CN117363767A - 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合，包括一个或多个靶基因特异性寡核苷酸报告探针和一个或多个通用寡核苷酸淬灭探针；本发明还公开了用于靶基因实时荧光PCR检测的引物组、用于多重核酸实时荧光PCR检测的试剂或试剂盒或产品。本发明还公开了一种用于多重核酸检测的实时荧光PCR检测方法。所述检测方法能够在单一反应体系同时定性检测样本中多种靶基因核酸，从而克服传统实时荧光PCR在单一反应体系检测靶基因核酸数目的局限性，实现以高通量、低检测成本、高灵敏和高特异性来对待测样本中的多种待测靶基因核酸的准确定性检测。本发明具有广泛应用前景。

Description

一种用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合、引物组、试剂 盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
实时荧光PCR被认为是一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术，与普通PCR方法相比，其操作简单、无需开盖、污染小，在核酸检测领域得到广泛的应用，例如感染性疾病的诊断、遗传性疾病的检测、药物基因组学的检测等。
感染性疾病如呼吸道感染、感染性腹泻、中枢神经系统感染等通常是由多种病原体混合感染引起，往往需要通过病原体检测方法进行鉴别诊断，仅检测单一病原体对临床诊疗的指导意义大大下降。因此，实时荧光PCR的高通量、快速检测的需求日益增加，希望能在同一反应体系内实现多个靶标的多重PCR检测。通常通过对每个靶标设计特定的寡核苷酸探针，利用不同寡核苷酸探针上标记的不同波长的荧光基团来区分每个靶标，从而实现多重PCR检测，但由于检测仪器的荧光通道数量有限，大部分仪器最多只能检测4重左右的不同靶标，一般也不能超过6重。此外，还可以利用荧光标记的寡核苷酸探针和PCR终产物进行杂交，寡核苷酸探针和产物杂交时会释放荧光信号，不同波长的荧光基团标记的寡核苷酸探针代表不同的检测靶标，也可以通过不同的Tm值对应的熔解峰识别不同的检测靶标。虽然该方法需要在PCR扩增后进行额外的步骤，但能提高在单个反应体系中检测靶标数目。
然而在进行多重实时PCR扩增时，多个寡核苷酸探针在同一反应体系内会使反应体系的背景荧光增加，且增加引物对会增加多重实时PCR反应体系优化的难度。因此，在不改变现有市场上的荧光定量PCR仪硬件设备前提下，需要对实时荧光PCR方法进行优化，开发一种能够解决多靶基因扩增检测的多重核酸检测实时PCR技术，提高单管检测尽可能多的靶基因。
发明内容
为克服现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明通过一系列的实验和创新性劳动，提供了一种用于多重核酸检测的实时荧光PCR检测方法：构建用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合，构建与所述靶基因核酸序列互补的引物组，将含有待测靶基因核酸序列的样本核酸在单一反应体系中与所述探针组合、引物组混合，进行实时荧光PCR反应；然后，对PCR反应得到的扩增产物进行熔解曲线分析，并根据熔解峰的Tm值和荧光通道来确定是否存在对应的靶基因核酸序列。
具体地，所述检测方法包括步骤（1）：将含有待测靶基因核酸序列的样本核酸在单一反应体系中与所述探针组合和所述引物组混合，进行实时荧光PCR反应；步骤（2）：PCR结束后，对扩增产物进行熔解曲线分析，并根据熔解峰的Tm值和荧光通道来确定是否存在对应的靶基因核酸序列。
本发明检测方法中，所述熔解曲线分析包括：根据所获得的熔解曲线中的熔解峰来确定对应靶基因核酸序列的存在。具体地，所述熔解曲线分析包括：对PCR扩增产物进行逐渐增加或降低温度同时监测每一种荧光报告基团产生的荧光信号，用获得的荧光信号强度改变与温度变化进行作图来产生熔解曲线。具体地，所述熔解曲线分析包括：分别检测每一种不同的荧光报告基团的信号，获得与每一种不同荧光报告基团的信号产生的多个熔解曲线，根据不同的荧光报告基团和对应的熔解曲线中的熔解峰来确定对应靶基因核酸序列的存在。
所述检测方法中，使用具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。
所述检测方法中，所述靶基因核酸特异性寡核苷酸报告探针中报告基团为荧光基团，所述通用寡核苷酸淬灭探针中淬灭基团可以吸收和淬灭所述报告基团的荧光基团。
所述检测方法中，所述靶基因核酸特异性寡核苷酸报告探针包含相同的荧光报告基团，和/或，所述靶基因核酸特异性寡核苷酸报告探针包含不同的荧光报告基团。
所述检测方法中，所述靶基因核酸特异性寡核苷酸报告探针包含天然的核苷酸，经过修饰的核苷酸，非天然的核苷酸中的一种或多种；和/或，所述通用寡核苷酸淬灭探针包含多种与所述5’识别区序列的互补序列；和/或，所述互补序列以相邻的方式、以间隔有连接序列的方式，或者以重叠的方式排列；所述通用寡核苷酸淬灭探针包含天然的核苷酸，经过修饰的核苷酸，非天然的核苷酸中的一种或多种。
所述检测方法中，所述上游寡核苷酸引物序列包含天然的核苷酸，经过修饰的核苷酸，非天然的核苷酸中的一种或多种；和/或，所述下游寡核苷酸引物序列包含天然的核苷酸，经过修饰的核苷酸，非天然的核苷酸中的一种或多种。
在具体实施方案中，所述检测方法包括以下步骤：
（1）针对待检测的每一种靶基因核酸序列，提供一种上游寡核苷酸引物、一种下游寡核苷酸引物；其中，所述上游寡核苷酸引物包含与所述靶基因核酸序列互补的序列；所述下游寡核苷酸引物包含与所述靶基因核酸序列互补的序列；所述上游寡核苷酸引物位于所述的靶基因核酸序列的上游；所述下游寡核苷酸引物位于所述的靶基因核酸序列的下游。
（2）针对待检测的每一种靶基因核酸序列，提供一种寡核苷酸探针组合，包括靶基因特异性寡核苷酸报告探针和通用寡核苷酸淬灭探针。所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针包括以下组分，从5’到3’方向依次包括5’识别区和靶基因识别区；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的3’端碱基进行封闭修饰，从而阻止探针向3’延伸；所述5’识别区序列为人工引入序列，不与包括靶基因核酸序列在内的任何天然核酸序列互补；所有靶基因特异性寡核苷酸报告探针所包含的5’识别区的序列彼此不同；所述靶基因识别区包含与靶基因核酸序列互补的序列；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端标记有荧光报告基团。
（3）所述通用寡核苷酸淬灭探针与所述每种靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’识别区互补或其部分互补。所述通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记有淬灭基团。所述通用寡核苷酸淬灭探针是线性的。
（4）将含有待测靶基因核酸序列的样本核酸在单一反应体系中与待测靶基因的上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物、靶基因特异性寡核苷酸报告探针和通用寡核苷酸淬灭探针混合，进行荧光PCR反应。
（5）PCR结束后，对扩增产物进行熔解曲线分析，并根据熔解峰的Tm值和荧光通道来确定是否存在对应的靶基因核酸序列。
在某些实施方案中，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量可以为至少1个，至少2个，例如为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大的整数。
在某些实施方案中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针标记的荧光报告基团包括但不限于FAM、VIC、TET、JOE、HEX、ROX、CAL、TAMRA、CY3、CY5、CY5.5、TEXAS RED、Quasar670、Quasar 705等。
在某些实施方案中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的长度为28-44nt。所述5’识别区的长度为10-13nt。所述靶基因识别区的长度为18-33nt。
在某些实施方案中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的3’端是封闭的，以抑制其延伸。可通过各种方法来封闭3’端。例如，可通过在靶基因特异性寡核苷酸报告探针的最后一个碱基上添加化学部分（例如，生物素或烷基修饰），从而封闭靶基因特异性寡核苷酸报告探针的3’末端。
在某些实施方案中，通用寡核苷酸淬灭探针的数量可以为至少1个，至少2个，例如为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大的整数。
在某些实施方案中，所述通用寡核苷酸淬灭探针标记的淬灭基团包括但不限于BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、TAMRA、Eclipse、BBQ650、DABCYL等。
在某些实施方案中，所述通用寡核苷酸淬灭探针的长度为25-38nt。
在某些实施方案中，所述通用寡核苷酸淬灭探针是线性的。
在某些实施方案中，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量＞通用寡核苷酸淬灭探针的数量。通用寡核苷酸淬灭探针的数量。
本发明中，样品可以是任何待检测的样品。所述样本包含但不限于DNA，RNA中的一种或多种；和/或，所述靶基因核酸序列是DNA或RNA；和/或，所述靶基因核酸序列是单链的或双链的。例如，在具体实施方案中，样品包含或是DNA（例如基因组DNA或cDNA）。在某些实施方案中，样品包含或者是RNA（例如mRNA）。在某些实施方案中，样品包含或者是核酸的混合物（例如DNA的混合物，RNA的混合物，或者DNA和RNA的混合物）。
在本发明的方法中，待检测的靶基因核酸序列不受限于其序列组成或长度。例如靶基因核酸序列可以是DNA（例如基因组DNA或cDNA）或RNA（例如mRNA）。此外，待检测的靶基因核酸序列可以是单链的或双链的。
进一步，当待检测标本或靶基因核酸序列是mRNA时，优选地，需要进行一步逆转录反应，以获得与所述mRNA互补的cDNA。
在本发明的方法中，待测样本或靶基因核酸序列可以来源原核生物（例如细菌、支原体、衣原体、立克次体）、真核生物（例如真菌、植物、动物、寄生虫）、病毒（例如HIV病毒、肝炎病毒、流感病毒、冠状病毒、EB病毒等）或类病毒。待检测的样本或靶基因核酸序列还可以是人工合成的序列等。
在具体实施方案中，待测样本可以来自包括但不限于：痰液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、尿液、脑脊液、关节液、咽拭子、新鲜组织、福尔马林固定石蜡包埋组织、脓液、分泌物、全血、血清、血浆、细菌培养物、真菌培养物、病毒培养物、细胞系培养物、人工合成的质粒、假病毒等。
本发明还提出了一种用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合，所述探针组合包括一个或多个靶基因特异性寡核苷酸报告探针和一个或多个通用寡核苷酸淬灭探针；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针从5’到3’方向依次包括5’识别区和靶基因识别区；所述通用寡核苷酸淬灭探针与所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针全部或部分互补；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量＞所述通用寡核苷酸淬灭探针的数量；所述探针组合用于1-10种靶基因核酸序列的实时荧光检测；
其中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针从5’到3’方向依次包括5’识别区和靶基因识别区；
所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的序列包括SEQ ID NO. 21-30中的一种或多种；
其中，每个或每种通用寡核苷酸淬灭探针同时结合多个靶基因特异性寡核苷酸报告探针中的5’识别区；每种通用寡核苷酸淬灭探针适用于不同的靶基因；所述通用寡核苷酸淬灭探针序列包括如下SEQ ID NO. 31-33中的一种或多种：
SEQ ID NO.31：GGGGCCGCTACATGGGTACAGAGGGAGAGGAAGGCGGG；和/或，
SEQ ID NO.32：ACGGCCGTAAACCAAATGGAGAGGG；和/或，
SEQ ID NO.33：GAGCGCTGGACAGTGTGGACCCACGTCTCGCAGCAGG。
本发明所述探针组合中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量＞所述通用寡核苷酸淬灭探针的数量。
本发明所述探针组合中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针3’端碱基封闭修饰，5’识别区序列为不与包括靶基因核酸序列在内的任何天然核酸序列互补的人工引入序列；所有靶基因特异性寡核苷酸报告探针所包含的5’识别区的序列彼此不同；所述靶基因识别区包含与靶基因核酸序列互补的序列；和/或，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端标记有荧光报告基团。
本发明所述探针组合中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量为至少1个；和/或，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的长度为28-44nt；其中，所述5’识别区的长度为10-13nt；所述靶基因识别区的长度为18-33nt；和/或，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针标记的荧光报告基团包括FAM、VIC、TET、JOE、HEX、ROX、CAL、TAMRA、CY3、CY5、CY5.5、TEXAS RED、Quasar 670、Quasar 705等。
本发明所述探针组合中，所述通用寡核苷酸淬灭探针是线性探针，所述通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记有淬灭基团。
本发明所述探针组合中，所述通用寡核苷酸淬灭探针的数量为至少1个；和/或，所述通用寡核苷酸淬灭探针的长度为25-38nt；和/或，所述通用寡核苷酸淬灭探针标记的淬灭基团包括BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、TAMRA、Eclipse、BBQ650、DABCYL等。
本发明还提出了新的序列，包括如下：
所述淬灭探针的序列包括以下序列：
SEQ ID NO:31：GGGGCCGCTACATGGGTACAGAGGGAGAGGAAGGCGGG；和/或，
SEQ ID NO:32：ACGGCCGTAAACCAAATGGAGAGGG；和/或，
SEQ ID NO:33：GAGCGCTGGACAGTGTGGACCCACGTCTCGCAGCAGG。
优选地，所述报告探针序列包括SEQ ID NO. 21-29中的一种或多种；所述淬灭探针序列包括SEQ ID NO. 31-33中的一种或多种；优选地，所述报告探针序列包括SEQ IDNO. 30，所述淬灭探针序列包括SEQ ID NO. 33。
本发明还提出了用于靶基因实时荧光PCR检测的引物组，所述引物组包括上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物；其中，所述上游寡核苷酸引物包括与所述靶基因核酸序列互补的序列，位于所述靶基因核酸序列的上游；所述下游寡核苷酸引物包括与所述靶基因核酸序列互补的序列，位于所述靶基因核酸序列的下游。
在具体实施方案中，本发明引物组包括但不限于以下序列：
优选地，所述引物组包括SEQ ID NO. 1-18中的一种或多种；和/或，优选地，所述引物组包括SEQ ID NO. 19-20中的一种或多种。
本发明还提出了一种用于多重核酸实时荧光PCR检测的试剂、试剂盒或产品，其包括所述探针组合和/或所述引物组。进一步还包括具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶、UDG酶或UNG酶等；所述具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶，优选如Taq DNA聚合酶。
本发明还提出了一种用于多重核酸实时荧光PCR检测的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒。其中，所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒包括针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针，所述上下游寡核苷酸引物组用于扩增呼吸道病原菌靶基因核酸序列，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针包含5’识别区和靶基因识别区，所述5’识别区包含不与呼吸道病原菌靶基因核酸序列互补的序列，所述靶基因识别区与呼吸道病原菌靶基因核酸序列互补。针对所述的靶基因特异性寡核苷酸报告探针还提供一种或多种通用寡核苷酸淬灭探针，所述通用寡核苷酸淬灭探针包含与所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的一种或多种5’识别区互补的一种或多种序列。
所述呼吸道病原菌选自金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的任意至少一种。
所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒所需针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物序列包括SEQ ID NO. 1-18中的一种或多种。
所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒所需针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的靶基因特异性寡核苷酸报告探针的序列包括SEQ ID NO. 21-29中的一种或多种。
所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒所需通用寡核苷酸淬灭探针的序列包括SEQ ID NO. 31-33中的一种或多种。
所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒，还包括针对人内参靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针以及通用寡核苷酸淬灭探针；进一步地，所述人内参为GAPDH基因。
针对人GAPDH基因的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针以及通用寡核苷酸淬灭探针，其中上下游寡核苷酸引物组序列包括SEQ ID NO. 19-20中的一种或多种，靶基因核酸特异性寡核苷酸报告探针序列如SEQ ID NO. 30所示，通用寡核苷酸淬灭探针序列如SEQ ID NO. 33所示。
本发明还提供一种利用所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒进行的呼吸道病原菌多重核酸实时荧光PCR检测方法，其包括以下技术方案：
获取待测样本核酸；
采用所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对前述待测样本核酸进行PCR扩增及熔解曲线分析；
通过上述PCR扩增获得的产物进行熔解曲线，并根据熔解峰的Tm值和荧光通道来判断待测样本所存在的目标呼吸道病原菌的核酸序列种类。
本发明还提出了所述探针组合，所述引物组，所述试剂或试剂盒或产品，如所述检测方法在多重核酸实时荧光PCR检测中的应用。
本发明有益效果包括：
本发明提供的用于多重核酸检测的实时荧光PCR检测方法，能够在单一反应体系同时定性检测样本中多种靶基因核酸，从而克服传统实时荧光PCR在单一反应体系检测靶基因核酸数目的局限性，实现以高通量、低检测成本、高灵敏和高特异性来对样本中的多种待测靶基因核酸的准确定性检测。
本发明还公开了一种更为快速简便、灵敏特异、稳定可靠的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒，该检测试剂盒可以在单管PCR反应体系中同时进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测。
本发明基于本发明制备得到的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒还提供一种呼吸道病原菌的检测方法，该方法能够对样品中的每一种呼吸道病原菌进行准确有效地区分和检测，其检测特异性好、灵敏度高，检测结果易判读，为科研及临床的呼吸道病原菌快速检测提供强大的技术支持。
本发明中，通过针对待测靶基因核酸序列提供特异性的上游和下游引物组、报告探针和淬灭探针组的构建，相较于现有技术，本发明使得当待检测靶基因核酸序列存在时报告探针的5’识别区可以直接与淬灭探针特异性结合并进行延伸时，才能产生特定Tm值的熔解峰，降低背景荧光，提高了检测的灵敏度和特异性以及单一荧光通道检测靶基因的数目，降低了检测成本，使得本发明更具有检测优势和普适性。本发明实施例中仅使用四种不同荧光通道实现了九种呼吸道病原菌的检测，且大部分呼吸道病原菌的菌株样本最低检测下限可达到5×102CFU/mL。
附图说明
为了更清楚地进行详细描述本发明的实施方案，下面将结合附图和实施例进行说明，对于本领域普通技术人员来讲，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。
图1为本发明用于多重核酸检测的实时荧光PCR检测方法的设计原理图。
图2为本发明实施例3中采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对阳性质控品检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图3为本发明实施例3中采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对阴性质控品检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图4为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对肺炎克雷伯菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图5为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对铜绿假单胞菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图6为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对金黄色葡萄球菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图7为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对大肠埃希菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图8为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对流感嗜血杆菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图9为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对鲍曼不动杆菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图10为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图11为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对嗜麦芽窄食单胞菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图12为本发明实施例3采用呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对肺炎链球菌阳性样本检测结果图，其中A为FAM通道的熔解曲线图，B为VIC通道的熔解曲线图，C为ROX通道的熔解曲线图，D为CY5通道的熔解曲线图。
图13为本发明对比实施例中肺炎克雷伯菌对比引物探针组1和2的比对实验结果图。
图14为本发明对比实施例中鲍曼不动杆菌对比引物探针组1和2的比对实验结果图。
具体实施方式
除非特别指明，本发明实施例中所使用的分子生物学实验和方法通常按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行。例如，本发明中所使用的常规技术，可参考例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，1989；Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南》，第3版，John Wiley&Sons ,Inc.，1995。本发明实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种用于多重核酸检测的实时荧光PCR检测方法，其特征在与，所述检测方法包括以下步骤：
（1）针对待检测的每一种靶基因核酸序列，提供一种上游寡核苷酸引物、一种下游寡核苷酸引物；其中，所述上游寡核苷酸引物包含与所述靶基因核酸序列互补的序列；所述下游寡核苷酸引物包含与所述靶基因核酸序列互补的序列。所述上游寡核苷酸引物位于所述的靶基因核酸序列的上游；所述下游寡核苷酸引物位于所述的靶基因核酸序列的下游。
（2）针对待检测的每一种靶基因核酸序列，提供一种寡核苷酸探针组合，包括靶基因特异性寡核苷酸报告探针和通用寡核苷酸淬灭探针。所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针包括以下组分，从5’到3’方向依次包括5’识别区和靶基因识别区；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的3’端碱基进行封闭修饰，从而阻止探针向3’延伸；所述5’识别区序列为人工引入序列，不与包括靶基因核酸序列在内的任何天然核酸序列互补；所有靶基因特异性寡核苷酸报告探针所包含的5’识别区的序列彼此不同；所述靶基因识别区包含与靶基因核酸序列互补的序列；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端标记有荧光报告基团。
（3）所述通用寡核苷酸淬灭探针与所述每种靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’识别区互补或其部分互补。所述通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记有淬灭基团。所述通用寡核苷酸淬灭探针是线性的。
（4）将含有待测靶基因核酸序列的样本核酸在单一反应体系中与待测靶基因的上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物、靶基因特异性寡核苷酸报告探针和通用寡核苷酸淬灭探针混合，进行荧光PCR反应。
（5）PCR结束后，对扩增产物进行熔解曲线分析，并根据熔解峰的Tm值来确定是否存在对应的靶基因核酸序列。
在本发明中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针包括以下组分，从5’到3’方向依次包括5’识别区和靶基因识别区。本发明所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针序列的长度优选为28-44nt；所述5’识别区为人工引入序列，不与包括靶基因核酸序列在内的任何天然核酸序列互补；本发明所述5’识别区的长度优选为10-13nt；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的3’端碱基上进行封闭修饰；所述通用寡核苷酸淬灭探针与所述每种靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’识别区互补或其部分互补。本发明所述靶基因识别区的长度优选为18-33nt；所述靶基因识别区序列与待测靶基因核酸序列互补，且靶基因识别区序列与靶基因核酸序列杂交时，其位于待测靶基因核酸序列的上游寡核苷酸引物的下游。
在本发明中，所述通用寡核苷酸淬灭探针优选为线性的，序列长度优选为25-38nt。本发明通用寡核苷酸淬灭探针3’端标记有淬灭基团。所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针发出的荧光基团信号。本发明所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针标记的荧光报告基团优选为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、ROX、CAL、TAMRA、CY3、CY5、CY5.5、TEXAS RED、Quasar 670、Quasar 705等中的任一种，进一步优选为FAM、VIC、ROX、CY5中的任一种。本发明所述通用寡核苷酸淬灭探针标记的淬灭基团BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、TAMRA、Eclipse、BBQ650、DABCYL等中的任一种，进一步优选为BHQ-1、BHQ-2、BBQ650中的任一种。本发明中，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量可以为至少为1个，且靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量＞通用寡核苷酸淬灭探针的数量。
本发明中，当待测样本含有待检测靶基因核酸序列时，在PCR反应退火时，靶基因特异性寡核苷酸报告探针上的靶基因识别区与待检测靶基因核酸序列特异性互补结合，上游寡核苷酸引物和下游寡核苷酸引物与待检测靶基因核酸序列特异性结合；在PCR延伸时，在DNA聚合酶作用下，上游寡核苷酸引物和下游寡核苷酸引物开始延伸，由于所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针上的5’识别区不与靶基因核酸序列杂交互补，处于游离状态。在这种状态下，DNA聚合酶通过自身的5’-3’外切酶活性会在5’识别区与靶基因识别区连接处剪切，释放出5’识别区，获得标记荧光报告基团的5’识别区；所述5’识别区能够与通用寡核苷酸淬灭探针特异性结合，在DNA聚合酶作用下，从特异性结合的位置开始进行延伸，直至通用寡核苷酸淬灭探针的5’末端，从而获得标记荧光报告基团和淬灭基团的双链核苷酸产物。对上述的双链核苷酸产物进行熔解曲线分析，产生特定Tm值的熔解峰。
在本发明中，当待测样本不含有待检测靶基因核酸序列时，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针上的5’识别区也能够与通用寡核苷酸淬灭探针特异性结合，但其无法继续进行延伸，导致获得标记荧光报告基团和淬灭基团的双链核苷酸产物很短，产生熔解峰的Tm值非常低，远低于熔解曲线分析步骤的初始温度，不会被检测，从而不会影响其他靶基因核酸序列检测。因此，当不含有待检测靶基因核酸序列时不会产生特定Tm值的熔解峰。
在本发明中，当待测样本含有多个待检测靶基因核酸序列时，可以根据多个待检测靶基因核酸序列设计特异性的上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物和同一种荧光报告基团标记的靶基因特异性寡核苷酸报告探针，并设计同一条靶基因特异性寡核苷酸报告探针。本发明中同一条通用寡核苷酸淬灭探针能够与多条靶基因特异性寡核苷酸报告探针中包含的5’识别区特异性结合，因此，相较于现有技术，本发明的方法使用的探针数量更少，简化反应体系，降低检测成本；其中所述5’识别区与通用寡核苷酸淬灭探针相结合区域不同，导致获得标记荧光报告基团和淬灭基团的双链核苷酸产物长度不同，在熔解曲线分析时产生同一种荧光不同特定Tm值的熔解峰，进而能够区分不同的待测靶基因核酸序列。
由于同一种淬灭基团可以吸收或淬灭多种荧光报告基团，当待测样本含有多个待检测靶基因核酸序列时，本发明还可以通过根据多个待检测靶基因核酸序列设计特异性的上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物和不同荧光报告基团标记的靶基因特异性寡核苷酸报告探针，并设计同一条通用寡核苷酸淬灭探针。获得标记不同荧光报告基团和淬灭基团的双链核苷酸产物，在熔解曲线分析时产生不同荧光的特定Tm值的熔解峰，进而能够区分不同的待测靶基因核酸序列。
传统的Taqman探针法和分子信标探针法的特异性主要由靶基因的上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物和特异性探针决定，而传统的SYBR染料法，由于染料结合双链DNA不具有特异性，特异性只能由靶基因的上游寡核苷酸引物和下游寡核苷酸引物决定。在本发明中，只有当上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物和靶基因特异性寡核苷酸报告探针的靶基因识别区能特异性结合靶基因核酸序列时，PCR扩增才能正常进行。5’识别区才能准确地被具有5’-3’外切酶活性DNA聚合酶剪切，释放出完整的5’识别区序列；如果靶基因特异性寡核苷酸报告探针的靶基因识别区与非靶标序列发生非特异结合，可能释放出不完整的5’识别区序列，而不完整5’识别区序列无法进行有效结合和延伸，无法产生特定Tm值的熔解峰。因此，本发明提供的多重核酸检测方法的特异性由上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物、靶基因特异性寡核苷酸报告探针的靶基因识别区以及5’识别区序列决定，在特异性方面会更有优势。
传统的Taqman探针法和分子信标探针法，每个荧光通道只能标记一种特异性探针，多重性会受荧光通道数量的限制；传统SYBR染料法本身只有单一荧光，只能靠PCR产物之间不同的Tm值区分不同靶基因核酸序列，而为了有效区分不同靶基因核酸序列，以上方法均无法实现更多重数；本发明提供的多重核酸检测方法可实现单一荧光通道标记多个特异探针，实现更多重数，在方法学上更具有优势。
在本发明的一些实施例中，上述检测方法使用具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶，优选地，DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶。
在本发明的一些实施例中，上述检测方法使用UDG酶或UNG酶，优选地，可以是UDG酶。
在本发明的一些实施例还提供了上述多重核酸检测的实时荧光PCR检测方法在制备疾病诊断的试剂或试剂盒中的应用。
在其中的一些实施例中，上述疾病为由各种病原微生物和寄生虫感染所引起的感染性疾病。优选为上呼吸道感染、下呼吸道感染、中枢神经系统感染、消化道感染、泌尿系统感染、腹腔感染和/或血流感染等。进一步优选为，用于临床表现为发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等相似症状的下呼吸道感染的病原体的检测，例如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等。
在其中的一些实施例中，上述待测样本可以来自包括但不限于：痰液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、尿液、脑脊液、关节液、咽拭子、新鲜组织、福尔马林固定石蜡包埋组织、脓液、分泌物、全血、血清、血浆、细菌培养物、真菌培养物、病毒培养物、细胞系培养物、人工合成的质粒、假病毒等。
在其中的一些实施例中，上述待测样本核酸可以是DNA（例如基因组DNA或cDNA）或RNA（例如mRNA）。上述待检测样本核酸可以是单链的或双链的。进一步，当待检测标本核酸是mRNA时，反应体系还应包括逆转录酶。优选地，反应程序还需要进行一步逆转录反应，以获得与所述mRNA互补的cDNA。
在其中的一些实施例中，上述检测方法可检测靶基因核酸序列的种类为1-12种。
在其中一些实施例中，上述检测方法可检测的任意两种靶基因核酸序列的扩增产物之间的熔点差异可以为至少2℃，从而所述任意两种靶基因核酸序列可通过熔解曲线中的不同熔解峰来区分和辨别。然而，出于便于区分和辨别的目的，任意两种靶基因核酸序列的更大的熔点差异在某些情况下是优选的。
本发明还提供了一种呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒，所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒包括针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针，所述上下游寡核苷酸引物组用于扩增呼吸道病原菌靶基因核酸序列，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针包含5’识别区和靶基因识别区，所述5’识别区包含不与呼吸道病原菌靶基因核酸序列互补的序列，所述靶基因识别区与呼吸道病原菌靶基因核酸序列互补。
针对所述的靶基因特异性寡核苷酸报告探针还提供一种或多种通用寡核苷酸淬灭探针，所述通用寡核苷酸淬灭探针包含与所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的一种或多种5’识别区互补的一种或多种序列。
优选地，所述呼吸道病原菌选自金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的一种或多种。
优选地，所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒所需针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物序列选自SEQ ID NO. 1-18中的一种或多种。
优选地，所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒所需针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的靶基因特异性寡核苷酸报告探针的序列选自SEQ ID NO. 21-29中的一种或多种。
优选地，所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒所需通用寡核苷酸淬灭探针的序列选自SEQ ID NO. 31-33中的一种或多种。
优选地，所述的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌为同一通道检测，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端共用FAM荧光报告基团；所述的大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌为同一通道检测，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端共用VIC荧光报告基团；所述的嗜麦芽窄食单胞菌、甲氧西林耐药基因为同一通道检测，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端共用ROX荧光报告基团；所述的肺炎链球菌为同一通道检测，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端用CY5荧光报告基团。
优选地，所述的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌共用同一通用寡核苷酸淬灭探针，通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记BHQ1淬灭基团；所述的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌共用同一通用寡核苷酸淬灭探针，通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记BHQ1淬灭基团；所述的嗜麦芽窄食单胞菌、甲氧西林耐药基因、肺炎链球菌共用同一通用寡核苷酸淬灭探针，通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记BBQ650淬灭基团；
在其中一些实施例中，上述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒包括以上任意至少一通道，优选为包括以上任意至少两通道；更优选为包括以上四通道。
在其中一些实施例中，上述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒，还包括针对人内参靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针以及通用寡核苷酸淬灭探针；进一步地，所述人内参为GAPDH基因。
在其中一些实施例中，上述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒，还包括以下组分：
针对人GAPDH基因的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针以及通用寡核苷酸淬灭探针，其中上下游寡核苷酸引物组序列如SEQ ID NO. 19-20中的一种或多种所示，靶基因特异性寡核苷酸报告探针序列如SEQ ID NO. 30所示，通用寡核苷酸淬灭探针序列如SEQ ID NO. 33所示。
优选地，所述的人GAPDH基因和肺炎链球菌为同一通道检测，靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端共用CY5荧光报告基团，与所述嗜麦芽窄食单胞菌、甲氧西林耐药基因、肺炎链球菌共用同一通用寡核苷酸淬灭探针，通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记BBQ650淬灭基团。
在其中一些实施例中，所述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒还包括PCR反应预混合液、阳性质控品、阴性质控品、核酸提取试剂盒的一种或多种。
在其中一些实施例中，所述PCR反应预混合液的成分包括dNTP Mix、Mg2+、Taq DNA聚合酶、UDG酶。
在其中一些实施例中，所述阳性质控品由含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希菌的基因组DNA和含人内参基因特异核酸片段的pUC57质粒DNA组成；所述阴性质控品为TE缓冲液。
在其中一些实施例中，还提供上述任一实施例所述的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：
获取待测样本核酸；
采用上述呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对上述待测样本核酸进行PCR扩增及熔解曲线分析；
在其中一些实施例中，通过上述PCR扩增获得的产物进行熔解曲线 ，并根据熔解峰的Tm值和荧光通道判断待测样本所存在的目标呼吸道病原菌的核酸序列种类。
实施例1：用于多重核酸检测的实时荧光PCR检测方法
1、引物和探针
针对待检测对象，查阅相关专业文献和指南共识并通过生物信息学分析确定待检测对象的核酸序列保守区，每个待检测对象选择至少1段特异性靶基因核酸序列。根据该特异性靶基因核酸序列，设计上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物、靶基因特异性寡核苷酸报告探针和通用寡核苷酸淬灭探针。其中，上游寡核苷酸引物序列包含与靶基因核酸序列互补的序列，下游寡核苷酸引物序列包含与靶基因核酸序列互补的序列，靶基因特异性寡核苷酸报告探针序列从5’到3’方向包含5’识别区和靶基因识别区，靶基因特异性寡核苷酸报告探针3’端碱基进行封闭修饰，从而阻止探针向3’延伸。5’识别区的序列包含不与靶基因核酸序列互补的序列，为人工引入序列。靶基因识别区包含与靶基因核酸序列互补的序列。所有靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’识别区彼此不同。所有靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端标记有荧光报告基团。所有通用寡核苷酸淬灭探针序列从5’到3’方向包含与一种或多种5’识别区序列或其互补的一种或多种序列。所有通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记有淬灭基团，并且是线性的。具体如下并结合图1所示。
2、反应体系配制与组成（以下均以待测样本核酸为DNA为例，如待测样本核酸为RNA，可增加逆转录相关组成及反应程序即可）
（1）混合酶液：含有UDG酶或UNG酶和DNA聚合酶，DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶。
（2）PCR反应液：含有dNTP/dUTP Mix，Mg2+等。
（3）引物和探针配制：用TE分别溶解引物和探针，每条引物的终浓度为50nmol/L~500nmol/L。每条靶基因特异性寡核苷酸报告探针的终浓度为50nmol/L~200nmol/L。每条通用寡核苷酸淬灭探针的终浓度为50nmol/L~200nmol/L。
（4）反应体系配制：将混合酶液、PCR反应液和引物探针混合均匀，配制成PCR反应预混合液。配制完反应体系后，取待检样品、阴性对照、阳性对照加样量为2.5μL，振荡混匀，离心后上机。
3、检测原理
（1）将待测样品的核酸与上述的上下游寡核苷酸引物、靶基因特异性寡核苷酸报告探针、通用寡核苷酸淬灭探针与具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶组合，进行PCR扩增。在PCR反应退火时，靶基因特异性寡核苷酸报告探针上的靶基因识别区与待检测靶基因核酸序列特异性互补结合，上游寡核苷酸引物和下游寡核苷酸引物与待检测靶基因核酸序列特异性结合；在PCR延伸时，在DNA聚合酶作用下，上游寡核苷酸引物和下游寡核苷酸引物开始延伸，由于靶基因特异性寡核苷酸报告探针上的5’识别区不与靶基因核酸序列杂交互补，处于游离状态。在这种状态下，DNA聚合酶通过自身的5’-3’外切酶活性会在5’识别区与靶基因识别区连接处剪切，释放出5’识别区，获得标记荧光报告基团的5’识别区。
（2）5’识别区能够与通用寡核苷酸淬灭探针特异性结合，在DNA聚合酶作用下，从特异性结合的位置开始进行延伸，直至通用寡核苷酸淬灭探针的5’末端，从而获得标记荧光报告基团和淬灭基团的双链核苷酸产物。对上述的双链核苷酸产物进行熔解曲线分析，产生特定Tm值的熔解峰。
4、PCR扩增及熔解曲线分析
使用以下程序进行PCR扩增及熔解曲线分析，具体程序如下表：
表1
5、分析结果
以FAM、VIC、ROX通道检测目标病原体，CY5通道检测内参基因为例：
（1）在FAM、VIC、ROX通道，特定病原体Tm参考值范围内有熔解峰时，则判定该病原体阳性；
（2）当同时出现两个或以上熔解峰时，则判定该待测样本同时感染两种或以上病原体；
（3）在FAM、VIC、ROX通道无熔解峰，CY5通道有熔解峰时，判定该待测样本无检测范围内的病原体；
（4）若在FAM、VIC、ROX、CY5通道均无熔解峰，则判定该实验结果无效，建议重新采样或重新提取核酸后再检测。
实施例2：呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒的组成
1、引物和探针
本实施例所提供的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒包括针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针和通用寡核苷酸淬灭探针。其中，试剂盒中各病原菌的扩增引物序列具体如下表2所示，针对各病原菌的靶基因特异性寡核苷酸报告探针及通用寡核苷酸淬灭探针序列具体如下表3所示。该试剂盒可特异性地检测多种呼吸道病原菌，包括肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌。
表2
表3
表格中“-”连接表示荧光报告基团、淬灭基团或碱基修饰的位置和名称。
2、质控品
试剂盒中含有阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品和阴性质控品需和待测样本需要同时进行检测。阳性质控品由含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希菌的基因组DNA和含人内参基因特异核酸片段的pUC57质粒DNA组成；阴性质控品为TE缓冲液。阳性质控品和阴性质控品可单独市购或根据现有技术自行配置。
表4
3、PCR反应预混合液
将表3所示的各检测对象的上下游引物组、各检测对象的靶基因特异性寡核苷酸报告探针、通用寡核苷酸淬灭探针与购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司的qPCR Mix（含有dNTP Mix，Mg2+、Taq DNA聚合酶、UDG酶等）混合均匀，配制成PCR反应预混合液。其中，各引物和探针的终浓度见表5和表6。
表5
表6
4、核酸提取试剂盒
核酸提取试剂盒可单独市购或根据现有技术自行配置。
实施例3 试剂盒的检测方法
本发明实施例中还提供一种呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒的检测方法：
1、按照标准操作采集疑似/确诊呼吸道感染患者的临床样本（痰液、肺泡灌洗液等），采集后应立即放置于冰袋中，并马上送检。
2、样本进行前处理后，按照核酸提取试剂盒（磁珠法）说明书提取样本中DNA，获得待测样本核酸。
3、根据检测需求设置排版方式，根据排版将PCR反应预混合液加入8联管或96孔板中，每孔加PCR反应预混合液17.5μL，并往反应孔中依次加入2.5μL的阴性质控品（TE缓冲液）、待测DNA样本和阳性质控品（含肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌的基因组DNA和含人内参基因特异核酸片段的pUC57质粒DNA），盖好盖子。
4、充分振荡混匀，离心后上机。
5、PCR扩增及熔解曲线分析
参考实施例1设置PCR反应程序进行PCR扩增及熔解曲线分析。
6、结果分析
各检测对象在各通道中的Tm值范围如下表7所示：
表7
阳性对照判读：应在FAM、VIC、ROX和CY5通道有熔解峰，分别对应为肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、鲍曼不动杆菌、甲氧西林耐药基因、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌和人内参基因的熔解峰，判定阳性质控品合格。若其中有一种或以上没有熔解峰，则判定试剂存在失效问题，需要重新检测。
阴性对照判读：应在FAM、VIC、ROX和CY5通道均无任何熔解峰，判定阴性质控品合格。若其中有一种或以上通道出现熔解峰，则判定当次检测存在污染，需要重新检测。
待测样本结果判读：
（1）在FAM、VIC、ROX和CY5通道，在检测对象Tm值范围有熔解峰，则判定该病原菌或耐药基因为阳性；
（2）其中，对金黄色葡萄球菌和甲氧西林耐药基因的结果判读如下，金黄色葡萄球菌为阳性而甲氧西林耐药基因为阴性时，则判定为金黄色葡萄球菌阳性；金黄色葡萄球菌和甲氧西林耐药基因均为阳性时，则判定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌阳性；金黄色葡萄球菌为阴性，无论甲氧西林耐药基因是否为阳性，均判定为未检测到金黄色葡萄球菌；
（3）若在CY5通道人内参基因Tm值范围有熔解峰，在FAM、VIC、ROX、CY5通道其他检测对象Tm值范围均无熔解峰，则判定该样本无检测范围内的病原菌；
（4）若在FAM、VIC、ROX、CY5通道均无熔解峰，则判定该样本无效，建议重新采样或重新提取核酸后再检测。
其中，合格阳性质控品和阴性质控品采用本发明试剂盒的检测结果分别如图2和图3所示。各病原菌阳性样本采用本发明试剂盒的检测结果分别如图4-图12所示。
实施例4：试剂盒的灵敏度和特异性分析
灵敏度分析：
所有菌株购于广东省微生物菌种保藏中心和中国医学菌种保藏中心（表8）。为确定试剂盒的灵敏度，分别对将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行梯度稀释，浓度分别为1×106CFU/mL、5×105CFU/mL、1×105CFU/mL、5×104CFU/mL、1×104CFU/mL、5×103CFU/mL、1×103CFU/mL、5×102CFU/mL、1×102CFU/mL、5×10CFU/mL、1×10CFU/mL，每个梯度稀释液重复3-5份样本，利用与实施例2中呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒相同方法进行检测，直至检测不到荧光信号，每份进行20次的重复检测，以95%的阳性检出率水平作为最低检测下限（LOD），即为灵敏度。
相关菌株如下：
表8
本发明试剂盒的检测灵敏度，如下表所示：
表9
特异性分析：
本发明建立的检测方法的特异性主要表现特异性引物的特异性。设计的引物都经过primer-blast比对分析，具有高度保守性和特异性，能特异性区分九种呼吸道细菌。为了确定试剂盒的特异性，选择核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状、采样部位正常寄生或易并发其他病原菌作为特异性验证样本，表10中所列病原菌株购于广东省微生物菌种保藏中心和中国医学菌种保藏中心。将1×106 CFU/mL浓度以上病原菌株分别与人内参对照质粒（pUC57）混合，利用核酸提取试剂盒（磁珠法）进行核酸提取，使用与实施例2中相同的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒进行检测，验证本发明试剂盒引物设计的特异性。
相关病原菌株如下：
表10
研究结果显示，CY5通道人内参基因Tm值范围有熔解峰，表明均仅能检测出人内参基因。从以上数据可以看出，本发明试剂盒对以上病原菌的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与以上病原菌不存在交叉反应，表明试剂盒检测特异性强。
实施例5：试剂盒的灵敏度对比验证
以现有技术六项呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（多重荧光PCR法）（国械注准20223400597）作为“参比试剂盒”，按照参比试剂盒说明书和本发明实施例2和3提供的引物和探针组及检测方法对试剂盒中部分病原菌：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌进行灵敏度对比验证实验。
按照本发明实施例4灵敏度分析的方法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌菌液浓度分别进行梯度稀释，按照参比试剂盒说明书和本发明实施例3的检测方法检测，进行灵敏度对比验证实验。对比验证结果如表11所示。
表11
与现有技术相比，本发明实施例的四种病原菌的灵敏度均更高。以上研究结果表明本发明方法具有高灵敏度。
实施例6：试剂盒应用于临床标本检验
选取临床微生物实验室培养及药敏试验的方法作为“参比方法”，应用本发明实施例3和一代测序技术检测痰液和肺泡灌洗液的临床标本。本次试验共检测疑似/确诊下呼吸道感染患者的痰液和肺泡灌洗液共计20例标本。标本检测结果见下表12。
表12
根据以上检测数据可以得出，本发明方法的检测结果与培养检测方法以及一代测序检测的结果具有较高的符合性。
对比实施例
基于碱基互补配对原则，引物和（或）探针之间可能会形成二聚体。在研发设计之初可以通过避免形成二聚体。但多种靶基因联合检测时，由于引物和探针比较多，引物间和（或）探针间比较容易形成二聚体。因此，需要对引物探针进行精心设计及筛选，保证检测靶基因区域的保守性和降低不同引物探针之间的相互干扰。因此，本发明中，发明人在研发过程需对待检测每一种靶基因核酸序列设计多种上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物、靶基因核酸特异性寡核苷酸报告探针并进行对比研究。
本对比例展示了在研发过程中发现的部分效果不佳的引物和探针。以肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌为例，将表13所示的各引物和探针作为对比例，将本发明的各引物和探针作为实施例，同时检测相同的样本，结果如图13-14所示。从图中可以看出，与实施例引物探针组相比，采用肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对比引物和探针组1和引物和探针组2的熔解峰高均较低，表明肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对比引物和探针组的检测灵敏度均降低，充分说明在研发过程对引物探针组设计及筛选的重要性。
表13
表格中“-”连接表示荧光报告基团或碱基修饰的位置和名称。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (14)

1.一种用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括一个或多个靶基因特异性寡核苷酸报告探针和一个或多个通用寡核苷酸淬灭探针；所述通用寡核苷酸淬灭探针与所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针全部或部分互补；所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量＞所述通用寡核苷酸淬灭探针的数量；所述探针组合用于1-10种靶基因核酸序列的实时荧光检测；
其中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针从5’到3’方向依次包括5’识别区和靶基因识别区；
所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的序列包括SEQ ID NO. 21-30中的一种或多种；
其中，每个或每种通用寡核苷酸淬灭探针同时结合多个靶基因特异性寡核苷酸报告探针中的5’识别区；每种通用寡核苷酸淬灭探针适用于不同的靶基因；所述通用寡核苷酸淬灭探针序列包括如下SEQ ID NO. 31-33中的一种或多种：
SEQ ID NO.31：GGGGCCGCTACATGGGTACAGAGGGAGAGGAAGGCGGG；和/或，
SEQ ID NO.32：ACGGCCGTAAACCAAATGGAGAGGG；和/或，
SEQ ID NO.33：GAGCGCTGGACAGTGTGGACCCACGTCTCGCAGCAGG。
2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，
所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针3’端碱基封闭修饰，5’识别区序列为不与包括靶基因核酸序列在内的任何天然核酸序列互补的人工引入序列；
所有靶基因特异性寡核苷酸报告探针所包含的5’识别区的序列彼此不同；
所述靶基因识别区包含与靶基因核酸序列互补的序列；和/或，
所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的5’端标记有荧光报告基团。
3.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，
所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的数量为至少1个；和/或，
所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的长度为28-44nt；其中，所述5’识别区的长度为10-13nt；所述靶基因识别区的长度为18-33nt；和/或，
所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针标记的荧光报告基团包括FAM、VIC、TET、JOE、HEX、ROX、CAL、TAMRA、CY3、CY5、CY5.5、TEXAS RED、Quasar 670、Quasar 705。
4.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述通用寡核苷酸淬灭探针是线性探针，所述通用寡核苷酸淬灭探针的3’端标记有淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的探针组合，其特征在于，
所述通用寡核苷酸淬灭探针的数量为至少1个；和/或，
所述通用寡核苷酸淬灭探针的长度为25-38nt；和/或，
所述通用寡核苷酸淬灭探针标记的淬灭基团包括BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、TAMRA、Eclipse、BBQ650、DABCYL。
6.一种用于靶基因实时荧光PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游寡核苷酸引物、下游寡核苷酸引物；其中，所述上游寡核苷酸引物包括与所述靶基因核酸序列互补的序列，位于所述靶基因核酸序列的上游；所述下游寡核苷酸引物包括与所述靶基因核酸序列互补的序列，位于所述靶基因核酸序列的下游；
所述引物组的序列如下：
所述引物组的序列包括SEQ ID NO. 1-18中的一种或多种；和/或，
所述引物组的序列包括SEQ ID NO. 19-20中的一种或多种。
7.一种用于多重核酸实时荧光PCR检测的试剂或试剂盒或产品，其特征在于，其包括如权利要求1-5之任一项所述的探针组合，和/或如权利要求6所述的引物组。
8.用于多重核酸实时荧光PCR检测的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对呼吸道病原菌靶基因核酸序列的引物组、探针组合；
其中，所述引物组为用于扩增呼吸道病原菌靶基因核酸序列的上下游寡核苷酸引物组；所述探针组合包括靶基因特异性寡核苷酸报告探针、通用寡核苷酸淬灭探针；
其中，所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针包含5’识别区和靶基因识别区，所述5’识别区包含不与呼吸道病原菌靶基因核酸序列互补的序列，所述靶基因识别区与呼吸道病原菌靶基因核酸序列互补；所述通用寡核苷酸淬灭探针包含与所述靶基因特异性寡核苷酸报告探针的一种或多种5’识别区互补的一种或多种序列。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组序列包括SEQ ID NO. 1-18中的一种或多种；和/或，所述报告探针的序列包括SEQ ID NO. 21-29中的一种或多种；和/或，所述淬灭探针的序列包括SEQ ID NO. 31-33中的一种或多种。
10.针对人GAPDH基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对人GAPDH基因的上下游寡核苷酸引物组、靶基因特异性寡核苷酸报告探针以及通用寡核苷酸淬灭探针；其中，所述上下游寡核苷酸引物组序列包括SEQ ID NO. 19-20中的一种或多种，所述靶基因核酸特异性寡核苷酸报告探针序列如SEQ ID NO. 30所示，所述通用寡核苷酸淬灭探针序列如SEQ ID NO. 33所示。
11.一种多重核酸实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法为：构建如权利要求1-5之任一项所述的用于靶基因实时荧光PCR检测的探针组合，构建与待测靶基因核酸序列互补的引物组，将含有待测靶基因核酸序列的样本核酸在单一反应体系中与所述探针组合、引物组混合，进行实时荧光PCR反应；然后，对PCR反应得到的扩增产物进行熔解曲线分析，并根据熔解峰的Tm值和荧光通道来确定是否存在对应的靶基因核酸序列。
12.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述熔解曲线分析包括：根据所获得的熔解曲线中的熔解峰来确定对应靶基因核酸序列的存在；对PCR扩增产物进行逐渐增加或降低温度同时监测每一种荧光报告基团产生的荧光信号，用获得的荧光信号强度改变与温度变化进行作图来产生熔解曲线；分别检测每一种不同的荧光报告基团的信号，获得与每一种不同荧光报告基团的信号产生的多个熔解曲线，根据不同的荧光报告基团和对应的熔解曲线中的熔解峰来确定对应靶基因核酸序列的存在。
13.一种呼吸道病原菌多重核酸实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤：获取待测样本核酸；用如权利要求8所述的呼吸道病原菌多重核酸检测试剂盒对前述待测样本核酸进行PCR扩增及熔解曲线分析；通过前述PCR扩增获得的产物进行熔解曲线，并根据熔解峰的Tm值和荧光通道来判断待测样本所存在的目标呼吸道病原菌的核酸序列种类。
14.如权利要求1-5之任一项所述的探针组合，如权利要求6所述的引物组，如权利要求7-10之任一项所述的试剂或试剂盒或产品，如权利要求11、13之任一项所述的检测方法在多重核酸实时荧光PCR检测中的应用。
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