CN116254371A - 一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用 - Google Patents

一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用，所述引物分子信标组合包括分别特异性扩增并检测猴痘病毒F3L基因的引物对和分子信标；特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明所述的引物分子信标组合的特异性好、检测敏感性高，检出下限达到1拷贝；应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济地检测猴痘病毒野生型及其变异株，并且还可以通过分子信标熔解曲线法对猴痘病毒野生型及其变异株进行有效区分，能够满足临床检验实际工作中相关病原检测的要求。

Description

一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标 组合及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用。
背景技术
目前，荧光定量PCR应用的探针主要是5’端-报告荧光基团和3’端-淬灭荧光基团，该方法是通过探针之间的无规则卷曲达到淬灭荧光的效果，然而该标记方法由于空间距离导致报告荧光基团和淬灭荧光基团之间无法达到零距离接触，从而无法实现零背景的荧光。
虽然，目前已经开发有超级淬灭探针(例如上海百力格生物技术有限公司)，在原先5’-报告荧光基团和3’-淬灭荧光基团的基础上在中间再加入BHQ淬灭基团，但是依然无法彻底达到零背景荧光的目的。百力格的对比研究表明：通过超级淬灭探针可以实现对背景荧光彻底淬灭，不仅可以增加检测体系的荧光值Rn值，还可以显著降低相同模板的Ct值，进而可以显著提高分子检测的灵敏度。
但是，加入两个荧光淬灭基团不但会增加检测体系的负荷，而且会增加试剂盒的生产成本，同时双淬灭荧光基团的设计存在一定的难度和失败的风险，从而增加了研发的难度、周期和成本。
猴痘是猴痘病毒感染引起的一种人兽共患病，猴痘病毒属于痘病毒科的一个子集，被称为正痘病毒属，是感染哺乳动物并引起脓疱的一系列病毒。猴痘主要通过密切接触传播和呼吸道传播，被病毒污染的物品也可能有传染性。根据以往新闻报道来看，人感染猴痘病例主要是接触携带病毒的动物被传染，皮肤伤口或者黏膜接触患病动物血液、体液也有可能被传染，比如较长时间共处同一个房间，也有可能通过呼吸道感染。
通过序列比对发现：猴痘病毒变异株带有56个SNPs和3个缺失，这些突变位点可以作为猴痘病毒野生型或者突变型的分子标识。通过溯源分析发现该变异株自2018年以来一直肆虐全球，成为危害社会的公共卫生安全隐患之一。
因此，对猴痘进行准确基因分型检测对于控制猴痘疫情具有至关重要的作用，虽然有将分子信标用于多重真菌检测的报道和专利，但是却没有将分子信标用于基因分型的报道。因此，开发设计一种高灵敏度的分子信标在猴痘病毒的基因分型检测中具有重要的应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用。本发明通过应用荧光定量PCR技术快速、准确且更加灵敏地对猴痘病毒的野生型和突变型进行检测并分型，具有检测敏感性高、特异性好，检出下限均可以达到1拷贝，具有高通量、低成本等特点。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，所述引物分子信标组合包括分别特异性扩增并检测猴痘病毒F3L基因的引物对和分子信标；
特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。
优选地，检测野生型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，检测突变型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明在不改变原有探针的基础上，在探针的5’端加入3’端的一定数量的反向互补序列从而使解离的探针形成类似单链RNA的茎环结构，从而使报告荧光基团和淬灭荧光基团在空间结构上达到无限接近的程度，进而达到完全淬灭背景荧光的目的。
优选地，所述引物分子信标组合还包括分别特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标，所述内标基因为RNase P基因。
优选地，特异性扩增所述内标基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQID No.8所示。
优选地，检测所述内标基因的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
优选地，所述分子信标均带有荧光基团和淬灭基团，检测野生型猴痘病毒的分子信标、检测突变型猴痘病毒的分子信标和检测内标基因的分子信标的荧光基团均不同。
优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、JOE、TET、CY3、CY5、TexasRed或LC RED460中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述淬灭荧光基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第一方面所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合。
本发明中，所述检测试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂包括PCR缓冲液、酶混合液和水。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
(1)采集样本并提取DNA，配制PCR扩增体系；
(2)对步骤(1)中的PCR体系进行扩增检测；
(3)根据步骤(2)中获得的扩增曲线对猴痘病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中的病原体感染情况。
优选地，所述PCR扩增体系包括酶混合液、上游引物、下游引物、野生型分子信标、突变型分子信标和模板。
本发明中，所述PCR扩增体系中包括热稳定且具备或者不具备5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。
优选地，所述上游引物和下游引物的终浓度各自独立为100-400nM，例如可以是100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM或400nM等。
优选地，所述野生型分子信标和突变型分子信标的终浓度各自独立为100-400nM，例如可以是100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM或400nM等。
优选地，所述模板的终浓度为100-108拷贝，例如可以是100拷贝、101拷贝、102拷贝、103拷贝、104拷贝、105拷贝、106拷贝、107拷贝或108拷贝等。
优选地，所述扩增检测的反应条件为：预变性：94-97℃、4-5min；变性：94-97℃、8-12s，延伸58-62℃，28-32s，40-45个循环；
熔解曲线程序为：变性94-97℃、0.8-1.2min；退火44-46℃、115-125s；以0.01-0.3℃/s的升温速率升温至94-97℃。
本发明中，所述扩增检测的反应条件为：
预变性：94-97℃、4-5min，预变性的温度例如可以是94℃、95℃、96℃或97℃等，预变性的时间例如可以是4min、4.5min或5min等；
变性：94-97℃、8-12s，变性的温度例如可以是94℃、95℃、96℃或97℃等，变性的时间例如可以是8s、9s、10s、11s或12s等；
延伸：58-62℃，28-32s，40-45个循环，延伸的温度例如可以是58℃、59℃、60℃、61℃或62℃等，延伸的时间例如可以是28s、29s、30s、31s或32s等，循环的次数例如可以是40、41、42、43、44或45。
熔解曲线程序：变性94-97℃、0.8-1.2min，变性的温度例如可以是94℃、95℃、96℃或97℃等，变性的时间例如可以是0.8min、0.9min、1.0min、1.1min或1.2min等；
退火44-46℃、115-125s，退火的温度例如可以是44℃、45℃或46℃等，退火的时间例如可以是115s、117s、119s、120s、122s或125s等；
以0.01-0.3℃/s的升温速率升温至94-97℃，升温的速率为0.01℃/s、0.03℃/s、0.1℃/s、0.2℃/s或0.3℃/s等。
优选地，进行扩增检测过程中，所述PCR扩增体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸野生型分子信标的Tm值大于与之匹配的两个引物的Tm值，且对应相同靶序列的双标记寡核苷酸野生型分子信标的实时扩增荧光信号能被正常检测。
本发明中，分子信标的Tm值高于与之匹配的两个引物，主要是在退火过程中先于引物与模板DNA结合，从而通过探针序列的特异性进一步保证报告荧光切割的准确性。
作为本发明的优选技术方案，所述使用方法包括以下步骤：
(1)核酸样本的提取：采集样本并提取DNA，将提取的DNA转移至冰箱保存备用。
(2)荧光定量PCR反应：
配制PCR扩增体系，将配制的PCR扩增体系与步骤(1)提取得到的DNA混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应；PCR反应条件：95℃、5min预变性；然后依次在95℃、10s，60℃、30s，进行40-45个循环；熔解曲线程序为：变性94-97℃、0.8-1.2min；退火44-46℃、115-125s；以0.01-0.3℃/s的升温速率升温至94-97℃。
步骤(2)所述PCR扩增体系中还包括热稳定且具备或者不具备5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。
步骤(2)所述PCR扩增体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸野生型分子信标的Tm值大于与之匹配的两个引物的Tm值，且对应相同靶序列的双标记寡核苷酸野生型分子信标的实时扩增荧光信号能被正常检测。
(3)PCR结果分析：根据步骤(2)中获得的扩增曲线对猴痘病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中是否含有待检测的病原体感染。
第四方面，本发明提供一种检测猴痘病毒野生型和突变型的系统，所述系统包括：
(1)样品制备模块：采集样本并提取DNA，配制PCR扩增体系；
(2)扩增检测模块：对样品制备模块中的PCR体系进行扩增检测；
(3)分析模块：根据扩增检测模块中获得的扩增曲线对猴痘病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中的病原体感染情况。
第五方面，本发明提供第一方面所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合、第二方面所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒或第四方面所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测猴痘病毒的产品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过应用荧光定量PCR技术可以快速、准确且更加灵敏地对猴痘病毒的野生型和突变型进行检测并分型，检测敏感性高(检出下限均可以达到1拷贝)、特异性好，具有高通量、低成本等特点。
(2)荧光定量PCR反应程序一步完成，不需进行产物纯化测序等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
(3)本发明可以采用不对称+熔解曲线分析的方法，突破了传统检测体系一个通道只能检测一个靶标的局限，本发明中的一个荧光通道可以检测至少两个靶标。
(4)本发明所采用的分子信标在空间结构上能使报告荧光和淬灭荧光基团达到无限接近的程度，从而使扩增的荧光值显著高于普通TaqMan探针。
附图说明
图1是实施例5中信标法扩增图谱，图1扩增曲线为ROX通道即内标；
图2是实施例5中信标法扩增图谱，图2扩增曲线为FAM通道即野生型；
图3是实施例5中信标法扩增图谱，图3扩增曲线为VIC通道即突变型；
图4是实施例5中TaqMan探针法扩增图谱，图4扩增曲线为ROX通道即内标；
图5是实施例5中TaqMan探针法扩增图谱，图5扩增曲线为FAM通道即野生型；
图6是实施例5中TaqMan探针法扩增图谱，图6扩增曲线为VIC通道即突变型；
图7是实施例6中的分子信标的熔解曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，所述引物分子信标组合包括分别特异性扩增并检测猴痘病毒F3L基因的引物对和分子信标；特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示；检测野生型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，检测突变型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
所述引物分子信标组合还包括分别特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标；特异性扩增所述内标基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；检测内标基因的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
MonkeyPox-F为扩增F3L基因的上游引物；
SEQ ID No.1：TGGAGAAGCGAGAAGTTAATAAAGC。
MonkeyPox-R为扩增F3L基因的下游引物；
SEQ ID No.2：AGCATCCATTGTCGTAGACCAA。
MonkeyPox-P-MB-Wt为检测野生型猴痘病毒的分子信标，分子信标的荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为BHQ1；
SEQ ID No.3：
TCGTCATCTTCAACGTAGTACTATGGTGTACAGTTCCGACGA。
MonkeyPox-P-MB-Mt为检测突变型猴痘病毒的分子信标，分子信标的荧光基团为VIC，淬灭荧光基团为BHQ1；
SEQ ID No.4：
TCGTTCTTCAACGTAGTGCTATGGTTTACAGCTCCAACGA。
Rnase P-F为扩增内标基因(RNase P基因)的上游引物；
SEQ ID No.7：AGATTTGGACCTGCGAGCG。
Rnase P-R为扩增内标基因(RNase P基因)的下游引物；
SEQ ID No.8：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT。
Rnase P-MB-R为检测内标基因(RNase P基因)的分子信标，分子信标的荧光基团为ROX，淬灭荧光基团为BHQ2；
SEQ ID No.9：CGCGCTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。
对比例1
本对比例提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，所述引物分子信标组合，与实施例1的区别仅在于，特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.10所示，检测猴痘病毒的分子信标与实施例1一致，特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标与实施例1一致。
对比例2
本对比例提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，所述引物分子信标组合，与实施例1的区别仅在于，特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，检测猴痘病毒的分子信标与实施例1一致，特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标与实施例1一致。
对比例3
本对比例提供一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，所述引物分子信标组合，与实施例1的区别仅在于，特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，检测猴痘病毒的分子信标与实施例1一致，特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标与实施例1一致。
对比例1-3中的引物如下所示：
MonkeyPOX virus-F1：SEQ ID No.1：
TGGAGAAGCGAGAAGTTAATAAAGC。
MonkeyPOX virus-R1：SEQ ID No.10：
GTCGTAGACCAACGAGGAGGAGT。
MonkeyPOX virus-F2：SEQ ID No.11：
AAGATTTGGACCTGCGAGCG。
MonkeyPOX virus-R2：SEQ ID No.12：
TGTCGTAGACCAACGAGGAGGA。
MonkeyPOX virus-F3：SEQ ID No.13：
GAAGCGAGAAGTTAATAAAGCTCTG。
MonkeyPOX virus-R3：SEQ ID No.14：
AGAATCTGTAGGCCGTGTATCAG。
实施例2
本实施例提供一种检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括实施例1所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合；所述检测试剂盒还包括检测试剂，所述检测试剂包括PCR缓冲液、酶混合液和水。
实施例3
本实施例以实施例1中所述用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合为例，采用信标法同步检测并区分猴痘病毒野生型和突变型；以TaqMan探针作为对照，进行同步实验。猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合如表1所示。
表1
Figure BDA0003842578090000111
MonkeyPox-P-TaqMan-Wt为检测野生型猴痘病毒的TaqMan探针(SEQ ID No.5)，探针的荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为BHQ1。
MonkeyPox-P-TaqMan-Mt为检测突变型猴痘病毒的TaqMan探针(SEQ ID No.6)，探针的荧光基团为VIC，淬灭荧光基团为BHQ1。
检测步骤如下所示：
1.核酸样本的提取，提取采用的试剂盒为宝藤生物医药科技股份有限公司自主研发(货号：BT-02-11)。
1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；
(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；
(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。
1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀。
1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记。
1.4分别移取900μL细胞裂解液(Cell Lysis Solution)加至灭菌的1.5mLEppendorf管。
1.5小心移取300μL全血转移至上述加有细胞裂解液(Cell Lysis Solution)的1.5mL EP管。
1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min。
1.7 13000rpm室温离心20s。
1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀。
1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽。
1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击Eppendorf管底部，使白色沉淀重悬。
1.11移取300μL细胞核裂解液(Nuclei Lysis Solution)入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀。
1.12打开Eppendorf管，移取100μL蛋白沉淀液(Protein PrecipitationSolution)入上述Eppendorf管中，盖上管盖，振荡器上剧烈振荡20s；13000rpm室温离心3min。
1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管。
1.14移取300μL异丙醇入Eppendorf管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出。
1.15 13000rpm室温离心1min。
1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清。
1.17移取300μL 75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀。
1.18 13000rpm室温离心1min。
1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清。
1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干。
1.21目测沉淀大小，加入50～100μL DNA复溶液(DNA Rehydration Solution)至沉淀。
1.22过夜溶解后用NanoDrop紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于等于20ng/μL且OD260/OD280为1.9±0.2视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解核酸。
1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护。
1.24保存核酸标本至4℃冰箱。
2.荧光定量PCR反应，PCR反应所使用试剂盒为宝藤生物医药科技股份有限公司自主研发(货号：BT-20-15)。
2.1在试剂准备区配制25μL PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如表2所示。
表2
样品 体积
酶混合液 12.5μL
MonkeyPox-F(10μM) 0.4μL
MonkeyPox-R(10μM) 0.4μL
MonkeyPox-P-MB-Wt(10μM) 0.2μL
MonkeyPox-P-MB-Mt(10μM) 0.2μL
Rnase P-F(10μM) 0.15μL
Rnase P-R(10μM) 0.15μL
Rnase P-MB-R(10μM) 0.1μL
模板 2μL
ddH2O 补足至25μL
2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加2.0μL至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号；PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心。
2.3设置程序后在将PCR管放入适配器，并安装到扩增仪内，并按照表3设置反应程序；反应程序所选通道包括FAM/VIC/ROX。
表3
Figure BDA0003842578090000141
Figure BDA0003842578090000151
2.4点击“start”开始仪器运行。
3.结果判读：分别看对应的FAM、VIC和ROX通道是否出现特异性的扩增曲线。本实施例中，FAM通道会出现野生型的S形扩增曲线，VIC通道会出现突变的S形扩增曲线，ROX通道会出现内标的扩增曲线。扩增结果与预期一致，FAM通道出现野生型的S形扩增曲线，VIC通道出现突变的S形扩增曲线，ROX通道出现内标的扩增曲线，结果表明，MonkeyPOX virus-F、MonkeyPOX virus-R和对应的分子信标能够对猴痘进行检测，并且对野生型和突变型具有良好的区分能力。
4.一代测序结果分析
在“experiment”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“gene scaning”，点击“Calculate”键，对所有检测标本进行基因型分析。
对比例4
本对比例使用对比例1-3中的引物SEQ ID No.10-15进行扩增，扩增结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003842578090000152
Figure BDA0003842578090000161
从表4的结果可知，与MonkeyPOX virus-F1和MonkeyPOX virus-R1的组合、MonkeyPOX virus-F2和MonkeyPOX virus-R2的组合、MonkeyPOX virus-F3和MonkeyPOXvirus-R3的组合相比较，MonkeyPOX virus-F和MonkeyPOX virus-R的组合能够对F3L基因进行特异性扩增。在MonkeyPOX virus-F1和MonkeyPOX virus-R1的组合中，尽管MonkeyPOXvirus-F1与MonkeyPOX virus-F的序列一致，但是由于下游引物的变化，最终出现了非特异性扩增，说明MonkeyPOX virus-F和MonkeyPOX virus-R的组合为检测猴痘的最优引物。
实施例4
本实施例对12例待测样本(由复百澳(苏州)生物科技有限公司合成的假病毒)进行荧光定量PCR检测，参照实施例3所示的步骤进行实验。将12例样本的荧光定量PCR检测与一代测序进行对比实验。
统计荧光定量PCR检测与一代测序的用时情况，其中，12例样本荧光定量PCR检测1.5h+结果分析0.5h，合计2h。而一代测序检测8h+结果分析1h，合计9h。且荧光定量PCR检测为闭管操作，不需进行产物纯化测序等二次处理，因而也不存在扩增产物污染的风险。12例样本荧光定量PCR与一代测序检测结果的对比结果如表5所示。
表5
Figure BDA0003842578090000162
Figure BDA0003842578090000171
从表5的可知，自主研发的qPCR的阳性检出率(阳性符合率，敏感性)显著高于一代测序且相对于一代测序本检测体系具备检测时间短、操作简便且闭管操作的优势。
实施例5
本实施例进行灵敏度检测。
将待检测的野生型、突变型扩增子区域分别克隆到两个质粒上，由上海复百澳生物科技有限公司完成合成并且进行质粒定量。将质粒分布按照野生型、突变型和杂合型依次10倍倍比稀释至10000copies/μL、1000copies/μL、10copies/μL、1copies/μL，对上述稀释比的病毒进行荧光定量PCR反应。荧光定量PCR反应的步骤参照实施例3，PCR体系中各组分添加量如表6所示，将所列分子信标与TaqMan探针分别配制扩增体系，按照实施例3中的反应条件进行扩增和熔解曲线实验。
表6
Figure BDA0003842578090000172
Figure BDA0003842578090000181
扩增检测结果如图1-6所示，图1、图2和图3为信标法扩增图谱，其中，图中，图2扩增曲线为FAM通道即野生型，图3扩增曲线为VIC通道即突变型，图1扩增曲线为ROX通道即内标。
图4、图5、图6为TaqMan探针法扩增图谱，其中，图5扩增曲线为FAM通道即野生型，图6扩增曲线为VIC通道即突变型，图4扩增曲线为ROX通道即内标。
灵敏度检测结果表明：采用信标法对野生型猴痘病毒、突变型猴痘病毒以及杂合型猴痘病毒的检测下限均为1拷贝；信标法检测的灵敏度高于TaqMan探针法，检测效果较好。
实施例6
本实施例进行熔解曲线实验，验证分子信标对野生型和突变型猴痘病毒的区分能力，PCR体系和反应程序如表7和表8所示。
表7
样品 体积
酶混合液 12.5μL
MonkeyPox-F(1μM) 0.4μL
MonkeyPox-R(10μM) 0.4μL
MonkeyPox-P-MB-Wt(10μM) 0.2μL
模板 2μL
ddH2O 补足至25μL
反应程序：(通道选择FAM)。
表8
Figure BDA0003842578090000182
Figure BDA0003842578090000191
将所列分子信标配制扩增体系，按照反应条件进行扩增。熔解曲线结果如图7所示，70℃左右对应的熔解峰为野生型熔解峰，65℃左右对应的熔解峰为突变型熔解峰。结果表明，信标法所获得的熔解曲线可以显著区分野生型和突变型。
综上，本发明所设计的引物能够特异性扩增靶序列，所设计的分子信标能够高效的区分野生型和突变型猴痘病毒。应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测猴痘病毒野生型型及其变异株，检测敏感性高、特异性好，检出下限均可以达到1拷贝，具有高通量、低成本等特点；并且还可以通过分子信标熔解曲线法对猴痘病毒野生型及其变异株进行有效区分，能够满足临床检验实际工作中相关病原检测的要求。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，所述引物分子信标组合包括分别特异性扩增并检测猴痘病毒F3L基因的引物对和分子信标；
特异性扩增所述猴痘病毒F3L基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，检测野生型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，检测突变型猴痘病毒的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，所述引物分子信标组合还包括分别特异性扩增并检测内标基因的引物对和分子信标，所述内标基因为RNase P基因；
优选地，特异性扩增所述内标基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示；
优选地，检测所述内标基因的分子信标的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合，其特征在于，所述分子信标均带有荧光基团和淬灭基团，检测野生型猴痘病毒的分子信标、检测突变型猴痘病毒的分子信标和检测内标基因的分子信标的荧光基团均不同；
优选地，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、JOE、TET、CY3、CY5、Texas Red或LC RED460中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述淬灭荧光基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中任意一种或至少两种的组合。
5.一种检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合。
6.一种权利要求5所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
(1)采集样本并提取DNA，配制PCR扩增体系；
(2)对步骤(1)中的PCR体系进行扩增检测；
(3)根据步骤(2)中获得的扩增曲线对猴痘病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中的病原体感染情况。
7.根据权利要求6所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述PCR扩增体系包括酶混合液、上游引物、下游引物、野生型分子信标、突变型分子信标和模板；
优选地，所述上游引物和下游引物的终浓度各自独立为100-400nM；
优选地，所述野生型分子信标和突变型分子信标的终浓度各自独立为100-400nM；
优选地，所述模板的终浓度为100-108拷贝；
优选地，所述扩增检测的反应条件为：预变性：94-97℃、4-5min；变性：94-97℃、8-12s，延伸58-62℃，28-32s，40-45个循环；
熔解曲线程序为：变性94-97℃、0.8-1.2min；退火44-46℃、115-125s；以0.01-0.3℃/s的升温速率升温至94-97℃。
8.根据权利要求6或7所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，进行扩增检测过程中，所述PCR扩增体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸野生型分子信标的Tm值大于与之匹配的两个引物的Tm值，且对应相同靶序列的双标记寡核苷酸野生型分子信标的实时扩增荧光信号能被正常检测。
9.一种检测猴痘病毒野生型和突变型的系统，其特征在于，所述系统包括：
(1)样品制备模块：采集样本并提取DNA，配制PCR扩增体系；
(2)扩增检测模块：对样品制备模块中的PCR体系进行扩增检测；
(3)分析模块：根据扩增检测模块中获得的扩增曲线和熔解曲线对猴痘病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中的病原感染情况。
10.权利要求1-4中任一项所述的用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合、权利要求5所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的检测试剂盒或权利要求9所述的检测猴痘病毒野生型和突变型的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测猴痘病毒的产品中的应用。
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