CN112063756B - 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒，具体地本发明公开了一种基于实时荧光定量PCR技术平台，多重检测H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒，Yamagata、Victoria等乙型流感病毒，2019‑nCoV OFR1ab、N基因及人源内标基因GAPDH的方法、引物、探针及其试剂盒，具有检测操作简单、绝对定量、灵敏度高、特异性强及重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及一种基于实时荧光定量PCR检测技术平台，定性检测人鼻咽拭子、咽拭子、痰液等样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒核酸检测的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。
背景技术
甲型流感病毒是由A型流感病毒(Influenza A)引起的一种人畜共患的疾病综合症。禽类感染Influenza A后，可出现从亚临床症状到轻度上呼吸道症状、委顿、乃至全身致死性疾病综合征。目前已有许多甲型流感病毒如H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N9等由禽类传播到人类中，死亡率极高，导致严重的公共卫生事件，不同型别的毒株感染在临床症状上高度类似，并且与造成流感样症状的其他病原也难以区别。监测是确定甲型流感流行株、发现变异株、预测和防控疫情的基础。因此，建立快速、准确、简单、高灵敏度的检测方法显得尤为迫切。
乙型流感病毒(Influenza B virus)是流感的主要病原之一，主要经飞沫及接触传播，人群普遍敏感。乙型流感病毒引起的症状特点是起病急骤，畏寒、发热，体温在数小时至24小时内升达高峰，39-40℃甚至更高；伴头痛，全身酸痛，乏力，食欲减退；呼吸道症状较轻，咽干喉痛，干咳，可有腹泻；颜面潮红，眼结膜外眦充血，咽部充血，软腭上有滤泡。乙型流感病毒根据抗原特性和血凝素(HA1)基因的核酸序列，可以分为不同的谱系。病毒大多数的谱系在自然选择中消失，目前演变成抗原性差异较大的两大谱系，分别称为Yamagata系和Victoria系(简称为Y系和V系)。
2019新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)，为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Corona viridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronamirinae)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为四个属。该病毒对热敏感，56℃30分钟、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒，氯已定不能有效灭活病毒。临床症状以发热、乏力、干咳为主要表现。鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复多数恵者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。
甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒均为呼吸道病毒。甲型流感病毒和乙型流感病毒是最常见的流感病原，感染者初期症状与2019新型冠状病毒感染症状极为相似，均会表现出发热、咳嗽等症状，因此难以从临床症状对患者进行准确的鉴别诊断。
目前，甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒核酸常用的检测方法包括基于荧光PCR技术的单一病原体的检测技术、高通量测序法、恒温扩增等，荧光PCR技术检测特异性高、灵敏度强操作较为简单，但在对多个病原同时进行检测时常需分管进行针对性检测，不同病原体PCR扩增条件可能存在一定的差异，因此临床应用时需逐一排查，导致病原确定的周期加长，高通量测序技术虽然可同时对多种未知序列进行检测，但存在检测周期长、成本高昂且操作复杂、数据解读难等问题，而恒温扩增技术虽然检测时间短，但其检测设备并不成熟，临床试剂应用时需增够新型仪器才能进行配套检测。
因此，本领域迫切需要开发能够高效率检测、鉴别临床常见呼吸道病毒的方法以满足临床的需求。另外，有报道表明现有的临床使用的核酸检测试剂盒存在准确率较低的问题，因此需要开发具有较高的临床检测准确率的试剂盒产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种用于多重检测呼吸道病毒核酸的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对组，所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.5所示的正向引物；和，如SEQID NO.6所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对组，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQID NO.8所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第三引物对组，所述第三引物对组包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQID NO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第四引物对组，所述第四引物对组包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQID NO.4所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第五引物对组，所述第五引物对组包括如SEQ ID NO.9所示的正向引物；和，如SEQID NO.10所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种检测呼吸道病毒核酸的探针集，所述探针集包括：
选自下组的一种或多种检测探针：SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15。
在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
本发明的第三方面，提供了一种多重检测呼吸道病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针，其中所述引物包括多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8所示的引物；所述探针包括分别具有SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、和SEQ ID NO：14所示的多核苷酸序列的探针。
在另一优选例中，所述第一容器还包括5×RNA buffer和DEPC水。
在另一优选例中，所述引物探针混合液中还包含多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9、和SEQ ID NO：10所示的引物；以及，具有SEQ ID NO：15所示的多核苷酸序列的探针。
在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含热启动Taq酶、逆转录酶、和dNTPS。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照。优选地，所述阳性对照包括具有甲型流感病毒基因、乙型流感病毒基因、2019-nCoV ORF1ab基因、2019-nCoV N基因及内标GAPDH基因的病毒样颗粒。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为纯水。
本发明的第四方面，提供了一种检测呼吸道病毒核酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行荧光定量PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述核酸样本和引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针，其中所述引物包括多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：8所示的引物；所述探针包括分别具有SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、和SEQ ID NO：14所示的多核苷酸序列的探针。
在另一优选例中，所述引物探针混合液中还包含多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9、和SEQ ID NO：10所示的引物；以及，具有SEQ ID NO：15所示的多核苷酸序列的探针。
在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自人鼻咽拭子、咽拭子或痰液样本。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测呼吸道病毒核酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：本发明检测阴性对照的结果示意图；
图2：本发明检测甲型流感病毒阳性对照的结果示意图；
图3：本发明检测乙型流感病毒阳性对照的结果示意图；
图4：本发明检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因阳性对照的结果示意图；
图5：本发明检测2019新型冠状病毒N基因阳性对照的结果示意图；
图6：本发明检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒阳性对照的结果示意图；
图7：本发明2019-nCoV ORF1ab基因对照引物对1的特异性(甲流样本非特异性扩增)检测结果示意图；
图8：本发明2019-nCoV ORF1ab基因对照引物对2的检测结果示意图；
图9：本发明2019-nCoV ORF1ab基因对照引物对3的灵敏度检测结果示意图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒；具体地，本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台，多重检测疑似流感或新型冠状病毒肺炎患者鼻咽拭子、咽拭子或痰液等样本中H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒、Yamagata、Victoria等乙型流感病毒、2019-nCoVOFR1ab、N基因及人源内标基因GAPDH的方法、引物、探针及其试剂盒，具有检测操作简单、绝对定量、灵敏度高、特异性强及重复性好等优点。
荧光PCR技术是临床病原体检测中最常用的技术之一，然而由于各荧光通道之间存在信号干扰较强的原因，目前临床上常用的病原体检测多为单管单重检测，本发明通过大量的筛选优化测试，最终将甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒的检测合并到一个PCR反应管中，采用5个不同的荧光通道对各病原体进行检测，经优化测试将各通道之间的干扰降到最低，同时以人管家基因为内标，对样本采集、提取等过程进行监控，有效避免假阴性结果的产生。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
多重荧光PCR技术能够在一个PCR反应管中对多种核酸分子进行定性检测，在检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒核酸时，通过不同荧光标记的探针结合特异扩增引物在一个PCR反应体系中，统一的PCR扩增条件下实现多个病原的同时检测。该方法具有灵敏度高，各荧光通道检测结果特异无信号串扰、检测结果稳定、操作简单且省时等优点。
应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明提供了一种基于实时荧光PCR平台多重检测H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒，Yamagata、Victoria等乙型流感病毒及2019-nCoV OFR1ab、N基因及人源内标基因GAPDH检测的方法、引物、探针及其试剂盒。提供了用于检测2019-nCoVOFR1ab、N基因检测所需的特异性引物、探针及试剂盒预混液。可以用于检测人鼻咽拭子、咽拭子或痰液样本。
在一个优选地实施方式中，所述引物包括针对H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒，Yamagata、Victoria等乙型流感病毒，2019-nCoVOFR1ab、N基因及人源内标基因GAPDH的引物；
其中，针对H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒的通用上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，针对H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒的通用下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
针对Yamagata、Victoria乙型流感病毒的通用上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，针对Yamagata、Victoria乙型流感病毒的通用下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
针对2019-nCoVOFR1ab基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，针对2019-nCoVOFR1ab基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
针对2019-nCoV N基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，针对2019-nCoV N基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
针对内标GAPDH基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，针对2019-nCoVN内标GAPDH基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
针对H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒的通用荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；
针对Yamagata、Victoria等乙型流感病毒的通用荧光探针序列如SEQ ID NO：12所示；
针对2019-nCoVOFR1ab基因的荧光探针序列如SEQ ID NO：13所示；
针对2019-nCoV N基因的荧光探针序列如SEQ ID NO：14所示；
针对人管家基因GAPDH的荧光探针序列如SEQ ID NO：15所示。
进一步，所述SEQ ID NO：11核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB，所述SEQ ID NO：12核苷酸序列的5’端标记有TexasRed、3’端标记有MGB，所述SEQ ID NO：13核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ2，所述SEQ ID NO：14核苷酸序列的5’端标记有TAMRA、3’端标记有BHQ2，所述SEQ ID NO：15核苷酸序列的5’端标记有CY5、3’端标记有MGB。
优选地，所述上游引物SEQ ID NO：1和下游引物SEQ ID NO：2，在反应体系中的终浓度为200nmol/L，所述上游引物SEQ ID NO：3、上游引物SEQ ID NO：9、下游引物SEQ IDNO：4和下游引物SEQ ID NO：10在反应体系中的终浓度为240nmol/L，所述上游引物SEQ IDNO：5、上游引物SEQ ID NO：7、下游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：8在反应体系中的终浓度为1000nmol/L，所述探针SEQ ID NO：11在反应体系中的终浓度为40nmol/L，所述探针序列SEQ ID NO：12在反应体系中的终浓度为120nmol/L，所述探针序列SEQ ID NO：13在反应体系中的终浓度为200nmol/L，所述探针序列SEQ ID NO：14在反应体系中的终浓度为240nmol/L，所述探针序列SEQ ID NO：15在反应体系中的终浓度为160nmol/L。
H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒，Yamagata、Victoria等乙型流感病毒，2019-nCoV OFR1ab、N基因及人源内标基因GAPDH检测引物探针序列如下：
所述特异性引物和探针，能够准确检测人是否感染甲型流感病毒、乙型流感病毒或2019新型冠状病毒。同时对2019-nCoV ORF1ab和N基因进行检测，对检测结果进行双重确认，以人管家基因GAPDH为内标，对核酸质量进行监控，在确定样本质量合格的情况下对新型冠状病毒疑似感染者进行检测确诊。
上述特异性引物和探针所制备的试剂盒，基于临床常用荧光PCR平台在一个PCR反应管中可同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019-nCoV ORF1ab和N基因，为患者的及时确诊及隔离治疗提供确诊依据。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种人鼻咽拭子、咽拭子或痰液样本核酸2019-nCoV核酸检测试剂盒，包括用于配制PCR反应的引探混合物、5×RNAbuffer、热启动Taq酶和逆转录酶、对照样本和RNase-free水，其中，引物探针混合液包括如下成分，如表1，
表1引物探针混合液
其中，SEQ ID NO：11的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID NO：12的5’端标记有TexasRed荧光报告基团，3’端标记有MGB；SEQ ID NO：13的5’端标记有VIC荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID NO：14的5’端标记有TAMRA荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团；SEQ ID NO：15的5’端标记有CY5荧光报告基团，3’端标记有MGB。
样本检测时，甲型流感病毒通用上下游引物和探针，分别与所扩增的目的片段结合，释放FAM荧光信号；乙型流感病毒通用上下游引物和探针，分别与所扩增的目的片段结合，释放TexasRed荧光信号；2019新型冠状病毒ORF1ab基因扩增引物和探针，分别与所扩增的目的片段结合，释放VIC荧光信号；2019新型冠状病毒N基因扩增引物和探针，分别与所扩增的目的片段结合，释放TAMRA荧光信号；内标基因扩增引物和探针，分别与所扩增的目的片段结合，释放CY5荧光信号；所述内控引物与探针是根据人管家基因保守片段设计并合成的，用于样本和实验过程的监控；
所述PCR反应液的5×RNA buffer包括如下成分，如表2，
表2 5×RNA buffer
| 编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
| 1 | 5×RNA buffer | (NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、KCl、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub> |
所述对照品包括如下成分，如表3，
表3对照样本
| 编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
| 1 | 阴性对照 | DEPC水 |
| 2 | 阳性对照 | 人工制备病毒样颗粒 |
所述阳性对照的为人工制备的甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019-nCoV OFR1ab基因、N基因及内标基因病毒样颗粒，阴性对照样本为DEPC水。
本发明所述试剂盒适用样本为人鼻咽拭子、咽拭子或痰液样本。
本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，当检测结果的阳性对照组为阳性，且阴性对照组均为阴性时，表明实验结果有效。
本发明还公开了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒和2019-nCoV病毒核酸定性检测的方法，具体步骤包括：
1.处理待测样本并提取核酸样本，可以是人鼻咽拭子、咽拭子或痰液样本，优选地，待测样本为人鼻咽拭子、咽拭子。
2.配制PCR反应体系，将特异性引物和探针、5×RNA buffer、热启动Taq酶和逆转录酶，加入提取的核酸5μL，制备得到甲型流感病毒/乙型流感病毒/2019新型冠状病毒PCR反应液；反应液构成分别如表4，
表4甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒PCR反应液
3.将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。
4.荧光通道选择：
1)选择FAM通道检测甲型流感病毒；
2)选择VIC通道检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因；
3)选择TexasRed通道检测乙型流感病毒；
4)选择TAMRA通道检测2019新型冠状病毒N基因；
5)选择CY5通道检测内标基因；
6)选择参比荧光(Passive Reference)为None。
5.设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL。
6.设置完成后，保存文件，运行程序。
本申请采用的PCR检测原理如下：应用实时荧光PCR技术，设计特异性引物和探针在一个PCR反应管内对人类鼻咽拭子、口咽拭子或痰液样本中可能存在的甲型流感病毒、乙型流感病毒或2019新型冠状病毒进行检测。设计的特异性引物和探针，采用不同的荧光报告基团分别对甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒进行标记，配以热启动DNA聚合酶、逆转录酶等成分组成核酸扩增试剂，使用荧光PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，将提取的核酸加入PCR反应管中，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(Ct值)实现对未知样本的定性检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒及新型冠状病毒核酸的方法、引物、探针与试剂盒。使用本发明提供的特异性引物与探针，能够快速、高灵敏且稳定地检测疑似感染者是否感染甲型流感病毒、乙型流感病毒或2019新型冠状病毒。本发明能最低能检测出的病毒拷贝数为200copies/mL，具有较的灵敏度。操作过程简单、能在一个反应管中完成三种病原体的定性检测，其中所检测的甲型流感病毒涵盖国内5种常见亚型包括H1N1(2009)、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9，检测乙型流感病毒涵盖2种亚型包括Yamagata、Victoria型，2019新型冠状病毒采用双靶标进行检测，检测结果更为可靠，同时以人管家基因为内标，对核酸质量及样本采集等进行把控，有效排除假阴性结果的产生。本发明适用于对疑似流感或新型冠状病毒肺炎者进行病毒核酸检测，对患者进行确诊，辅助指导临床医生开展治疗工作，值得推广应用。
另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，可以对环境样本进行检测，以公共卫生管理之需，也可以用于呼吸道常见病毒新药的研发。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：检测方法及试剂盒
本实施例提供了可在一个反应管中同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒及内标核酸检测的方法、引物、探针及试剂盒，使得检测体系灵敏度可以达到200copies/mL。具体实施步骤如下：
步骤一、待测样本RNA模板提取
采集人鼻咽拭子样本置于拭子头浸入含采样液管中，做好标记确保标签信息无误后，4℃保存。12h内取200μL液态样本及试剂盒中的阴性和阳性对照进行核酸提取，使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒(磁珠法)粤穗械备20170583号和粤穗械备20150302号；也可使用其他的商业化产品；提取的模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
步骤二、PCR体系的制备
PCR体系配制前准备：取出试剂盒中的引物探针混合液A、5×RNA buffer、热启动Taq酶和逆转录酶等，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制PCR体系；PCR体系构成如表6：
表6.甲型流感病毒/乙型流感病毒/2019新型冠状病毒PCR体系
所述引物探针的核苷酸序列信息分别如下：
检测甲型流感病毒/乙型流感病毒/2019新型冠状病毒引物探针核苷酸序列信息：
步骤三、加样
取步骤一所制备的样本核酸模板及对照样本各5μL，加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使PCR反应液的总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于制备微反应；所述试剂盒的对照样本如表7：
表7.试剂盒的对照样本
| 编号 | 组分 | 组分中的主要成分 |
| 1 | 阴性对照 | DEPC水 |
| 2 | 阳性对照 | 人工制备的病毒样颗粒 |
所述阳性对照样本为分别含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019-nCoV ORF1ab基因、N基因及内标GAPDH基因的人工制备的病毒样颗粒样本的混合物；阴性对照样本为DEPC水。
步骤四、PCR扩增
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测甲型流感病毒；选择VIC通道检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因；选择TexasRed通道检测乙型流感病毒；
选择TAMRA通道检测2019新型冠状病毒N基因；选择CY5通道检测内标基因；选择参比荧光(Passive Reference)为None，设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
步骤五、结果读取及分析
反应结束后自动保存结果，根据扩增曲线划定合适的基线和阈值。基线(Baseline)的起始值(Start值)一般建议在3～15之间；基线的终止值(End值)一般建议在5～20之间；阈值(Threshold值)建议为各通道检测最高荧光值的1/20。基线和阈值设置完成后，点击分析(Reanalyse)自动获得各通道的Ct值，根据各通道Ct值进行结果判断。
本实施例提供的甲型流感病毒/乙型流感病毒/2019新型冠状病毒多重PCR检测试剂盒的组成成分、包装及数量(48反应/盒)，如表8：
表8试剂盒的组成成分、包装及数量
实施例2：灵敏度检测及最低检出率实验
无模板对照样本为含内标基因的核酸来源于Caco2细胞株；灵敏度参考品1-3由不同浓度梯度的含有甲型流感病毒病毒样颗粒、乙型流感病毒样颗粒、2019新型冠状病毒ORF1ab基因、2019新型冠状病毒N基因及内标基因病毒样颗粒混合物的样本组成，各混合液浓度分别为1000copies/mL、500copies/mL、200copies/mL；阴性对照为DEPC水；
提取无模板对照、阴性对照、灵敏度参考品核酸，各取5μL，加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，每个样本每个体系做20个重复，使每管PCR反应液总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒。
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测甲型流感病毒；选择VIC通道检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因；选择TexasRed通道检测乙型流感病毒；
选择TAMRA通道检测2019新型冠状病毒N基因；选择CY5通道检测内标基因；选择参比荧光(Passive Reference)为None，设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
步骤五、结果读取及分析
反应结束后自动保存结果，根据扩增曲线划定合适的基线和阈值。基线(Baseline)的起始值(Start值)一般建议在3～15之间；基线的终止值(End值)一般建议在5～20之间；阈值(Threshold值)建议为各通道检测最高荧光值的1/20。基线和阈值设置完成后，点击分析(Reanalyse)自动获得各通道的Ct值，根据各通道Ct值进行结果判断。
用PCR系统对本发明的样本检测范围进行测定，实际测得的结果如表9所示，
表9最低检测限检测结果
本试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，表明引物与探针具有较好的特异性，灵敏度检测良好；检测200copies/mL参考品时，PCR系统可稳定检测为阳性，因此，本发明的可检出200copies/mL的样本。
实施例3：准确性测试
制备准确性参考品：将含有H1N1(2009)亚型、H1N1亚型、H3N2亚型、H5N1亚型、H7N9亚型甲型流感病毒培养物、Yamagata、Victoria亚型流感病毒培养物、2019新型冠状病毒ORF1ab基因病毒样颗粒、2019新型冠状病毒N基因病毒样颗粒及内标基因病毒样颗分别进行梯度稀释至浓度为5000copies/mL的准确性参考品P1-P10；
提取准确性参考品、阴性对照及阳性对照核酸；取5μL加样至步骤二所配制的PCR反应体系的八连管中，各3次重复，使得PCR反应液的总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测甲型流感病毒；选择VIC通道检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因；选择TexasRed通道检测乙型流感病毒；
选择TAMRA通道检测2019新型冠状病毒N基因；选择CY5通道检测内标基因；选择参比荧光(Passive Reference)为None，设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
步骤五、结果读取及分析
反应结束后自动保存结果，根据扩增曲线划定合适的基线和阈值。基线(Baseline)的起始值(Start值)一般建议在3～15之间；基线的终止值(End值)一般建议在5～20之间；阈值(Threshold值)建议为各通道检测最高荧光值的1/20。基线和阈值设置完成后，点击分析(Reanalyse)自动获得各通道的Ct值，根据各通道Ct值进行结果判断。
用PCR系统对本发明的样本检测范围进行测定，实际测得的结果如表10所示，
表10准确性检测结果
根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，符合理论要求。
实施例4：临床应用实验
采集100例疑似流感或新型冠状病毒肺炎患者鼻咽拭子样本、阴性对照及阳性对照，将拭子头浸入含采样液管中，做好样本标记并确保标签信息无误，4℃保存。使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒(磁珠法)粤穗械备20170583号和粤穗械备20150302号；也可使用其他的商业化产品；按照试剂盒说明书进行核酸提取；模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
取核酸各5μL，加样至步骤二配制的PCR反应体系的八连管中，使每管PCR反应液的总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒；
将PCR反应管放入仪器样品槽内，并记录放置顺序。选择FAM通道检测甲型流感病毒；选择VIC通道检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因；选择TexasRed通道检测乙型流感病毒；
选择TAMRA通道检测2019新型冠状病毒N基因；选择CY5通道检测内标基因；选择参比荧光(Passive Reference)为None，设置循环条件如下表，反应体系体积设置为25μL；设置完成后，保存文件，运行程序。
步骤五、结果读取及分析
反应结束后自动保存结果，根据扩增曲线划定合适的基线和阈值。基线(Baseline)的起始值(Start值)一般建议在3～15之间；基线的终止值(End值)一般建议在5～20之间；阈值(Threshold值)建议为各通道检测最高荧光值的1/20。基线和阈值设置完成后，点击分析(Reanalyse)自动获得各通道的Ct值，根据各通道Ct值进行结果判断。
用PCR系统对本发明的样本检测范围进行测定，实际测得的结果如表11所示，
表11临床样本检测结果
检测结果显示，100例样本中，7例样本呈为2019-nCoV阳性，5例为甲型流感病毒阳性，5例为乙型流感病毒阳性，其余样本为阴性，所检结果与相应的病原体单重荧光PCR结果一致性为100％。
对比例1
本发明人在研究过程中，针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒2019-nCoV目标核酸序列筛选了数十组PCR引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。
例如，针对新型冠状病毒2019-nCoV ORF1ab基因，本发明人设计的部分典型引物序列如下：
对照引物对1：
上游引物：5'CGGGTGTTGCTATGCCTAATCT 3'(SEQ ID NO.16)
下游引物：5'TTGCGACATTCATCATTATGCC 3'(SEQ ID NO.17)
对照引物对2：
上游引物：5'CCCAAAATTACAATCTAGTCAAGCGT 3'(SEQ ID NO.18)
下游引物：5'TGACACAGTTGAGTATATTTTGCGAC 3'(SEQ ID NO.19)
对照引物对3：
上游引物：5'GGCCATGTAGAAACATTTTACCCAAA 3'(SEQ ID NO.20)
下游引物：5'TTGAGTATATTTTGCGACATTCATCA 3'(SEQ ID NO.21)
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行荧光PCR检测测试。
使用对照引物对1的检测结果如图7所示，检测结果表明该引物对特异性较差。使用对照引物对2的检测结果表明该引物对在单一检测体系中对ORF1ab基因靶核酸的特异性和灵敏度较佳，但是在多重检测体系中ORF1ab基因靶低浓度核酸扩增受到明显抑制，单重和多重体系检测结果如图8所示。表明对照引物对2无法应用于多重检测体系中。使用对照引物对3的检测结果表明该引物对在单一检测体系和多重检测体系中对ORF1ab基因靶核酸的特异性和灵敏度均较佳，灵敏度能够达到200copies/mL，检测结果如图9所示。
目前，实时荧光PCR检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸阳性是新型冠状病毒肺炎诊断的金标准。但是，临床上发现现有试剂盒核酸检测的准确性和可重复性仍有待提高，临床上经常报道经过多次核酸检测才检测出阳性的病例。
在确保特异性和灵敏度的情况下，本发明人筛选出了8组多重核酸检测体系。使用7例新冠病毒阳性的鼻咽拭子样本核酸进行测试，具体方法参考实施例4，结果表明有6组多重核酸检测体系的临床样本检测准确率低于90％(低于6/7)，其中只有使用对照引物对3的多重核酸检测体系和本发明的多重核酸检测体系临床样本检测准确率达到了100％。使用这两个多重核酸检测体系，对临床样本进行10次重复检测，结果表明包含对照引物对3的多重核酸检测体系有2次没有检出ORF1ab靶基因、1次没有检出N靶基因，而本发明的多重核酸检测体系10次全部检出目标基因，说明本发明的多重核酸检测体系抗干扰能力更强，具有极佳的临床可靠性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒
<130> 000074
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<212> DNA
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caaagaatgc tattagaaaa gtgtg 25
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<212> DNA
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cgacattcat cattatgcct t 21
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<212> DNA
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<400> 21
ttgagtatat tttgcgacat tcatca 26
Claims (7)
1.一种多重检测呼吸道病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针集；
其中，所述引物对集由第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、第四引物对组、和第五引物对组组成，其中：
所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.5所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.6所示的反向引物；
所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
所述第三引物对组包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
所述第四引物对组包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物；
所述第五引物对组包括如SEQ ID NO.9所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.10所示的反向引物；
所述探针集由检测探针SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、和SEQ ID NO.15组成。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针，其中所述引物为多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的引物；所述探针为分别具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、和SEQ ID NO：14、SEQID NO.15所示的多核苷酸序列的探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含热启动Taq酶、逆转录酶、和dNTPS。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。
6.一种非诊断目的的检测呼吸道病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备PCR反应体系并进行荧光定量PCR检测：
其中，所述PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本和引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含多种引物和多种探针，其中所述引物为多核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、和SEQ ID NO：10所示的引物；所述探针为分别具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：15所示的多核苷酸序列的探针。
7.引物对集、和探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测呼吸道病毒核酸；
其中，所述引物对集由第一引物对组、第二引物对组、第三引物对组、第四引物对组、和第五引物对组组成，其中：
所述第一引物对组包括如SEQ ID NO.5所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.6所示的反向引物；
所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
所述第三引物对组包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
所述第四引物对组包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物；
所述第五引物对组包括如SEQ ID NO.9所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.10所示的反向引物；
所述探针集由检测探针SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、和SEQ ID NO.15组成。
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