CN102108398A - 结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法，设计对结核分枝杆菌进行定性、定量检测的引物、自身淬灭探针，引物的上游引物为5’-ACTCCATGGGATACGGCCCAGACTCCT-3’，下游引物为5’-CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3’，自身淬灭探针的上游引物为5’-cgcgCTCGTAGGTGGTTTGTCGC(FAM)G-3’，下游引物为5’-CCCGCACGCTCACAGTTAAG-3’，上游引物3’端最后一个碱基为G，在3’端的第二个碱基为C，在这个C上标记荧光物质FAM，在探针的5’端引入几个和3’末端互补的碱基(cgcg)以便自身配对形成发夹结构。通过提取待测样品的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中结核分枝杆菌DNA的目的。

Description

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。

背景技术

结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现暴发流行，且呈增长的趋势。据WHO报道，全世界有2000万结核病人，每年有800-1000万新增病例，300万人死于结核病。在我国目前有肺结核病人600多万，每年死于结核病人达25万之多，亦呈增长的趋势。结核病已成为21世纪严重危及人类健康的疾病之一，快速、可靠的实验技术对于有效控制结核病显得至关重要，已成为国内外研究的重点。

目前，结核病的诊断标准仍然是临床检查结合细菌培养和痰涂片直接镜检，但是结核分枝杆菌的培养需4-8周，周期太长且有约10％-20％的病例培养失败，涂片虽简单易行，但阳性率低，传统的结核菌素皮肤试验由于接种卡介苗(BCG)等的影响导致特异性不好，均难以满足临床需要。

近年来，作为直接检测分枝杆菌、种系鉴定和药敏试验的许多分子生物学方法得到长足发展，这些方法能将诊断时间从几周大大缩短到几天甚至几小时。其中，实时荧光定量PCR(FQ-PCR)因其技术成熟具有较高的灵敏度和特异性，已逐渐应用于临床。而且，从定性检测迈上了可以量化的台阶，它的技术更先进，操作更便捷，利用荧光定量PCR技术能达到实时监测、绝对定量和快速检测的目的，它与核酸分子杂交等技术一起领导着基因诊断的发展趋势，目前已经广泛应用于临床检验的多项指标中。开发结核分枝杆菌荧光定量PCR试剂盒，将能定量检测结核分枝杆菌DNA的拷贝数，不但可以为临床提供更准确和更有价值的诊断信息，还可为临床上的疗效观察、用药剂量、用药时间等提供依据。国家卫生部已开禁荧光定量PCR检测结核分枝杆菌、HBV等6种病原体。因此实时荧光定量PCR是一个可以商业化的高技术平台，从技术的角度来看，进行商业化开发比基因芯片、蛋白质芯片更加成熟。

现有的结核分枝杆菌荧光定量PCR诊断试剂盒产品主要为广州达安、深圳匹基等公司利用国外Roche公司Taqman探针技术开发，这种技术除了扩增引物以外还需要单独合成Taqman探针，该探针必须要分别标记荧光基团和淬灭基团，Taqman探针合成以及其进行的双标记价格昂贵，给病人带来了极大的经济压力。另外现有的试剂盒都还存在一些问题，会受到非结核分枝杆菌、BCG及结核分枝杆菌变异等的影响，再加上DNA提取方法常采用酸碱消化法，使得有时由于消化不彻底，影响DNA提取，造成一定的假阳性和假阴性。因此，如何降低成本，提高试剂盒的诊断灵敏度和特异性，是目前亟待解决的一个重要问题。

而自身淬灭探针技术(self-quenched probe)则为我们提供了一种既能降低成本又不影响检测效果的方法。本研究拟采用结核分枝杆菌16s rRNA作为靶序列，rRNA是与核糖体蛋白结合的RNA分子，是细菌和真核细胞核糖体基本成分，16s rRNA约1500个核苷酸组成，内含二个高度可变区，129～267位核苷酸A可变区，430～500位核苷酸B可变区。其为分枝杆菌属菌种共有，既高度保守又有高度多态性序列，既含属特异性位点，又有种特异性位点，可作为分枝杆菌属及各种分枝杆菌属种鉴定靶基因，这将在特异性方面有所提高，另外我们将摸索标本的前处理方法使标本消化效果更有利于结核分枝杆菌DNA的提取。

自身淬灭探针技术是2002年研究开发出的一种荧光定量PCR技术，它的主要特点是在保证高灵敏度和高特异性的前提下，能够极大的降低成本(仅为Taqman探针技术的50％)，该技术只需要一对扩增引物，引物中的某一条3’端经过荧光标记(该引物即为自身淬灭探针)，同时自身淬灭探针5’端连接有几个和3’自身配对的碱基，自身淬灭探针是通过自身构象的变化实现荧光信号的淬灭和荧光信号的产生。

PCR开始前引物处于游离状态，自身淬灭探针5’端和3’端自身配对，形成发夹结构，这种结构的构象可以导致标记的荧光物质发生淬灭，此时荧光信号很弱，当PCR反应开始后，自身淬灭探针在变性温度下解链，形成单链结构，在退火阶段，自身淬灭探针和模板杂交，并进行延伸反应，引物(自身淬灭探针)延伸导致其构象发生变化，荧光淬灭效应减弱，此时可以产生强烈的荧光信号，随着PCR反应进行，有更多的自身淬灭探针构象发生改变，荧光信号也不断增强。由于该技术只需要合成一对引物(其中一条引物即为自身淬灭探针)，因此在反应体系的优化上将比较容易，而且它只需要一个荧光基团标记，不需要淬灭基团，可以极大的节约试剂的成本，更适宜临床采用。

国外利用自身淬灭探针技术已成功进行了多重荧光定量，在技术上已比较成熟，申请者已利用该技术完成了淋病奈瑟氏菌实时荧光定量PCR试剂盒的开发，现正处于专利申请阶段，技术风险不大。从商业的角度看，在利用荧光定量PCR技术开发的诊断试剂中，仅有Taqman方法在国内有专利。自身淬灭探针技术才建立不久，国内外尚无利用该项技术开发诊断试剂的报道，进行产业化开发具有很好的前景。荧光定量PCR技术在目前基因诊断中占有重要的地位，但Taqman方法昂贵的试剂使病人承受困难，市场急需一种既稳定、价格又低廉的试剂。自身淬灭探针能够降低试剂成本，其检测效果不亚于其他方法，比Taqman方法可以节约50％的成本，以100元/人为例，每年检测20万人，可以创产值2000万，而且由于自身淬灭技术的成本只有Taqman技术的一半，实际节约成本达500万。因此，这对于广大患者来说是福音。目前结核病的发病率很高，因此，本项目具有广阔的应用前景，其较低的成本、良好的检测效果将可以满足市场对更好性价比的结核分枝杆菌荧光定量PCR试剂盒的要求。

发明内容

本发明的目的是利用自身淬灭探针技术建立一种能广泛应用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉和稳定性较好的新型结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。本发明采用基因克隆技术，将结核分枝杆菌16s rRNA基因片段插入到载体PET-32a(+)中，获得含有16s rRNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据结核分枝杆菌16s rRNA的基因片段编码基因序列设计合成自身淬灭引物，优化PCR条件，建立以自身淬灭引物技术为平台的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法，并对所建立的方法进行方法学评价。最后用该方法对临床收集的疑为结核分枝杆菌感染的患者标本进行检测并和培养方法进行比较。

本发明通过以下技术方案予以实现：提供一对用于结核分枝杆菌(TB)进行定性检测的引物，用于标准品的制备。

本发明所提供的引物，其上游引物为5’-ACTCCATGGGATACGGCCCAGACTCCT-3’(含NcoI位点)，下游引物为5’-CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3’(含HindIII位点)。

由上述引物衍生的引物序列属于本发明保护的范围，适用于结核分枝杆菌常规PCR的检测，其检测对象是结核分枝杆菌(TB)的16s rRNA基因，提取结核分枝杆菌基因组DNA，用作16s rRNA基因PCR扩增的模板，在上述引物的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有365bp大小的条带，则样本中含有TB。

本发明还提供了用于对结核分枝杆菌进行定量检测的自身淬灭探针，利用探针自身构象变化来实现荧光信号淬灭。

本发明所提供的自身淬灭探针，其上游引物为5’-cgcgCTCGTAGGTGGTTTGTCGC(FAM)G-3’，下游引物为5’-CCCGCACGCTCACAGTTAAG-3’，上游引物3’端最后一个碱基为G，在3’端的第二个碱基为C，在这个C上标记荧光物质FAM，在探针的5’端引入几个和3’末端互补的碱基(cgcg)以便自身配对形成发夹结构。

上述自身淬灭探针序列的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列是指在上游引物或下游引物的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。

本发明的第三个目的是提供一种检测结核分枝杆菌的新型实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明所提供的检测结核分枝杆菌的新型新型实时荧光定量PCR试剂盒，包括用于对结核分枝杆菌进行定性、定量检测的的引物和自身淬灭探针。

本发明提供用于对结核分枝杆菌进行定性、定量检测的引物和自身淬灭探针，通过提取待测样品的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中结核分枝杆菌DNA的目的。本发明所提供的引物及探针可用于临床及科研中对感染结核分枝杆菌的患者中的结核分枝杆菌DNA进行定性及定量分析，对判断结核分枝杆菌感染的发生、治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。本发明将在临床医学检测领域发挥重要作用。

下面结合附图以及具体实施方案对本发明作更加详细的阐述。

附图说明

图1为自身淬灭引物原理示意图。

图2为PCR扩增16s rRNA基因片段电泳结果。

图3为PCR快速鉴定可疑菌落电泳结果。

图4为重组质粒经Nco I和HidIII双酶切电泳结果。

图5为重组质粒PCR扩增后电泳结果。

图6为重组质粒中16s rRNA基因原始测序结果。

图7为荧光定量PCR标准曲线。

图8为灵敏度实验的标准曲线。

图9为低拷贝样品批内重复性荧光定量PCR扩增曲线。

图10为高拷贝样品批内重复性荧光定量PCR扩增曲线。

图11为特异性实验扩增曲线。

图12为FQ-PCR检测病人标本的扩增曲线。

图13为FQ-PCR检测病人标本的标准曲线，图中的三角点代表标准品(质粒)；圆点代表临床标本。

具体实施方式

下述实验例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物和所有序列测定工作均由上海生工合成，所用自身淬灭探针由美国Invitrogen公司合成。

实例一16s rRNA基因标准品的制备

要建立荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，以保证反应的高特异性。本研究拟采用结核分枝杆菌16s rRNA作为靶序列，其为分枝杆菌属菌种共有，既高度保守又有高度多态性序列，既含属特异性位点，又有种特异性位点，可做为分枝杆菌属及各种分枝杆菌属种鉴定靶基因。本部分主要采用PCR技术扩增结核分枝杆菌16s rRNA基因，将其克隆入质粒载体PET-32a(+)中，构建出重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA，进行相应的酶切鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法建立及评价奠定基础。

一、模板DNA的制备

1.提取结核分枝杆菌(标准菌株)基因组DNA，用作16s rRNA基因PCR扩增的模板

(1)细菌的消化：将1ml菌液9000g离心15秒，弃上清。在细菌沉淀中加入40ul Lysozyme反应液(含25mg/ml的Lysozyme 160ul和RNaseA 20ul)。彻底振荡悬浮，37℃温水浴30～60分钟。

(2)加入400ul裂解液(试剂盒自带)和25ul proteinase K，迅速振荡混匀，置65℃温水浴15～30分钟，期间来回颠倒离心管数次，9000g离心1分钟后，取上清液至另外一离心管中。

(3)加入200ul异丙醇，剧烈颠倒离心管使溶液混匀后，移取600ul至吸附柱中，9000g离心30秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，将剩余的全部液体移至吸附柱中，9000g离心30秒，弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(4)加入500ul洗涤液，静置1分钟后，9000g离心30秒。

(5)将吸附柱移入另外一干净收集管中，加入500ul洗涤液，9000g离心15秒。

(6)弃去收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，9000g离心1分钟。

(7)将吸附柱移入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入100ul洗脱液，65℃静置5分钟，9000g离心1分钟，将提取得到的DNA置-20℃保存。

二、16s rRNA基因片段的PCR扩增

1.引物的设计与合成

根据Pub-Med上基因库中报道的结核分枝杆菌基因组DNA序列中的16s rRNA的基因序列，由上海生物工程有限公司设计合成PCR引物，扩增片段预期大小为365bp，引物序列如下：

上游：5’-ACTCCATGGGATACGGCCCAGACTCCT-3’(含NcoI位点)

下游：5’-CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3’(含HindIII位点)

2.PCR反应体系和反应条件

(1)反应体系

PCR反应体系

(2)反应条件

94℃预变性3分钟；94℃30s，63℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10分钟。取1ul扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增结果。

3.PCR产物纯化(DNA胶回收试剂盒)

(1)根据欲回收的PCR产物的量确定加样孔的大小，灌制1％琼脂糖凝胶。

(2)将待分离的PCR产物点样电泳，于适当位置停止电泳。

(3)在长波紫外线灯下切下含有该目的片段的凝胶，移入1.5ml EP管。

(4)按每100mg琼脂糖加入300mg S1液的比例加入S1液，置50℃水浴10min，每2min颠倒混匀一次。

(5)加入1/3S1液体积的异丙醇，混匀，50℃水浴1min，混匀。

(6)将熔化的琼脂糖液移入吸附柱，9000g离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。

(7)在吸附柱中加入500ul W1液，9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体。

(8)再在吸附柱中加入500ul W1液，静置1min，9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体。

(9)9000g离心1min。

(10)将吸附柱放入一个干净的1.5m EP管中，在吸附膜中央加入30ul T1液，静置1min后9000g离心1min，-20℃保存备用。

三、重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA的构建和转化

1.质粒PET-32a(+)的提取

(1)将-70℃冻存的装有质粒PET-32a(+)的大肠埃希氏菌DH5α复苏，划线接种于LB氨苄西林平板，37℃培养18～24小时。

(2)自LB平板上挑取单个菌落接种于3ml LB液体培养基中，并加入氨苄西林至100ug/ml，37℃250rpm摇床培养至饱和状态。

(3)取1.5ml培养液5000g离心2min，彻底去除上清液，在细菌沉淀中加入250ul P1液，振荡至彻底悬浮。

(4)加入250ml P2液，立即温和颠倒混匀，室温静置4min。

(5)加入350ul P3液，立即温和颠倒混匀，4℃9000g离心5min，将上清液小心移到另一个EP管中，再9000g离心10min。

(6)将上清液移入吸附柱中，9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体。

(7)在吸附柱中加入500ul B1液，9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。

(8)在吸附柱中加入5000ul W1液，9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。

(9)再在吸附柱中加入500ul W1液，静置1分钟后9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体，9000g再离心1分钟。

(10)将吸附柱放入一个干净的1.5ml无菌EP管中，在吸附膜中央加入40ul T1液，37℃水浴2min。9000g离心1min，将所得质粒于-20℃保存备用。

(11)1％琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。

2.质粒PET-32a(+)的酶切

用NcoI和HindIII对质粒PET-32a(+)进行双酶切，设计50ul酶切反应体系：

NcoI和HindIII对质粒PET-32a(+)进行双酶切

37℃反应4小时后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收酶切片段。

3.质粒PET-32a(+)酶切片段的胶回收

(1)将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外光下用割胶器迅速割取含有目的条带的，尽可能下体积的凝胶块，放入一已称重的EP管中，再次称重后算得凝胶的重量。

(2)按每100mg琼脂糖加入300ul S1液的比例加入S1液，65℃水浴10min，每2min颠倒混匀一次确保琼脂块的充分溶解。

(3)将熔化后的液体移入吸附柱，9000g离心1min，倒掉收集管中的液体。

(4)在吸附柱中加500ul的W1，9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体。

(5)在吸附柱中再加500ul的W1，9000g离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中，再9000g离心1min。

(6)将吸附柱放入一个无菌的1.5ml EP管中，在吸附膜中央加入30ul pH8.0的去离子水，37℃水浴2min，9000g离心1min，管底即为回收到的DNA。

(7)取5ul回收到得目的片段电泳，用定量DNA Marker法估算DNA分子量。

4.已纯化备用的16s rRNA基因片段的酶切及胶回收

将回收纯化的16s rRNA基因片段用NcoI和HindIII进行双酶切，设计50ul酶切反应体系：

NcoI和HindIII对质粒16s rRNA片段进行双酶切

37℃酶切反应3小时后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目的片段，操作方法同前。

5.PET-32a(+)和16s rRNA片段的连接

用DNA连接试剂盒连接经NcoI和HindIII双酶切回收的16s rRNA片段和同样经双酶切的质粒PET-32a(+)，连接反应体系如下：

连接16s rRNA片段和PET-32a(+)质粒

16℃连接过夜。连接产物直接用于转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞。

6.大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞的制备

(1)取-70℃冻存的DH5α菌种接种于3ml LB液体培养基中，37℃300rpm摇床培养7～8小时。

(2)吸取0.5ml培养液转种于25ml LB液体培养基中，37℃300rpm摇床培养2小时备用。

(3)将增菌菌液3500g、4℃离心10分钟。

(4)弃上清液后，加入12.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl₂重悬细胞，冰浴30分钟。

(5)4℃、3500g离心10分钟。

(6)弃去上清液，将细胞重悬于2.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液中。

(7)将重悬的细胞在冰浴中放12～24小时备用。

7.PET-32a(+)-16s rRNA的转化及转化子的筛选

(1)取18ul连接产物PET-32a(+)-16s rRNA与200ul大场埃希氏菌DH5α感受态细胞于无菌EP管中，轻轻混匀后在冰上静置30min。

(2)取出放在37℃水浴热休克5min，然后放在冰上1～2min。

(3)取出加入800ul LB液体培养基，置37℃孵育1小时。

(4)取100ul培养液涂布于LB氨苄青霉素平板上，37℃培养18～24小时后挑取转化子保存并进行鉴定。

8.重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA的鉴定

(1)PCR快速鉴定：

用牙签挑取少量可疑生长菌落，溶于20ul LB液体培养基，100℃水浴5min后，立即放冰上，9000g离心10秒，取上清液进行PCR扩增，条件同前，产物经1％琼脂糖电泳鉴定阳性转化子。

(2)酶切鉴定

将PCR快速鉴定出的阳性转化子增菌，提取重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA，用NcoI和HindIII进行双酶切鉴定。酶切反应体系如下：

酶切鉴定重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA

37℃酶切反应2～3小时后，取4ul进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

(3)重组质粒PCR鉴定

以重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，确定是否可扩增出365bp预期大小的基因片段。PCR扩增体系及扩增条件同前。

(4)16s rRNA基因测序鉴定

重组质粒PCR纯化后由上海生物工程有限公司进行序列测定，确定插入片段的基因序列与目的序列是否一致。

实例二自身淬灭荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法的初步建立

一、自身淬灭引物(探针)的设计与合成

根据所获得的16s rRNA基因目的片段(365bp)核苷酸序列和自身淬灭引物(探针)设计的基本原则，在http://www.invitrogen.com/LUX上设计，由美国Invitrogen公司合成。

Forward Primer：cgcgCTCGTAGGTGGTTTGTCGC(FAM)G

Reverse Primer：CCCGCACGCTCACAGTTAAG

Forward Primer同时也是自身淬灭探针，其3’端最后一个碱基为G，在3’端的第二个碱基为C，在这个C上标记荧光物质FAM，在探针的5’端引入几个和3’末端互补的碱基(cgcg)以便自身配对形成发夹结构。

二、标准品获取和定量(紫外分光光度法)

1.将冻存的含有重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA的大肠埃希菌DH5α转种于LB液体培养基，250rpm/min震荡培养过夜。

2.将培养过夜的菌液转种于LB液体培养基，250rpm震荡增菌培养2～3小时，然后用质粒提取试剂盒提取质粒。

3.紫外分光光度法对质粒标准品定量：取质粒PET-32a(+)-16s rRNA样品10μl，用1ml双蒸水稀释，转到0.5cm石英比色杯中，在紫外分光光度计上测定A260。根据A260的吸光度值可计算出样品中DNA的含量，即1个OD值相当于50ug/ml双链DNA。

4.质粒PET-32a(+)-16s rRNA浓度(拷贝数)计算

(1)质粒的分子量＝3778(碱基总数)×2×324.5(碱基的平均分子量)

(2)将提取的质粒稀释15倍后用紫外分光光度计测量A260＝0.117，根据A260＝1时，浓度为50ug/ml可计算得知提取的质粒浓度为175.5μg/ml。因在进行FQ-PCR时，DNA的起始量都是以“拷贝数”为单位的，DNA拷贝数的计算公式为：

DNA拷贝数/μl＝阿佛加得罗常数*×DNA摩尔数(阿佛加得罗常数＝6.02×10²³)

10μl质粒+33μlH2O就得到浓度为10¹⁰copies/μl的质粒，再将该质粒进行倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，于-20℃保存备用。

三、荧光定量PCR的各种反应条件和参数摸索

我们就Taq酶、反应时间、Mg²⁺浓度、dNTP量、循环数及体系稳定性进行了摸索，最后摸索出了体系的最佳条件。

1.荧光定量PCR酶量梯度实验

(1)反应体系

荧光定量PCR酶量梯度实验反应体系

(2)反应条件

95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火、延伸34s共40个循环，72℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

2.荧光定量PCR Mg²⁺浓度梯度实验

(1)反应体系

荧光定量PCR Mg²⁺梯度实验反应体系

(2)反应条件

95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火、延伸34s共40个循环72℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

3.荧光定量PCR引物梯度实验

(1)反应体系

荧光定量PCR引物梯度实验反应体系

(2)反应条件

95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火、延伸34s共40个循环，72℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

4.荧光定量PCR循环数实验

(1)反应体系

荧光定量PCR循环数实验反应体系

(2)反应条件

95℃预变性2mim；95℃变性15s，60℃退火、延伸34s共30、35或40个循环，72℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

四、方法学评价

1.标准曲线制作

将上述已定量的标准品(质粒)以10倍的倍比关系作一系列稀释，以不同稀释浓度的标准品作为模板，用所设计的引物进行FQ-PCR扩增。以浓度的对数和相应的阈值循环数(threshold cycle，Ct)为相应的X、Y轴制作标准曲线。

(1)反应体系

制作标准曲线反应体系

将反应体系混匀，9000g离心5秒后，放入荧光定量PCR仪。

(2)反应条件

95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火、延伸34s共40个循环，72℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

2.灵敏度

将已定量的标准品成10倍稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、1、10-¹copies/ul，用建立的荧光定量PCR方法进行检测，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。

3.批内重复性

(1)低拷贝标本批内重复性：浓度分别为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶copies/μl的标准品做标准曲线，浓度约10³copies/μl的样品平行做10管。

①反应体系

批内重复性的反应体系

将反应体系混匀，9000g离心5秒后，放入荧光定量PCR仪。

②反应条件

95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火、延伸34s共40个循环，72℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

4.天间重复性

取低拷贝样本(浓度约10³copies/ul)和高拷贝样本(浓度约10⁷copies/ul)，每天各测一次，连续测定10天，记录结果。

5.特异性

为了了解该方法的特异性，选用了下呼吸道常见的细菌：大肠埃希菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌、甲型链球菌、乙型链球菌、棒状杆菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、金黄色葡萄球菌各一株，另外用了三株结核分枝杆菌及阴性、阳性对照各一个，用建立的方法进行检测。

实例三用本发明的引物及自身淬灭探针进行TB的实时荧光定量PCR检测

一、分离培养法

将标本接种于改良罗氏培养基，置35～37℃，5％～10％的CO2培养箱中培养，每天观察，如见表面干燥呈颗粒状，不透明、乳白色或淡黄色，如菜花样可疑菌落，则涂片抗酸染色镜检，蓝色背景下发现红色细长略带弯曲的杆菌。

二、荧光定量PCR法

1.标本的预处理

在标本管中加入1ml无菌生理盐水并充分摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中，9000g离心5分钟。弃上清液，沉淀中加无菌生理盐水1ml打匀，9500g离心5分钟，重复洗涤一次，沉淀直接加入50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10分钟，9000g离心5分钟，取上清液2μl做荧光定量PCR反应。

2.将一系列不同稀释浓度的质粒DNA标准品和经预处理提取的标本DNA作为模板，进行荧光定量PCR检测。同时设阴性和阳性对照各一个。

(1)反应体系

荧光定量PCR反应体系

将反应体系混匀，9000g离心5秒后，放入ABI 7500荧光定量PCR仪。

(2)反应条件

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火、延伸34s共40个循环，72℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

3.结果计算

调节基线(base line)至适宜处，各扩增曲线与阈值线的交叉点对应的横坐标即为Ct值，根据标准曲线上浓度与Ct值的对应关系，可求出各待测标本的初始浓度。

三、数据分析

采用EXCLE软件包，培养法和所建立的荧光定量PCR方法对临床样品检测结果阳性率的比较采用X2检验。

应用所建立的FQ-PCR方法和培养法对39例临床高度怀疑结核病人的标本进行检测，经统计分析发现P＜0.05，说明这两种方法有显著性差异。FQ-PCR阳性检出率(100％)明显高于培养法(71.4％)，其敏感性和特异性均为100％。但应该注意的是该方法与常规PCR技术一样，不能区别结核分枝杆菌菌是否存活，病人经治疗后未排出体外的死菌仍可检测为阳性，我们追踪了10例病人治疗后半年的阴转率，荧光定量PCR方法低于培养法，故荧光定量PCR方法不能作为结核病的治疗判断标准。对于经正规治疗后症状、体征消失而荧光定量PCR检测仍为阳性的结核病患者，是否需要继续治疗，应当结合培养法来综合判定。

综上所述，本发明的有益效果是：利用重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA所建立的结核分枝杆菌实时荧光定量检测方法具有检测速度快(约2小时完成)、操作简便、结果客观可靠，易于判断等特点，并且该方法具有较好的敏感性和特异性，不仅能提高检出率，而且还能定量给出患者DNA载量，与传统的培养方法相比，具有显著性差异，明显优于培养法。但值得注意的是，FQ-PCR法不能对结核分枝杆菌的死活进行判断，故在结核病预后时间的判定上应与培养法结合起来观察。另外我们建立的以自身淬灭引物技术为基础的实时荧光定量PCR方法比以Taqman技术为基础的实时荧光定量PCR方法在成本上大大降低(约50％)，这对实时PCR技术在临床检测中的应用，有着积极的推动作用。

Claims (1)

1.一种结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于：提供用于对结核分枝杆菌进行定性、定量检测的引物和自身淬灭探针，所述引物的上游引物为5’-ACTCCATGGGATACGGCCCAGACTCCT-3’，下游引物为5’-CGCAAGCTTCATTCCACCGCTACACCAG-3’，所述自身淬灭探针的上游引物为5’-cgcgCTCGTAGGTGGTTTGTCGC(FAM)G-3’，下游引物为5’-CCCGCACGCTCACAGTTAAG-3’，上游引物3’端最后一个碱基为G，在3’端的第二个碱基为C，在这个C上标记荧光物质FAM，在探针的5’端引入几个和3’末端互补的碱基(cgcg)以便自身配对形成发夹结构。

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