CN103215362A - TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术联合检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的方法学建立 - Google Patents
TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术联合检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的方法学建立 Download PDFInfo
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Abstract
Taq Man/MGB探针PCR技术可对粪便基因组中艰难梭菌进行菌属鉴定，同时检测毒素基因携带情况，并可判断A毒素是否存在缺失。粪便标本无需纯培养，在一个反应体系内完成菌株鉴定及毒素检测。本方法具有操作简单、重复性好、高通量检测标本、报告时间短等特点，适用临床不明原因腹泻病人病因筛查。本发明解决的技术问题是，粪便标本无需纯培养即可同时进行菌属鉴定及菌株毒素携带情况筛查，提供一种高敏感性的粪便基因组DNA中检测方法。由于传统厌氧培养不易开展，酶免方法存在方法学缺陷，该发明将明显提高艰难梭菌相关性腹泻的诊断率。同时也可用于上述疾病治疗过程中的用药监测。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种新型艰难梭菌菌属基因及毒素基因的检测方法，具体采用TaqMan/MGB探针技术，通过Real-TimePCR分析系统快速进行粪便基因组DNA扩增和荧光信号检测，同时完成艰难梭菌菌属鉴定，A、B毒素基因检测及鉴别A毒素是否存在缺失。
背景技术
艰难梭菌一直是引起医源性腹泻的主要病原体，由于广谱抗生素的大量使用以及高毒力株027/NAP1/BI(核酸分型为027，脉冲场凝胶电泳分型为NAP1，限制性内切酶分型为BI)的出现和流行，全球特别是欧洲和北美CDI的流行暴发迅速增多，严重病例数、复发率和病死率均明显上升，耐药菌株也在增多，给该病的临床诊断和治疗提出新的挑战。
诊断CDI的早期临床诊断须结合患者的不成形便和特殊气味及2个月内的抗生素使用史，或者接受鼻饲等医疗设备治疗72h后出现腹泻。目前，实验室检测艰难梭菌的方法主要为细菌的厌氧培养，通过对疑似菌落进行生化鉴定确定细菌种属。而常规厌氧培养除需要昂贵的厌氧设备，该方法对标本留取也具有极其严格的要求(标本离体后必须放置在厌氧环境中，在有氧环境下，标本离体后30min几乎100％培养阴性)，而生化鉴定比较繁琐，更须具备较好的技术与经验。有时由于区分菌株的生化鉴定结果的一致性不好以及存在个别的非典型菌株，可能会造成分离菌株的错误鉴定。除上述经典方法外，目前一些实验室也采用酶免疫方法检测艰难梭菌毒素，虽然该方法操作简便快速，但受到灵敏度不高和存在交叉反应等限制。质谱检测厌氧菌方便快速准确，但仪器成本与荧光定量PCR仪相比较昂贵，其最大的问题是需要将标本纯培养后获得单个菌落进行检测。基于PCR检测艰难梭菌的方法大多数为普通PCR扩增加琼脂糖凝胶电泳进行测定，方法操作繁琐。采用RT-PCR进行检测，且菌属鉴定与毒素筛查同时进行的方法国内未见报道。
临床艰难梭菌相关性腹泻患者分离出的菌株通常可产生A和B两种毒素。但是，临床分离的部分菌株为A-B+菌株，其A毒素编码基因存在部分缺失，导致A毒素无法使用常规的酶标免疫学方法检测出来。由于B毒素潜在的肠毒素活性或与其他毒素联合作用，该种A-B+菌株仍然可以导致严重的艰难梭菌相关性腹泻。由于厌氧菌检测不易开展，国内未见大规模详细的流调资料。仅上海，北京两地医院对艰难梭菌或耐药性、或毒素携带方面做过单一调查。中国上海医院的一项研究显示，在分离出的初次感染的56株艰难梭菌产毒株中，有13株A-B+菌株，比例为23.2％。程颖等人报道在分离出的8株艰难梭菌产毒株中，有3株A-B+菌株，比例为37.5％。研究也表明，A-B+菌株对克林霉素的耐药性高达85％，较A+B+菌株 对克林霉素的耐药性显著增高。由此可见，A-B+菌株在中国具有发病比例高，隐蔽性强，耐药性高的特点，对临床科室的危害性更为严重。提高并改进临床实验室对艰难梭菌的检测，建立一种无需培养、方便、快捷、可操作、高通量、易于开展的艰难梭菌诊断方法，尤其是可对A-B+型艰难梭菌进行筛查势在必行。
发明内容
本发明专利需要解决的技术问题是，粪便标本无需纯培养，直接提取粪便基因组DNA，同时进行菌属鉴定及菌株毒素携带情况检测。本发明专利主要采用了TaqMan/MGB探针技术，通过Real-Time PCR分析系统建立了一种快速、简便、高通量、一次性检测粪便基因组DNA中艰难梭菌菌属鉴定、毒素携带情况及A毒素是否存在缺失的方法。
具体实施方式
1.基因库检索，序列比对，筛选特异序列
2.设计探针及引物。
3.优化反应条件。
4.PCR反应体系中各种试剂的浓度配制。
5.对建立的TaqMan/MGB探针PCR技术进行验证，从检测特异度、灵敏度及其抗干扰性等方面评价该检测方法。
6.通过对临床不明原因腹泻病人粪便基因组艰难梭菌菌属鉴定及毒素携带情况筛查，与传统菌属鉴定及毒素检测的酶免疫方法比对，评价本发明专利的准确性及优势。
Claims (5)
1.本发明是一种方便、快速、高敏感性的在粪便基因组DNA中直接检测艰难梭菌菌属基因磷酸丙糖异构酶(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的方法，其技术核心为TaqMan/MGB探针结合实时荧光定量PCR技术，包括：基因库检索，tpi、tcdA、tcdAt、tcdB特异性序列比对，筛选特异序列，引物和探针设计，PCR反应参数优化。其特征在于：粪便标本无需纯培养，直接检测粪便DNA中艰难梭菌tpi、tcdA、tcdAt和tcdB基因，可从菌属鉴定、毒素鉴定及A毒素是否有缺失3个方面对艰难梭菌进行同时鉴定判断，具有灵敏度高、特异性强，检测时间短(1.5小时)、操作简单、重复性好、高通量等特点。
2.根据权利要求1所述本发明是检测艰难梭菌菌属基因(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的新方法，其特征在于：基因库检索，序列比对，引物及探针的自主设计，并以TaqMan/MGB探针作为检测信号。
3.根据权利要求2所述，其特征在于：引物和探针的合理设计，PCR反应体系中各种试剂的浓度配比，以及循环参数及变性温度的设定。
4.根据权利要求1所述的方法，对艰难梭菌菌属基因(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT检测，具有敏感度高、特异性强的特点，其特征在于：TaqMan-MGB探针能够区分一个碱基的差别，只有完全配对，才有荧光检测信号。其优势与常规real-timePCR相比即灵敏又特异。
5.根据权利要求1所述的方法，具有检测时间短(1.5小时)、操作简单、重复性好、高通量等特点，其特征在于：采用粪便基因组DNA直接进行检测，标本易留取，不用培养，且在一个反应体系内完成菌属鉴定及菌株毒素携带情况检测，同时可判断菌株是否为A毒素缺失株。
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