CN102433384B

CN102433384B - 用于检测分枝杆菌的引物和pcr-dhplc试剂盒

Info

Publication number: CN102433384B
Application number: CN 201110427993
Authority: CN
Inventors: 陈茹; 高小博; 毕英佐; 刘志玲; 罗琼; 林志雄
Original assignee: Beijing Yingjiusi Sci & Tech Dev Co Ltd; Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Beijing Yingjiusi Sci & Tech Dev Co Ltd; Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-12-19
Also published as: CN102433384A

Abstract

本发明涉及一对用于检测分枝杆菌的引物，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。一种用于检测分枝杆菌的PCR-DHPLC试剂盒，包括：PCR缓冲液；检测分支杆菌的引物对；dNTP；MgCl₂；Taq DNA聚合酶；双蒸水；阴性对照：灭菌生理盐水；阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明提供了一种快速检测分枝杆菌感染的试剂盒及应用该试剂盒的PCR-DHPLC检测方法，其特异性好，灵敏度高，操作简单，高通量，对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实用意义。

Description

用于检测分枝杆菌的引物和PCR-DHPLC试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种分枝杆菌通用的PCR-DHPLC快速检测方法及试剂盒。

背景技术

分枝杆菌属(Mycobacterium)，除结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌外，统称为非结核分枝杆菌。据目前所知，自然界中有致病性和非致病分枝杆菌共200多种。

结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织(WHO)专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月24号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)是人及哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌(又称人型结核分枝杆菌，Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)，牛分枝杆菌(牛型结核分枝杆菌，Mycobacteriumbovis，M.bovis)，卡介苗BCG(Mycobacterium bovis BCG，BCG)，非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum，M.africanum)和田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicroti，M.microti)。其中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌为主要的人畜结核致病菌。

与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌，目前已发现上百种，广泛存在于土壤、环境、动物中。临床上，各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性；因此，鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。由于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性，因此准确鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。

2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳肺结核患者196万。分枝杆菌培养阳性者中，结核分枝杆菌占86.4％，牛结核分枝杆菌占2.5％，非结核分枝杆菌占11.1％。而1990年第三次全国结核病流调时非结核分枝杆菌仅占4.9％，由此可见，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。非结核分枝杆菌患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上，烦琐、费时，需1～2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治患者，细菌可能在局部播散。因此，分枝杆菌的快速鉴定对结核病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。

目前国内外用于诊断分枝杆菌的检验方法，大体上可分为3类：第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附实验(ELISA)和补体结合实验(CF)方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。

由于分枝杆菌生长缓慢，细菌分离培养周期长(常需数周时间)，传统的细菌学检查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求，也不利于疾病临床诊疗。皮内变态反应是世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病诊断方法，也是目前在进出境动物检疫、牛结核病疾病防控、根除等方面常采用的方法，但由于试剂质量以及非典型分枝杆菌的干扰等原因，常造成非特异性反应。ELISA和CF方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议，国内目前尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展，国内外众多实验室开展了结核、副结核PCR方法研究，但检测方法和试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果准确性的关键。世界卫生组织于2006年10月发表报告指出，世界迫切需要投资研究更有效和费用更低的结核病诊断方法，尽早发现病情尽早治疗，以减少这种疾病对人类、特别是对发展中国家人口的危害。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一组检测分枝杆菌的核苷酸序列。

本发明的又一目的在于，提供一种针对分枝杆菌的检测试剂盒，具体而言，提供一种分枝杆菌PCR-DHPLC检测试剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一对用于检测分枝杆菌的引物，其特征在于，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

一组用于检测分枝杆菌的核酸，其特征在于，该组核酸包括核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对，以及作为阳性对照的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的PCR扩增产物；

一种用于检测分枝杆菌的PCR-DHPLC试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

PCR缓冲液；

检测分支杆菌的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

检测分支杆菌的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

dNTP；

MgCl₂；

Taq DNA聚合酶；

双蒸水；

阴性对照：灭菌生理盐水；

阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

如上所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在应用时，按照以下终浓度配置PCR反应液：

10×PCR缓冲液；

0.2μmol/L检测分支杆菌的上游引物；

0.2μmol/L探针；

0.2mmol/L dNTP；

2.5mmol/L MgCl₂。

通过对引物、Mg²⁺浓度、Taq酶浓度以及PCR变性和退火温度的优化，建立了最适的PCR反应体系和PCR反应条件。PCR-DHPLC检测试剂盒最适PCR反应体系见下表1。

表1PCR-DHPLC检测试剂盒最适PCR反应体系

第一步：50℃2分钟；第二步：95℃5分钟；第三步：95℃5秒，62.5℃20秒，72℃20秒，35个循环；第四步，72℃5分钟。

DHPLC检测条件如下：

将上述PCR产物按照进行DHPLC分析，柱温为50℃，DHPLC洗脱条件是：

时间	缓冲液A(％)	缓冲液B(％)	缓冲液D(％)
				0	46.3	53.7	-
0.5	41.3	58.7	-
				5	32.3	67.7	-
5.1	0	0	100
				5.6	0	0	100
5.7	46.3	53.7	-
				6.6	46.3	53.7	-

其中，缓冲液A的成分为0.1mol/L TEAA，缓冲液B为0.1mol/L TEAA加入25％(V/V)乙腈，缓冲液D为75％(V/V)乙腈。

本发明结果判定标准：样品的洗脱峰与阳性对照的洗脱峰位置一致，且阴性对照无相应的洗脱峰，则样品为阳性。

本发明试剂盒的具体使用步骤：

(1)采集样品，提取核酸：本发明可检测细菌培养液、动物活体采集的样品如血液、奶液、痰液和粪便等，以及通过剖检采集的组织样品，如淋巴结等。采用蛋白酶K消化，高温裂解、氯仿抽提等步骤从上述样品中提取核酸。

(2)加样及PCR扩增：按上述反应液体系，在反应管中分别加入反应液和核酸，记录样品编号和对应管号，放入PCR仪中扩增。

(3)上机检测：在DHPLC仪器上，按设定条件进行检测。

(4)分析、判定结果。

本发明的有益效果在于，

本发明提供了一种快速检测分枝杆菌感染的试剂盒及应用该试剂盒的PCR-DHPLC检测方法，其具有以下特点：

(1)特异性好，16s rRNA引物具有种属特异性，具有很高的准确性，假阳性率低；

(2)灵敏度高，采用灵敏的紫外或荧光检测系统进行检测；

(3)操作简单，自动化程度高，替代了传统的产物电泳检测等步骤；

(4)高通量，一次可以检测192份样品。

本发明提供的快速检测试剂盒及方法，适用于医疗和公共卫生、动物分枝杆菌疫病疫情防控、食品安全以及诊断和流行病学调查领域对分枝杆菌感染的快速检测、监控和防治，对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实用意义。

下面结合附图和具体实施方式对本发明发明作进一步说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为采用本发明试剂盒对人痰液样品的检测图。

图2为采用本发明试剂盒特异性实验检测图。

图3为采用本发明试剂盒对阳性质粒模板的敏感性实验检测图。

具体实施方式

本发明方法采用PCR-DHPLC快速检测分枝杆菌，其具体原理为，根据16SrRNA在分枝杆菌属的序列保守性，设计特异性的分枝杆菌属引物进行PCR扩增，然后再结合DHPLC(变性高效液相色谱技术)进行分析，所建立的方法可用于快速检测分枝杆菌感染。DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过专利的DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测或荧光检测被分离的DNA样品。DHPLC在非变性条件分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序。分子量较小的核酸片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质，而分子量较大的片段则含有较多的磷酸盐基团结合柱基质。因此，当将过柱的乙腈浓度提高，核酸片段就会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。产物分子量的1％大小的片段能够被分离。PCR-DHPLC方法具有快速、灵敏、特异性强的优点。

实施例1：分枝杆菌PCR-DHPLC试剂盒引物的制备

根据分枝杆菌属特异性16s rRNA的300bp序列，选择其中的一条序列(GeneBank No.CP000611)，采用DNAman 5.0软件，根据引物的退火温度在60℃左右，设计出序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的引物对：

上游引物(引物I)SEQ ID No.1：TAACT GTGAG CGTGC G；

下游引物(引物II)SEQ ID No.2：GGCAC GGATC CCAA。

Blast同源性分析显示，选择的引物，其序列为分枝杆菌属的特异性序列，与其它序列无同源性。引物扩增产物的长度为240bp，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示：

TAACTGTGAGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCC。

引物委托大连宝生物工程技术有限公司合成。

实施例2：分枝杆菌PCR-DHPLC试剂盒PCR检测反应体系的建立和优化

一、方法

1.引物浓度的优化

实验中将引物浓度从0.1μmol/L开始，以0.1μmol/L的幅度递增，直至0.6μmol/L，采用矩阵法进行对比实验，对比实验的其它条件完全一致。

2.Taq DNA聚合酶(Taq酶)的优化

Taq酶一个单位的定义：在74℃下作用30分钟，能将10μmol/L的dNTP掺入酸溶性物质中所需要的酶量。

在固定其它反应成分不变的情况下，采用不同酶量(5U、4U、3U、2U和1U)进行优化，根据实验结果和成本，最后选定2U最为PCR反应的酶量。

3.Mg²⁺浓度的优化

Mg²⁺会影响PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其它反应成分不变的情况下，采用Mg²⁺浓度梯度，对Mg²⁺浓度进行了优化，Mg²⁺浓度从1.5mmol/L开始，以0.5mmol/L的幅度递增，直至6mmol/L。

4.PCR反应条件的优化

为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物退火温度，以60℃为基础，以0.5℃递加，直到65℃，在此基础上进行退火温度优化。

采用的反应体系如下：

在Biometra PCR仪上进行扩增，按如下反应条件设置：第一步50℃，3分钟；第二步94℃，5分钟；第三步94℃，5秒，60-65℃，20秒，72℃，20秒，35个循环；第四步72℃5分钟。Biometra PCR仪具备梯度PCR功能，可以同时进行温度梯度实验。

二、结果

1.引物浓度的优化

多次重复实验中引物浓度为0.2μmol/L，作为分枝杆菌PCR-DHPLC试剂盒的引物浓度。

2.Taq酶的优化

Taq酶用量(以单位Unit计，简写U)的优化实验在相同反应条件，但酶的用量不同的条件下进行，根据实验结果选定2U作为酶的最适用量。

3.Mg²⁺浓度的优化

结果表明Mg²⁺浓度越低，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降；反之Mg²⁺浓度越高，扩增效率有所提高，但特异性受到影响。本发明最终选定的实际Mg²⁺浓度为2.5mmol/L。

4.PCR反应条件的优化

结果表明退火温度越高，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降；反之退火温度越低，扩增效率有所提高，但特异性有所降低。本发明最终选择62.5℃作为实际的退火温度，保证特异性和扩增效率的组合能够达到最优。

实施例3：分枝杆菌PCR-DHPLC检测试剂盒

试剂盒包括如下组分，保藏温度为-20℃；

PCR缓冲液；

引物I，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

引物II，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

dNTP；

MgCl₂；

Taq DNA聚合酶5U/μL；

双蒸水；

阴性对照：灭菌生理盐水；

阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA。

本发明试剂盒在应用时，PCR反应液终浓度配制成：10×PCR缓冲液；0.2μmol/L引物I；0.2μmol/L引物II，0.2μmol/L探针；0.2mmol/L dNTP，MgCl₂2.5mmol/L。

阳性对照的制备方法：

采用引物I和引物II，以结核分枝杆菌的DNA为模板进行PCR扩增，回收并纯化PCR产物，与pEASY-Blunt平端载体(购于北京全式金生物技术有限公司)连接，并转化大肠杆菌，采用常规PCR和测序对重组质粒进行验证。重组质粒分别命名为pEASY-16s将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后，采用质粒提取试剂盒(购于大连宝生物工程有限公司)纯化重组质粒DNA，测OD260吸光度值，根据公式：质粒拷贝数/μL＝{总含量(μg/μL)}/{质粒分子碱基数×10-15μg}换算成对应基因拷贝数。将纯化后的质粒稀释到20000拷贝/mL，作为试剂盒的阳性对照。

实施例4：本发明试剂盒检测临床样品

一、样品采集

痰：牛咯痰极少，宜在清晨采集用橡胶管自口腔伸入至气管内，外锻连接注射器吸取痰液。亦可取出牛咳出的痰块。人痰样采集按医院常规操作。

二、样本的处理

痰的处理方法：(1)在样本中加入2～3倍于样本体积的4g/L的NaOH溶液，摇匀，室温液化20min，使其充分液化；无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4g/L的NaOH溶液直至液化完全。(2)取样本1.5mL，10,000rpm离心10min，弃上清。(3)加灭菌生理盐水1mL，充分振荡混匀使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。(4)重复一次步骤(3)。(5)加入50μLDNA提取液，振荡混匀，4,000rpm离心5秒，56℃温浴30min，后98℃温浴10min。(6)4,000rpm离心5秒，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10,000rpm离心10min。(7)取上清，直接用于PCR或贮存于-20℃备用。

三、扩增检测

1.扩增试剂准备

取出按照实施例2配制的PCR反应液，在室温下融化后，6000rpm离心5秒，配制PCR反应混合液，每25μL混合液中包含PCR反应液24.6μL和Taq酶0.4μL，需配制的反应混合液的份数＝样本个数+阴性对照+阳性对照。

将以上PCR反应混合液按照使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装25μL。

2.加样

在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸，盖上管盖，将PCR管放入PCR仪内，记录样本放置顺序。

3.PCR扩增检测

反应条件设定：第一步：50℃，3分钟；第二步：95℃，5分钟；第三步：每个循环依次为94℃，5秒，62.5℃，20秒，72℃，20秒，共35个循环；第四步：72℃，5分钟。

4.DHPLC检测

将PCR产物放入DHPLC仪器的托盘内，按以下条件进行检测：

四、分析条件设定和结果判定

(1)质控标准：阴性对照为阴性，无特异性的洗脱峰，阳性对照的有特异性的洗脱峰一个。否则，此次实验视为无效。

(2)结果分析及判定：无特异性洗脱峰的样本为阴性样本，存在与阳性对照的洗脱峰位置一致的样品为阳性。

五、对临床样品的检测实例

按上述样品处理和PCR-DHPLC检测方法，采用本发明试剂盒，对门诊人群的痰液样品进行检测实验，结果检出多例阳性样品，具体如图1所示。实施例5：本发明试剂盒的特异性和敏感性实验

一、方法

1.特异性实验

提取培养的结核分枝杆菌标准菌株与临床分离株、牛分枝杆菌标准菌株、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、龟、蟾、草、堪萨斯、胞内、耻垢、胃、瘰疬、偶发分枝杆菌等共25种分枝杆菌菌种、以及23种各种环境微生物菌株样品和含PCR扩增模板的阳性重组质粒进行检测实验。本实验用分枝杆菌菌种见下列附表。

表1特异性实验分枝杆菌菌株列表

其中，23种环境微生物菌株样品：鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50115)、奇异变形杆菌(CMCC 49003)、威尔氏李斯特菌(ATCCF 35897)、格式李斯特菌(ATCC 25401)、表皮葡萄球菌(CMCC 26906)、产气肠杆菌(CMCC 45103)、宋内氏志贺氏菌(CMCC 51334)、乙型溶血链球菌(CMCC 32210)、绿脓杆菌(CMCC AS 1.0212)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、肠致病性大肠埃希氏菌(ATCC 43887)、产肠毒素大肠埃希氏菌(ATCC 35401)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(ATCC 43893)、普通变形杆菌(CMCC AS1.1527)、金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC9610)、空肠弯曲菌(ATCC 33560)、溶藻弧菌(ATCC 17749)、阪崎肠杆菌(ATCC 29544)、大肠杆菌0157:H7(ATCC 12900)、珊瑚链霉菌(ATCC 23901)和砖红链霉菌(ATCC 19776)均源自ATCC或中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC)的标准菌株。

2.敏感性实验

采用引物I和引物II，以结核分枝杆菌的DNA为模板，分别进行PCR扩增，回收并纯化PCR产物，与pEASY-Blunt平端载体(购于北京全式金生物技术有限公司)连接，并转化大肠杆菌，采用常规PCR和测序对重组质粒进行验证，重组质粒分别命名为pEASY-MT。将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后，采用质粒提取试剂盒(购于大连宝生物工程有限公司)纯化重组质粒DNA，测OD260吸光度值，根据公式：质粒拷贝数/μL＝{总含量(μg/μL)}/{质粒分子碱基数×10-15μg}换算成对应基因拷贝数。将质粒DNA采用无RNase，无DNase水进行10倍系列稀释，取各稀释度样品5μL，采用本发明试剂盒按照实施例3描述的扩增检测步骤进行检测实验，以测试试剂盒的检测灵敏度(基因拷贝数)。

二、结果

1.特异性实验：本发明试剂盒对25种分枝杆菌标准菌株与临床分离株以及重组质粒pEASY-MT均呈典型阳性反应，检测结果与理论推导相符，具体如图2所示。对23种环境微生物菌株样品采用本发明试剂盒按照实施例4描述的扩增检测步骤进行检测实验，结果显示均呈典型阴性反应。表明本发明试剂盒检测特异性强。

2.敏感性实验：检测结果显示，本发明试剂盒的检测灵敏度可达10¹⁰质粒稀释度，相当于8.5个基因拷贝，具体如图3所示。

Claims

1.一对用于检测分枝杆菌的引物，其特征在于，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.一组用于检测分枝杆菌的核酸，其特征在于，所述的核酸为分枝杆菌属共有的核酸序列，该组核酸包括核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对，以及作为阳性对照的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的PCR扩增产物。

3.一种用于检测分枝杆菌的PCR-DHPLC试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

PCR缓冲液；

检测分支杆菌的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

检测分支杆菌的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

dNTP；

MgCl₂；

Taq DNA聚合酶；

双蒸水；

阴性对照：灭菌生理盐水；

阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在应用时，按照以下终浓度配置PCR反应液：

10×PCR缓冲液；

0.2μmol/L检测分支杆菌的上游引物；

0.2mmol/L dNTP；

2.5mmol/L MgCl₂。