菌选自以下所组成的群组：鸟型分枝杆菌、坎萨斯分枝杆菌及快速生长结核分枝杆菌。
7.一种用于检测鸟型分枝杆菌的检测套组，其特征在于包含：
a.SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；及
b.如SEQ ID NO：6所示，对鸟型分枝杆菌具专一性的核酸探针，
其中所述的核酸探针连接到可检测的标记上。
8.一种用于检测坎萨斯分枝杆菌的检测套组，其特征在于包含：
a.SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；及
b.如SEQ ID NO：7所示，对坎萨斯分枝杆菌具专一性的核酸探针，其中所述的核酸探针连接到可检测的标记上。
9.一种用于检测快速生长结核分枝杆菌的检测套组，其特征在于包含：
a.SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所组成的非结核分枝杆菌引物对；及
b.如SEQ ID NO：8所示，对快速生长结核分枝杆菌具专一性的核酸探针，
其中所述的核酸探针连接到可检测的标记上。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277440A (zh) * 2011-08-30 2011-12-14 浙江省疾病预防控制中心 结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法
CN102433384A (zh) * 2011-12-19 2012-05-02 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于检测分枝杆菌的引物和pcr-dhplc试剂盒
CN109468316A (zh) * 2018-12-10 2019-03-15 上海市肺科医院 一种基因序列组合物及其在制备分枝杆菌肺病检测试剂盒中的应用
CN113444782A (zh) * 2020-03-26 2021-09-28 台达电子工业股份有限公司 检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒
CN113684207A (zh) * 2021-09-23 2021-11-23 首都医科大学附属北京胸科医院 一种snp分子标记、pcr引物及应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI614345B (zh) 2012-06-22 2018-02-11 Taichung Veterans General Hospital 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法
CN108959850B (zh) * 2018-07-19 2020-07-17 奥然生物科技（上海）有限公司 一种自动化判定结核分枝杆菌基因突变的方法
TWI740427B (zh) * 2020-03-26 2021-09-21 台達電子工業股份有限公司 檢測非結核分枝桿菌的方法及其套組
CN112538542B (zh) * 2020-11-26 2022-11-22 中国医学科学院北京协和医院 用于龟分枝杆菌检测的试剂盒及系统
CN113817849A (zh) * 2021-09-07 2021-12-21 厦门飞朔生物技术有限公司 一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297670C (zh) * 2004-10-19 2007-01-31 中国人民解放军第三○九医院 结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法
CN1311085C (zh) * 2004-10-19 2007-04-18 中国人民解放军第三○九医院 分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备及其应用
FR2890978B1 (fr) 2005-09-20 2012-08-17 Hospices Civils Lyon Procede de detection, dans un echantillon biologique de mycobacteries, et en particulier de mycobacteries caracteristiques de la tuberculose.
CN100569956C (zh) * 2006-09-11 2009-12-16 中山大学达安基因股份有限公司 检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277440A (zh) * 2011-08-30 2011-12-14 浙江省疾病预防控制中心 结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法
CN102433384A (zh) * 2011-12-19 2012-05-02 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于检测分枝杆菌的引物和pcr-dhplc试剂盒
CN102433384B (zh) * 2011-12-19 2013-09-11 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于检测分枝杆菌的引物和pcr-dhplc试剂盒
CN109468316A (zh) * 2018-12-10 2019-03-15 上海市肺科医院 一种基因序列组合物及其在制备分枝杆菌肺病检测试剂盒中的应用
CN109468316B (zh) * 2018-12-10 2020-06-05 上海市肺科医院 一种基因序列组合物及其在制备分枝杆菌肺病检测试剂盒中的应用
CN113444782A (zh) * 2020-03-26 2021-09-28 台达电子工业股份有限公司 检测非结核分枝杆菌的方法、引物组及其试剂盒
CN113684207A (zh) * 2021-09-23 2021-11-23 首都医科大学附属北京胸科医院 一种snp分子标记、pcr引物及应用
CN113684207B (zh) * 2021-09-23 2024-01-09 首都医科大学附属北京胸科医院 一种snp分子标记、pcr引物及应用

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