CN110273027B - 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒，试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、PCR酶混合液、诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品，该配方可用于病毒RNA快速提取，且提高PCR检测效率；诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂包含：诺如病毒GⅠ型扩增引物F1、R1和探针P1，诺如病毒GⅡ型扩增引物F2、R2和探针P2，诺如病毒GⅣ型扩增引物F3、R3和探针P3；该引物探针序列为首创且设计独特，特异性好，灵敏度高。本发明还提供了诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测方法。本发明可以多通道同时检测出待测标本中是否含有诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型的病原体，实现快速、精确检测并对病毒进行定量，应用极为方便。

Description

诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，涉及一种RT-PCR扩增技术，具体涉及一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒及检测方法。
背景技术
诺如病毒，又称诺瓦克病毒(Norwalk Viruses，NV)是人类杯状病毒科(HumanCalicivirus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus,NV)属的一种病毒，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。诺如病毒分5个基因组(GⅠ-GⅤ)，其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人，GⅢ和GⅤ分别感染牛和鼠。诺如病毒对外界环境的抵抗力强、感染剂量低，感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短，且传播途径多样、全人群普遍易感，具有高度传染性和快速传播能力，通常能引起自限性、轻中度的胃肠道感染症。诺如病毒已被认为是世界范围内流行性、非细菌胃肠炎暴发的主要原因之一。
诺如病毒传播途径包括人传人、经食物和经水传播。近年来，全球食源性疾病和恶性食品污染事件频频的发生，使食品安全已成为一个严重并不断扩大的世界卫生问题，并日益成为全球关注的热点。作为食品安全的头号问题，食源性疾病的发生中多数是由诺如病毒引起的，且发病率较高，是一个严重的公共卫生问题。
荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸(DNA/RNA)分子检测。目前，荧光定量PCR技术已成为诺如病毒的主要检测方法。国内针对诺如病毒的荧光定量PCR检测试剂主要以单纯检测诺如病毒GI、GII型居多，中国专利文献CN101153341A公开了诺如病毒GⅡ型检测用引物、检测方法、检测试剂盒，中国专利文献CN108085414A公开了诺如病毒GI型和GII型检测引物探针组，然而针对三种致病性的诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型分型检测方法未见报道。因此，本领域技术人员极有必要利用该平台开发一种高敏感、高特异、高准确性的多重实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，实现多重联合检测并区分诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒及检测方法。
为实现上述目的提供一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒，本发明采用了以下技术方案：
一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒，所述试剂盒包括：病毒核酸快速提取试剂，PCR扩增试剂，PCR酶混合液，诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂，阳性对照品，阴性对照品。
优选的，所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的100mM Tris-HCl、5％v/vTween20、4M异硫氰酸胍、50mM KCl、pH为8.0的2mM EDTA。
优选的，所述PCR扩增试剂包含：2×PCRbuffer、50mM MgCl2、pH为10.0的100mMTris-HCl、0.5mM dNTP、5％g/mL BSA。
优选的，所述阳性对照品为：诺如病毒GⅠ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅡ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅣ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，三种质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将三种稀释后的质粒按照1:1:1等体积混合，作为最终的阳性对照。
优选的，所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNase抑制剂。
优选的，所述诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂包含：诺如病毒GⅠ型扩增引物F1、R1和探针P1；诺如病毒GⅡ型扩增引物F2、R2和探针P2；诺如病毒GⅣ型扩增引物F3、R3和探针P3；
探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；引物探针序列如表1所示。
表1.引物和探针列表
Figure BDA0002102136090000031
进一步的，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
本发明还提供了一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后直接用于PCR检测；
S2、以步骤S1中的混合物为模板，同时使用阳性对照品和阴性对照品，利用检测诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂进行多重荧光定量RT-PCR检测；
S3、数据处理：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
优选的，步骤S2中荧光定量PCR的扩增体系如表2所示。
表2.PCR扩增体系
Figure BDA0002102136090000041
优选的，步骤S2中荧光定量PCR的反应条件如表3所示。
表3.PCR扩增程序
Figure BDA0002102136090000042
本发明的有益效果在于：
1)本发明采用的病毒核酸快速提取试剂配方为自主特需设计，该配方可用于病毒RNA快速提取，既能有效裂解病毒外壳、抑制RNA酶的活性从而获得病毒RNA，又能保证配方中的各试剂成分不影响后续PCR扩增。本提取试剂整个操作过程只需要常温静置5-10min，大大缩短了提取时间、提高了提取效率；而常规的病毒RNA提取试剂需要30-90min，且病毒RNA具有一定的损失而导致提取效率不高。此外，本发明提供的核酸快速提取试剂配方加入一定量的KCl，能够促进引物退火，从而对后续PCR扩增体系具有促进作用，提高PCR检测效率。
2)本发明针对诺如病毒GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型特异性的扩增引物探针，该引物探针序列为首创且设计独特，特异性好，灵敏度高，能够实现高效、精准且多通道同时检测诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型，并能根据不同荧光通道的扩增阳性结果对其分型。
3)本发明在多通道同时检测出待测标本中是否含有诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型病原体，应用极为方便。
综上所述，本发明引入了诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型特异性的多通道引物探针，既可减少工作量、又避免了其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，同时还能实现同一体系同时检测并区分三种亚型的诺如病毒且各通道引物探针相互无干扰。本发明不仅首次公开了针对诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型分型检测的实时荧光定量RT-PCR方法，同时具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而实现快速诊断是否感染诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型。基于此，本试剂盒适合人类感染性诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型大规模筛查及诊断的推广应用，具有广泛的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对诺如病毒GⅠ型阳性样本和阳性对照的检测结果图。
图2为依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对诺如病毒GⅡ型阳性样本和阳性对照的检测结果图。
图3为依据本发明建立的荧光RT-PCR方法对诺如病毒GⅣ型阳性样本和阳性对照的检测结果图。
图4为FAM荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/L浓度的诺如病毒GⅠ型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图5为VIC荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/L浓度的诺如病毒GⅡ型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图6为CY5荧光通道模式下，采用本发明扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/L浓度的诺如病毒GⅣ型进行扩增检测的结果，对应从A至E的扩增曲线。
图7为从诺如病毒GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型疑似患者的24份临床样本中提取病毒RNA，用本发明荧光RT-PCR方法进行检测的结果图。
图8为本发明病毒核酸快速提取试剂对诺如病毒GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型检测中PCR扩增体系的影响对比图。
图9为依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法检测诺如病毒GⅠ、GⅡ、GⅣ型标准品的准确性检测结果图。
图10为本发明病毒核酸快速提取试剂与市售提取试剂的提取效率比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是,在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
下列实施例中，采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1——诺如病毒GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型核酸分型检测试剂盒
一种利用实时荧光RT-PCR多重检测诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型的试剂盒，包括：病毒核酸快速提取试剂，PCR扩增试剂，PCR酶混合液，诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂，阳性对照品，阴性对照品。其中：
(1)所述病毒核酸快速提取试剂包括裂解试剂，裂解试剂包含：pH为10.0的100mMTris-HCl、5％v/v Tween20、4M异硫氰酸胍、50mM KCl、pH为8.0的2mM EDTA。
(2)所述PCR扩增试剂包括包括PCR扩增缓冲液；具体包含：2×PCR buffer、50mMMgCl2、pH为10.0的100mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、5％g/mL BSA。
(3)所述PCR酶混合液包括0.5U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNase酶抑制剂。
(4)所述诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂包括：诺如病毒GⅠ型特异性的引物和探针(F1、R1、P1)、诺如病毒GⅡ型特异性的引物和探针(F2、R2、P2)、诺如病毒GⅣ型特异性的引物和探针(F3、R3、P3)；探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ。具体的，特异性引物和探针如表3所示；其中，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM。
(5)阳性对照品：以诺如病毒GⅠ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅡ型的特异性扩增片段连接到另一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅣ型的特异性扩增片段连接到一个另外pUC57质粒载体上，三种质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将三种稀释后的质粒按照1:1:1等体积混合，作为诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型阳性对照。
(6)阴性对照品：DEPC H2O。
实施例2——诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测方法
一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型的实时荧光RT-PCR多重分型检测方法，包括以下实验步骤：
(1)主要试剂、仪器：采用实施例1中的试剂盒试剂；荧光定量PCR仪为ABI7500。
(2)标本准备：阳性标本为诺如病毒GⅠ型感染阳性病人样本、诺如病毒GⅡ型感染阳性病人样本、诺如病毒GⅣ感染阳性病人样本，然后用DEPC水进行不同倍数的稀释，阴性对照标本为诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型感染阴性病人样本。
(3)核酸提取：将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液直接用于PCR检测。
(4)特异性RT-PCR扩增：
a.引物和探针的设计：根据诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型的特异性序列分别设计特异性的引物和探针，其引物探针序列为：
F1 5’-CCAGACAGAGTCAATGTTAA-3’
R1 5’-CAGCGTCATYGACGCCATCT-3’
P1 5’-FAM-CTAACCAACTGCGAGCGATC-BHQ-3’
F2 5’-ATGTTAAGRTGATGAGGTTTGC-3’
R2 5’-TCGACGCCTATCATCATTCA-3’
P2 5’-VIC-CACGCCGAGGCGATCGCAATC-BHQ-3’
F3 5’-CTCCCACCTGGCGCTCACA-3’
R3 5’-AATTCACTCTCCTCTCACAG-3’
P3 5’-CY5-AAGGAGTGGTYAAGAATCACGC-BHQ-3’
b.阳性对照：本方法中的阳性对照为诺如病毒GⅠ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅡ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅣ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，三种质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将三种稀释后的质粒按照1:1:1等体积混合，最终作为本方法中的阳性对照。
c.RT-PCR反应平台：总体积25μl的多重荧光RT-PCR扩增体系中分别加入PCR扩增试剂12μl，PCR酶混合液4μl，诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂4μl，核酸标本5μl。PCR扩增的反应条件为50℃逆转录15min；95℃预变性5min；95℃变性10s，55℃退火和延伸40s，40个循环。
d.数据处理：反应结束后，根据实际情况分别调节FAM通道、VIC通道和CY5通道的Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值(Start值建议设在3-15、End值建议设在5-20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis获得分析结果，得到FAM、VIC以及CY5通道的Ct值。
e.有效性判断：阴/阳性对照品检测结果需满足表4要求，否则，本次实验结果无效。
表4.阴/阳性对照品判读标准
荧光通道 阴性对照品 阳性对照品
FAM通道 无Ct值 Ct≤35
VIC通道 无Ct值 Ct≤35
CY5通道 无Ct值 Ct≤35
f.结果判读：
f1.FAM通道Ct≤39，诺如病毒GⅠ型阳性；
f2.VIC通道Ct≤39，诺如病毒GⅡ型阳性；
f3.CY5通道Ct≤39，诺如病毒GⅣ型阳性；
f4.FAM通道Ct＞39或Ct无数值，诺如病毒GⅠ阴性；VIC通道Ct＞39或Ct无数值，诺如病毒GⅡ阴性；CY5通道Ct＞39或Ct无数值，诺如病毒GⅣ型阴性。
(5)实验结果：
a.特异性检测结果：如图1所示，依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法针对诺如病毒GⅠ型具有较好的特异性，诺如病毒GⅠ型阳性样本及阳性质粒的FAM荧光通道检测结果显示阳性(阳性样本和阳性质粒的CT值分别为30、24)、而VIC/CY5荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应；如图2所示，依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法针对诺如病毒GⅡ型具有较好的特异性，诺如病毒GⅡ型阳性样本及阳性质粒的VIC荧光通道检测结果显示阳性(阳性样本和阳性质粒的CT值分别为27、21)、而FAM/CY5荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应；如图3所示，依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法针对诺如病毒GⅣ型具有较好的特异性，诺如病毒GⅣ型阳性样本及阳性质粒的CY5荧光通道检测结果显示阳性(阳性样本和阳性质粒的CT值分别为29、21)、而FAM/VIC荧光通道为阴性，且对其它病原体和空白对照等均无交叉反应。如下表5所示。
表5.诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂对不同诺如病毒类型的检测结果
Figure BDA0002102136090000091
Figure BDA0002102136090000101
b.灵敏性试验结果：将已知高浓度的诺如病毒GⅠ型的病毒原液分别稀释至1000、100、10、5、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光RT-PCR方法进行检测，如图4(FAM荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、100、10、5、0TCID50/L浓度的诺如病毒GⅠ型进行扩增检测的结果，FAM荧光通道Ct值依次为24、28、35、37、无数值，结果表明多重荧光RT-PCR方法检测诺如病毒GⅠ型的敏感性达到5TCID50/L(Ct值为37)；将已知高浓度的诺如病毒GⅡ型的病毒原液分别稀释至1000、500、50、5、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光RT-PCR方法进行检测，如图5(VIC荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对1000、500、50、5、0TCID50/L浓度的诺如病毒GⅡ型进行扩增检测的结果，VIC荧光通道Ct值依次为20、22、28、35、无数值，结果表明多重荧光RT-PCR方法检测诺如病毒GⅡ型的敏感性达到5TCID50/L(Ct值为35)；将已知高浓度的诺如病毒GⅣ型的病毒原液分别稀释至500、50、10、2、0TCID50/L，用本试剂盒提供的病毒核酸快速提取试剂进行DNA提取，然后用本发明建立的多重荧光RT-PCR方法进行检测，如图6(CY5荧光通道)所示，图中从A至E的扩增曲线依次表示采用本扩增体系对500、50、10、2、0TCID50/L浓度的诺如病毒GⅣ型进行扩增检测的结果，CY5荧光通道Ct值依次为26、28、30、36、无数值，结果表明多重荧光RT-PCR方法检测诺如病毒GⅣ型的敏感性达到2TCID50/L(Ct值为36)。
c.临床样本的检测结果：从诺如病毒GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型疑似患者的24份临床样本中提取病毒RNA，用本发明多重荧光RT-PCR方法进行检测，结果如图7所示，本发明方法检测出诺如病毒GⅠ型阳性3例(FAM荧光通道)、诺如病毒GⅡ型阳性4例(VIC荧光通道)、诺如病毒GⅣ型阳性1例(CY5荧光通道)。
d.准确度检测结果：分别采用诺如病毒GⅠ、GⅡ、GⅣ型阳性标准品和诺如病毒GⅠ/Ⅱ/Ⅳ型阴性标准品，用本发明多重荧光RT-PCR方法进行检测，结果如图9所示，本发明方法检测诺如病毒GⅠ型阳性标准品的结果为阳性(FAM荧光通道CT值为24、VIC/CY5荧光通道CT无数值)，检测诺如病毒GⅡ型阳性标准品的结果为阳性(VIC荧光通道CT值为23、FAM/CY5荧光通道CT无数值)，检测诺如病毒GⅣ型阳性标准品的结果为阳性(CY5荧光通道CT值为21、VIC/FAM荧光通道CT无数值)，检测诺如病毒GⅠ/Ⅱ/Ⅳ型阴性标准品的结果为阴性(FAM/VIC/CY5荧光通道CT无数值)，结果表明依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法检测诺如病毒GⅠ、GⅡ、GⅣ型标准品的准确性为100％。
e.重复性检测结果：采用3例阳性样本(分别为诺如病毒GⅠ、GⅡ、GⅣ型阳性)，用本发明多重荧光RT-PCR方法各重复检测5次检测，结果如表6所示，各样本重复5次检测结果CT值的CV＜3％(CV＝CT标准偏差÷CT平均值)，其中，CV值为变异系数，是衡量指标中各观测值变异程度的一个统计量，荧光PCR平台通常使用CT值的CV值来衡量检测重复性，表明本实施例依据本发明建立的多重荧光RT-PCR方法的检测重复性较好。
表6.诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂的重复性检测结果
Figure BDA0002102136090000111
Figure BDA0002102136090000121
综上所述，本实施例中检测结果显示表明本发明方法的敏感性好、特异性高、重复性好且准确可靠。
本发明公开的检测方法的直接目的不是获得诊断结果和健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的样品进行检测，所获得的仅仅是作为中间结果的信息。
实施例3——验证病毒核酸快速提取试剂中的KCl对荧光PCR检测效果的影响
(1)按照本发明提供的配方配制含有KCl的病毒核酸快速提取试剂A：pH为10.0的100mM Tris-HCl、5％v/v Tween20、4M异硫氰酸胍、50mM KCl、pH为8.0的2mM EDTA。
(2)配制不含KCl的病毒核酸快速提取试剂B：pH为10.0的100mM Tris-HCl、5％v/vTween20、4M异硫氰酸胍、pH为8.0的2mM EDTA。
(3)采用诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型阳性临床样本，分别用病毒核酸快速提取试剂A、病毒核酸快速提取试剂B与样本等体积混合，常温静置5-10分钟，然后将裂解混合液A、B分别用于PCR检测。
(4)采用本发明提供的诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型荧光PCR检测试剂进行PCR检测，PCR检测步骤同实施例2。
从图8所示的荧光定量PCR检测结果显示，不含KCl的病毒核酸快速提取试剂B的扩增结果FAM、VIC和CY5通道Ct值(分别为24、30、36)均落后于含有KCl的病毒核酸快速提取试剂A(分别为22、29、35)。由此可见，本发明提供的病毒核酸快速提取试剂引入KCl，对PCR扩增体系具有促进作用，能够有效提高PCR扩增效率。
实施例4——病毒核酸快速提取试剂的提取效率比较
(1)采用3例已知阳性的咽拭子临床样本(分别为诺如病毒GⅠ、GⅡ、GⅣ型阳性)，分别用本发明提供的病毒核酸快速提取试剂和市售的北京庄盟国际生物基因科技有限公司的Virus RNA Kit(ZP414)进行核酸提取，然后分别用于PCR检测。
(2)采用本发明提供的诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型荧光PCR检测试剂进行PCR检测，PCR检测步骤同实施例2。
从图10所示的荧光定量PCR检测结果显示，采用市售的北京庄盟国际生物基因科技有限公司Virus RNA Kit(ZP414)的扩增结果FAM、VIC和CY5通道Ct值(分别为31、24、35)均落后于本发明提供的病毒核酸快速提取试剂的扩增结果FAM、VIC和CY5通道Ct值(分别为29、22、34)。由此可见，本发明提供的病毒核酸快速提取试剂的提取效率高于市售的北京庄盟国际生物基因科技有限公司Virus RNA Kit(ZP414)。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 上海伯杰医疗科技有限公司
<120> 诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagacagag tcaatgttaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagcgtcaty gacgccatct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctaaccaact gcgagcgatc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgttaagrt gatgaggttt gc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgacgccta tcatcattca 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacgccgagg cgatcgcaat c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcccacctg gcgctcaca 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattcactct cctctcacag 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaggagtggt yaagaatcac gc 22

Claims (1)

1.一种诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括病毒核酸快速提取试剂，PCR扩增试剂，PCR酶混合液，诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂，阳性对照品，阴性对照品；
其中，所述病毒核酸快速提取试剂包含：pH为10.0的100mM Tris-HCl、5%v/v Tween20、4M 异硫氰酸胍、50mM KCl、pH为8.0的2mM EDTA；
所述PCR扩增试剂包含：2×PCR buffer、50mM MgCl2、pH为10.0的100mM Tris-HCl、0.5mM dNTP、5%g/mL BSA；
所述PCR酶混合液包括0.5 U/μl逆转录酶、5U/μl DNA聚合酶、5×RNase抑制剂；
所述阳性对照品为：诺如病毒GⅠ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅡ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，诺如病毒GⅣ型的特异性扩增片段连接到一个pUC57质粒载体上，三种质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将三种稀释后的质粒按照1:1:1等体积混合，作为最终的阳性对照；
所述诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂包含：诺如病毒GⅠ型扩增引物F1、R1和探针P1，诺如病毒GⅡ型扩增引物F2、R2和探针P2，诺如病毒GⅣ型扩增引物F3、R3和探针P3；
探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ； 引物探针序列如下：
Figure 446301DEST_PATH_IMAGE002
其中，各引物浓度均为0.2mM，探针浓度均为0.1mM；
所述检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
S1、将病毒核酸快速提取试剂和待测样品等体积混合，常温静置5-10分钟，然后直接用于PCR检测；
S2、以步骤S1中的混合物为模板，同时使用阳性对照品和阴性对照品，利用检测诺如病毒GⅠ、GⅡ和GⅣ型核酸检测试剂进行多重荧光定量RT-PCR检测；
S3、数据处理：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
其中，步骤S2中荧光定量PCR的扩增体系如下：
Figure 894600DEST_PATH_IMAGE003
步骤S2中荧光定量PCR的反应条件如下：
Figure 471074DEST_PATH_IMAGE004
。
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