TW202144587A

TW202144587A - 用以檢測或鑑別嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）之引子組、方法及套組

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Publication number: TW202144587A
Application number: TW110119300A
Authority: TW
Inventors: 陳彥旭; 余靈珊; 王文宏
Original assignee: 高雄醫學大學
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2021-12-01

Abstract

本發明涉及一種用以檢測或鑑別嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之引子組、方法及套組。該引子組包括一第一組合、一第二組合和一第三組合的至少其中之一，其中該第一組合包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列，該第二組合包含SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列，以及該第三組合包含SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14所示之核苷酸序列。

Description

用以檢測或鑑別嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之引子組、方法及套組

本發明關於一種用於檢測或鑑別嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之引子組、方法及套組，特別是關於在等溫條件下檢測或鑑別SARS-CoV-2特異性區域之引子組、方法及套組。

針對最近在世界各地造成大流行疫情的新型冠狀病毒，國際病毒學分類學會將此病毒正式命名為嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2；簡稱SARS-CoV-2)，世界衛生組織(World Health Organization,WHO)同時將此病毒引起之疾病正式命名為2019年冠狀病毒疾病(Coronavirus Disease 2019；簡稱COVID-19)。

冠狀病毒(CoV)為屬於冠狀病毒科(Coronavirinae)的一群具有外套膜(envelope)之單股正鏈RNA病毒，分為α、β、γ與δ四個屬，在電子顯微鏡下可看到類似皇冠的突起因此得名。目前已知有7種會感染人類的冠狀病毒，其中包含會造成嚴重急性呼吸道症候群(SARS)的SARS-CoV(屬於β-CoV)、會造成中東呼吸症候群冠狀病毒感染症(MERS)的MERS-CoV(屬於β-CoV)以及造成前述COVID-19的SARS-CoV-2(屬於β-CoV)。

WHO宣布COVID-19疫情已構成全球大流行，且推算全球約10%的人口可能已感染此病毒。為了避免COVID-19的快速傳播造成疫情更加嚴峻，早期檢測出SARS-CoV-2病毒以早期診斷COVID-19對於控制疾病進展和限制人群中的病毒傳播至關重要。因此，目前急需有快速準確的SARS-CoV-2早期檢測方法。

SARS-CoV2的實驗室檢測可分為三部份，分別為病毒核酸檢測、病毒分離培養及病毒抗體檢測。因目前病毒培養實屬不易，需在BSL-3生物安全等級實驗室操作，故目前實驗室檢測以即時反轉錄聚合酶連鎖反應(Real-time RT-PCR)核酸檢測為主。但是，這樣的方法需要特定的昂貴實驗室設備和訓練有素的分析人員，且需要4-8小時以上的時間才能得到檢測結果。因此，此種檢測方式不但不適合用於未具備專業檢驗室的醫療院所以及流行地區現場診斷，且這種檢測方式對於短時間檢測大量樣品的需求十分不利。

因此，需要一種用於快速、可靠地檢測或鑑別SARS-CoV-2的即時、簡單、低成本且精確的工具和方法，以早期診斷出可疑案例中的COVID-19感染確診患者，進而可妥善處置罹患COVID-19的病患，而避免病毒進一步傳播。

本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨的精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案的簡要說明。

為了解決前述問題而期望發展出用於檢測與鑑別SARS-CoV-2之簡易快速且具有高靈敏度的引子組、方法及套組。此引子組、方法及套組不受地域及設備限制而可以在現場或臨床中應用，由於可快速且準確地做出COVID-19確診與否的診斷，進而可減輕防疫人力壓力、提升流行地區之醫療照護且對COVID-19的防疫決策有很大的幫助。

本案之目的之一為提供一種用以檢測或鑑別一生物樣品中之SARS-CoV-2之引子組，包括一第一組合、一第二組合和一第三組合的至少其中之一，其中該第一組合包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列，該第二組合包含SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列，以及該第三組合包含SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，該第一組合還包含SEQ ID NO：5所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，該第二組合還包含SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列。在某些具體實施例中，該第三組合還包含SEQ ID NO：15所示之核苷酸序列。

前述第一組合的引子亦可為與SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列具有約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高百分比之同源性的序列。前述第二組合的引子亦可為與SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列具有約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高百分比之同源性的序列。前述第三組合的引子亦可為與SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14所示之核苷酸序列具有約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高百分比之同源性的序列。

本案的另一目的為提供一種檢測或鑑別生物樣品中之SARS-CoV-2的方法。該方法包括以下步驟：從該生物樣品萃取核酸；將該核酸加入反應混合物中進行核酸擴增反應，其中該反應混合物中包括前述的引子組；以及檢測該核酸擴增反應是否產生擴增產物。

本案之再一目的為提供一種用於檢測或鑑別SARS-CoV-2的套組。該套組中至少包含前述引子組、用於擴增SARS-CoV-2的至少一目標核酸所需的試劑、以及用於檢測是否產生擴增產物所需的試劑。

S101~S103:步驟

本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。

圖1示出根據本發明用於檢測或鑑別生物樣品中之SARS-CoV-2的方法的流程圖。

圖2A示出根據本發明實施例以端點螢光比色偵測套組來檢測和鑑別SARS-CoV2的結果。反應液為紅色表示陰性，反應液為黃色表示陽性。

圖2B示出根據本發明實施例以螢光即時定量比色偵測套組來檢測SARS-CoV2的結果。反應液為紅色表示陰性，反應液為黃色表示陽性。

本案所提出的發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得所屬技術領域中具有通常知識者可以據以完成，然而本案的實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，所屬技術領域中具有通常知識者仍可依據除既揭露的實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明的範圍。

除非在特定範例中另外限制或說明，下列定義適用於整份說明書中所使用的用語。

本文所使用之用語「包含」或「包括」意謂著除了所描述的組成、步驟、及/或元素以外，不排除存在一或多個其他組成、步驟、及/或元素。

本文所使用之用語「大約或約」意指具有接近或可允許的誤差範圍，用於避免本發明局限於所揭示之準確或絕對的數值。本文所使用之用語「一」意指該冠詞之語法對象為一或一個以上(例如：至少一者)。

本文所使用之用語「核酸」、「核酸序列」、「基因序列」與「核苷酸序列」等術語意指藉由磷酸二酯鍵聯(phosphodiester linkages)而被連結之核苷酸的序列，並且可以是呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸(DNA)分子或核糖核苷酸(RNA)分子。該核酸可為天然存在或合成的核苷酸及其已知的類似物、或在醣及/或磷酸部分上被修飾的核苷酸。換言之，上述用語亦涵蓋含有經修飾殘基的核酸，且該等核酸可為合成的或天然存在的。

本文所使用的用語「生物樣品」是指自生物體分離之各種檢體，特別是組織、細胞或液體之樣品，其包括(但不限於)例如血液、血漿、血清、血球、糞便、尿液、淋巴液、皮膚、上呼吸道檢體、下呼吸道檢體(例如痰液)、眼淚、唾液、乳汁等。針對COVID-19的診斷，前述生物樣品較佳為鼻咽拭子(Nasopharyngeal swab)、口咽拭子(oropharyngeal swab)(例如喉頭拭子)、中鼻甲拭子(Nasal Mid-Turbinate(NMT)swab)、鼻腔拭子(Nasal Swab)、鼻咽沖洗液(Nasopharyngeal washes)、鼻咽抽取液(Nasopharyngeal aspirates)、鼻腔抽取液(Nasal aspirates)、支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage)或下呼吸道抽取液(Lower respiratory tract aspirates)、糞便、痰液、血液或尿液。前述生物樣品依據陽性檢出率依序更佳為支氣管肺泡灌洗液、痰液、鼻腔拭子、支氣管鏡刷洗切片、咽拭子、糞便、血液及尿液。因此，根據是否有症狀以及不同病程選用不同部位的生物樣品可提高檢出靈敏度，也可避免出現偽陰性之結果。在本發明中，生物樣品首選為支氣管肺泡灌洗液或痰液，次選為鼻腔拭子或咽拭子。

本文所使用的用語「引子」意指限定序列的寡核苷酸，其是被設計以擴增SARS-CoV-2的目標基因的全部或部分片段。一或多個引子被設計為與部分的目標序列(及/或該目標序列的互補序列)大致上或完全互補，以與該部分的目標序列(及/或該目標序列的互補序列)雜交並進行目標序列(及/或該目標序列的互補序列)的擴增反應。引子的長度應足以防止其自身黏合或黏合至目標序列以外的序列區域。通常引子的長度是介於10至50個核苷酸之間。

本文所使用的用語「擴增反應」意指利用引子使一目標序列(及/或該目標序列的互補序列)的複本數目增加。擴增反應後若目標序列的複本數目增加，則此產物被稱為「擴增產物」，擴增產物至少包含目標序列及/或該目標序列的互補序列。擴增反應可以使用本領域已知的任何方法來進行，例如等溫擴增反應或基於聚合酶鏈反應(PCR)的任何方法。前述基於PCR方法包括但不限於：PCR、定量PCR(qPCR)、反轉錄PCR(RT-PCR)、定量RT-PCR(RT-qPCR)、巢式PCR、熱啟動PCR(hot-start PCR)、多重PCR、連接酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR)、缺口連接酶鏈反應(Gap ligase chain reaction，gLCR)等。前述等溫擴增反應是在大約相同的單一溫度下被執行，因此不需要常規PCR的熱循環設備。在某些具體實施例中，等溫擴增反應較佳為環媒介等溫擴增反應(LAMP)。

本文所使用的用語「目標序列」意指欲被擴增的目標基因序列(即目標核酸序列)。目標序列可為單股或雙股的DNA、RNA或cDNA。

請參考圖1，其示出根據本發明用於檢測或鑑別生物樣品中之SARS-CoV-2的方法的流程圖，前述方法至少包括以下步驟。首先，從生物樣品萃取核酸(S101)。如前文前述，該生物樣品可為自生物體分離之各種檢體。萃取核酸的方法可為本領域技術人員熟知的各種方法。選擇性地，在萃取核酸之前可包含前處理步驟，例如以各種本領域熟知的方法使生物樣品中的病毒外鞘蛋白變性以降低或消滅其感染性。例如，前處理步驟可為以65度加熱生物樣品以使病毒失活。由於SARS-CoV-2為RNA病毒，故步驟S101是例如以商業化RNA萃取套組從生物樣品萃取RNA，其較佳為總RNA。

接者，將核酸加入反應混合物中進行核酸擴增反應，其中該反應混合物中包括特定引子組(S102)，其後檢測該核酸擴增反應是否產生擴增產物(S103)。前述特定引子組包括第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之一。該第一組合包含4個引子，分別為SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列。該第二組合包含4個引子，分別為SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列。該第三組合包含4個引子，分別為SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14所示之核苷酸序列。現有的引子設計軟體無法直接根據目前SARS-CoV-2的全基因組確認最理想的引子組，經發明人反覆嘗試錯誤及實驗，最終在合成引子之多種組合中找到既具有高靈敏度又具有高特異性之特別有用之引子組。本發明的引子是針對SARS-CoV-2特定基因(S基因、N基因和ORF1a，其中S基因和N基因對相關病毒無交叉反應)所設計的引子，因此不但可檢測SARS-CoV-2存在與否，還可鑑別出SARS-CoV-2。

步驟S102中，該核酸擴增反應可藉由使用下列方法之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應(PCR)、定量聚合酶鏈反應(qPCR)、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、反轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)、巢式聚合酶鏈反應、熱啟動聚合酶鏈反應、多重聚合酶鏈反應、原位PCR、單細胞PCR、遞減PCR、連接酶鏈反應(LCR)、缺口連接酶鏈反應(gLCR)以及等溫擴增反應。為了檢測RNA病毒，可在核酸擴增反應之前先進行將RNA反轉錄為cDNA的步驟，亦可於核酸擴增反應的試劑中直接添加反轉錄酶來免除前述額外步驟。

在某些具體實施例中，該核酸擴增反應可為等溫擴增反應。該等溫擴增反應可為例如環媒介等溫擴增反應(loop-mediated amplification，簡稱LAMP)，其是一種能夠在恆溫條件下(例如50-75℃，更佳為55至65℃)快速擴增核酸的方法，且可以本領域熟知的步驟和條件進行。相較於常規PCR或常規RT-PCR動輒需要數小時的檢測時間，LAMP只需要短至大約30分鐘的時間即能完成檢測。相較於其他等溫擴增反應(例如RPA)，LAMP為更具特異性的方法。

一般而言，LAMP的反應混合物中主要包括模板核酸(RNA或DNA)、4至6個引子、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶(催化具有鏈置換活性的互補鏈的合成)以及反應緩衝液。LAMP的反應混合物中若包含4個引子，則為一對外部引子(包括正向外部引子F3和反向外部引子B3)以及一對內部引子(包括正向內部引子FIP和反向內部引子BIP)。正向內部引子FIP包含F1c和F2序列，反向內部引子BIP包含B1c和B2序列。通常，上述四個引子即足以擴增目標基因的目標序列。內部引子FIP和BIP對於檢測特異性起關鍵作用，這是因為FIP/BIP的F2/B2引子黏合至目標中的F2c/B2c區域以啟動LAMP反應。外部引子F3/B3由較少的鹼基組成，並且通常引子濃度低於內部引子FIP/BIP，從而引發F3/B3黏合至目標而開始鏈置換。為了增強反應的特異性和效力，可在LAMP的反應混合物中加入1或2個額外的環引子，即正向環引子LF和反向環引子LB。環引子的序列互補於F2/B2和F1/B1之間的序列區域。

在某些具體實施例中，在LAMP過程中使用表一所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之一。在某些具體實施例中，在LAMP過程中結合使用表一所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之二。相較於只使用一組引子組合，結合使用兩組或三組的引子組合具有更高的特異性(專一性)，由此可得出更嚴謹且準確度更高的檢測結果。

在某些具體實施例中，在LAMP過程中使用表二所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之一。在某些具體實施例中，在LAMP過程中使用表二所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之二。鑒於COVID-19、SARS和MERS中S和N基因的高度相似，本發明的引子被設計為覆蓋較少的共通區域，並且在使用環引子的具體實施例中僅應用反向環引子，以避免非特異性擴增。

在某些具體實施例中，可使用本領域熟知的技術將可偵測標記結合至前述引子組中的至少一引子上，以定量所檢測的目標核酸。可偵測標記可為例如半抗原標記(例如生物素)、化學螢光標記(例如硫酯)、螢光標記(例如螢光素、孔雀綠等)、放射性標記、酵素標記等。

為了檢測RNA病毒，在進行目標序列的LAMP反應之前需要先將RNA反轉錄為cDNA，此方法稱為反轉錄LAMP(RT-LAMP)。反轉錄可使用本領域中所熟知的任何合適的反轉錄酶來進行，例如禽骨髓母細胞增多性病毒(Avian Myeloblastosis Virus，AMV)反轉錄酶。反轉錄可在LAMP之前單獨進行；或者，可直接在LAMP的反應混合物中添加反轉錄酶，由此反轉錄與DNA擴增反應可在包含DNA聚合酶以及反轉錄酶的同一反應混合物中被執行。

可被用來執行本發明揭示之方法的聚合酶的非限制性實例包括可在等溫條件下(例如50-75℃，更佳為55至65℃)被使用的具高DNA鍊置換能力的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶或Bst 2.0 DNA聚合酶。在某些具體實施例中，LAMP的反應混合物中包括大約1至20U(例如大約1至15U、大約2至12U、大約10至20U、大約2至10U，或大約5至10U)的前述DNA聚合酶。

在某些具體實施例中，LAMP的反應混合物中的反應緩衝液為例如磷酸緩衝液或Tris緩衝液。該緩衝液亦可包括額外的鹽類成分、TWEEN^®-20或其它添加物(例如甜菜鹼)。熟悉此技藝者可以使用常規方法來選擇適當的緩衝液與任何的添加物。在一非限制性實例中，該緩衝液(pH 8.8)包含50mM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、0.1% TWEEN^®-20、4mM MgSO₄以及0.8M甜菜鹼。

在檢測RNA病毒(SARS-CoV-2)的情況下，最初，LAMP引子與互補的目標cDNA序列結合，並產生啞鈴狀DNA。然後，在循環擴增步驟中，連續產生這種啞鈴狀DNA的數個拷貝。在循環擴增步驟中形成的產物用於延伸階段，以產生各種大小的擴增DNA。前述過程中製造出的多重產物，部分再繼續回復循環於整個LAMP過程中，如此持續循環作用，加速目標DNA(即擴增產物)不斷增殖，而利於檢測應用。LAMP可以在恆溫下於一個小時之內迅速擴增並產生大量DNA拷貝，通常比常規PCR高100倍，因此針對步驟S102中的核酸擴增反應，LAMP為可以在現場或臨床中應用的快速、靈敏且經濟的較佳檢測方式。

為了檢測該核酸擴增反應是否產生擴增產物(S103)，可以使用本領域中所熟知之可用於此目的之各種不同的方法中的至少一者。例如，該檢測方法可以是混濁性測量、螢光偵測、生物冷光偵測、凝膠電泳、比色偵測、免疫酵素偵測、電化學偵測等。該檢測可以是半定量的或定量的。該檢測亦可以是即時(real-time)檢測，其在該核酸擴增反應的期間，對由該擴增產物之存在所產生的訊號進行測量以監測特異性擴增產物的累積。上述檢測方法可利用本領域中所熟知之步驟和條件進行。在某些具體實施例中，當該核酸擴增反應為LAMP時，由於產生大量的焦磷酸鎂的白色沉澱物，故可以使用混濁性測量，其可以藉由簡單的目視檢查濁度或以濁度計檢測。在某些具體實施例中，以螢光偵測方法來檢測該核酸擴增反應是否產生擴增產物，其可以使用諸如DNA嵌入染料、螢光分子信標探針或螢光金屬指示劑來達成此目的，例如溴化乙錠(EtBr)、SYBR Green、Syto 9等。在陽性樣品中，由於較高的DNA聚合酶活性，LAMP反應混合物的pH傾向於降低。因此，在某些具體實施例中，尤其在資源受限環境中，可藉由使用例如酚紅作為pH指示劑(在低pH值下從紅色變為黃色)而以比色偵測法檢測是否產生擴增產物。

本發明亦提供一種用於檢測或鑑別SARS-CoV-2的套組。在某些具體實施例中，該套組包含如前文所述的反應混合物，較佳是該反應混合物中包含表一或表二所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之一，更佳是該反應混合物中包含表一或表二所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之二。根據欲用於檢測核酸擴增反應是否產生擴增產物的方式，該套組中可包含相應的試劑，例如用於監測該DNA擴增產物的核酸染料(例如EtBr、SYBR GREEN等)、針對鹼性金屬離子的呈色指示劑、pH指示劑(例如酚紅)等。

在某些具體實施例中，可使用本發明的引子組替換商業核酸擴增套組(例如LAMP套組)中的引子混合物來檢測和鑑別SARS-CoV-2。在某些具體實施例中，使用本發明的引子組來替換WarmStart^®比色LAMP偵測套組(英國New England Biolabs公司)中的引子混合物，經此替換後，可在30分鐘內目視檢測SARS-CoV-2核酸的擴增(由於pH值降低會產生顏色變化，粉紅色/紅色表示陰性，黃色表示陽性)。

在某些具體實施例中，可將本發明的引子組應用於離子感測場效應電晶體生物傳感器。

實施例1

首先，取得5個COVID-19確診病例(實例1~5)及5個(未確診)對照例(對照例1~5)的生物樣品(咽喉拭子、鼻咽拭子或痰液)，並分別以商業化RNA萃取套組萃取上述生物樣品的總RNA。

將前述RNA萃取液加入含有前述表二中第三組合的引子組的RT-LAMP反應混合物中。25μl反應混合物中包括0.8μl之25μM FIP引子、0.8μl之25μM BIP引子、0.2μl之25μM F3引子、0.2μl之25μM B3引子、0.4μl之25μM LB引子、2.5μl之緩衝液(其內含有50mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、0.1% TWEEN^®-20，pH=8.8)、2μl之10mM之dNTP、4μl之50mM MgSO₄、4μl之5M甜菜鹼、0.8μl之反轉錄酶、1μl之Bst DNA聚合酶(8U/μl)、RNA萃取液以及水。將上述反應混合物於大約64℃下進行RT-LAMP反應30分鐘。待反應完畢，檢測是否有擴增產物產生，結果如表三所示。表三另外列出同樣的生物樣品以衛生福利部疾病管制署公告的標準方法(使用標準方法中提供的引子進行即時定量反轉錄聚合酶連鎖反應(real-time RT-PCR)檢測Rdrp、E基因和N基因)檢測的結果。依照前述標準方法，判讀依據為三基因(Rdrp、E、N基因)的循環數閥值(Cycle threshold，簡稱Ct值)，若Ct值小於35則直接通報為陽性，若有疑義(如某幾個基因Ct值超過35，或數個基因Ct值皆於35附近)，則將原始數據與圖形通報疾管署，由署內人員進行判讀。較高的Ct值表示有較低的病毒RNA量，需要較高的循環數才能複製出可供檢出的拷貝量。由表三可知根據本發明方法的檢測結果與標準方法的檢測結果一致，且由Ct值可知本發明的方法具有較高的靈敏度。此外，由檢測結果的螢光訊號圖(未示出)可知實例1至實例5皆在允收標準內產生螢光訊號，且對照例1至對照組5皆無訊號產生，表示本發明的方法和產品在臨床端確實能夠正確判讀COVID-19確診病例。相較於標準方法，本發明的方法僅需要不到30分鐘的時間即可完成檢測，且具有較高的靈敏度，故而可降低偽陰性率，故在檢測或鑑別SARS-CoV2上仍十分有優勢。

在其他具體實施例中，將實施例1的引子替換為表一所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之一、或是表二所示出的引子組中的第一組合、第二組合和第三組合的至少其中之一，使用與實施例1相同的方法，可得到與上述表三類似的結果。特別是，當結合使用靶向不同基因的引子組時(例如同時使用表二所示出的引子組中的第一組合和第二組合)，可獲得更高的特異性，由此可大幅減少偽陽性率。

實施例2

為了瞭解本發明所提出引子組的偵測極限(Limit of Detection，LOD)，此實施例以SARS-CoV2 RNA混合陰性基質作為陽性模擬檢體(共計20個生物樣品)，使用前述表二中第三組合的引子組及螢光標定物質Syto 9，以QuantStudio® 3型即時螢光定量PCR系统進行檢測。在Ct小於20內有螢光訊號則視為檢測結果為陽性。採用本發明的引子組，在10拷貝數/反應的濃度下，20個生物樣品中有16個生物樣品在Ct20內有增幅，故陽性一致率為80%；濃度在20個拷貝數/反應以上的所有生物樣品在Ct20內都有增幅，表四示出20個生物樣品在不同濃度下的平均Ct和陽性一致率。由表四可知，濃度在20個拷貝數/反應以上的樣品可符合主管機關要求之95%以上的陽性一致率。因此，本發明可檢驗的LOD為20個拷貝數/反應。相較於現行的標準檢測方式，本發明提供的引子、套組和方法不但可縮減檢測時間，還具有較低的偵測極限(亦即較高的篩檢靈敏度，意味著在少量病毒RNA的情況下也可檢測出陽性反應)，故而可降低偽陰性率。

實施例3

為了確認本發明所提供引子組可用以在類似病毒間鑑別出SARS-CoV2，此實驗分別以合成的SARS、MERS和COVID-19的病毒RNA作為生物樣品核酸，製備數個不同RNA濃度 (10、10²、10⁴、10⁶、10⁸拷貝數/反應)的樣品，以這些樣品作為模板利用與實施例1相同的步驟取得LAMP擴增反應後的產物，並以WarmStart^®比色偵測套組(英國NEB公司)分別進行端點螢光比色偵測和螢光即時定量檢測來確認核酸擴增反應是否產生擴增產物，其結果分別如圖2A(端點螢光比色偵測)和圖2B(螢光即時定量檢測)所示。此偵測套組可在30分鐘內目視確認是否有擴增產物的存在。具體而言，若存在擴增產物，反應混合物的顏色會因pH變化而從紅色變成黃色，故反應液為紅色表示陰性，反應液為黃色表示陽性。由圖2A和2B可知，本發明的引子組具有高特異性，確實可用以在類似病毒間鑑別出SARS-CoV2，且其具有很高的檢測靈敏度。

本發明提供具有高特異性的引子組，當此引子組結合例如LAMP使用時，可以快速且高靈敏度的方式提供檢測結果；當此引子組結合LAMP及可目視判斷是否產生擴增產物的方法(例如混濁性測量或比色偵測法)使用時，可現場診斷COVID-19而無需專門的實驗室設備和訓練有素的專業人員來進行檢測。

本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

<110> 高雄醫學大學

<120> 用以檢測或鑑別嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之引子組、方法及套組

<150> US 63/031,146

<151> 2020-05-28

<160> 15

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒S基因的正向外部引子F3

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒S基因的反向外部引子B3

<400> 2

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒S基因的正向內部引子FIP

<400> 3

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒S基因的反向內部引子BIP

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒S基因的反向環引子LB

<400> 5

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒N基因的正向外部引子F3

<400> 6

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒N基因的反向外部引子B3

<400> 7

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒N基因的正向內部引子FIP

<400> 8

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒N基因的反向內部引子BIP

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒N基因的反向環引子LB

<400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒OFR1a基因的正向外部引子F3

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒OFR1a基因的反向外部引子B3

<400> 12

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒OFR1a基因的正向內部引子FIP

<400> 13

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒OFR1a基因的反向內部引子BIP

<400> 14

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於檢測SARS-CoV-2病毒OFR1a基因的反向環引子LB

<400> 15

S101~S103:步驟

Claims

一種用以檢測或鑑別一生物樣品中之嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)之引子組，包括一第一組合、一第二組合和一第三組合的至少其中之一，其中該第一組合包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示之核苷酸序列，該第二組合包含SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：9所示之核苷酸序列，以及該第三組合包含SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14所示之核苷酸序列。
如請求項1所述的引子組，其中該第一組合還包含SEQ ID NO：5所示之核苷酸序列，該第二組合還包含SEQ ID NO：10所示之核苷酸序列，以及該第三組合還包含SEQ ID NO：15所示之核苷酸序列。
一種檢測或鑑別一生物樣品中之嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的方法，包括以下步驟：

從該生物樣品萃取一核酸；

將該核酸加入一反應混合物中進行一核酸擴增反應，其中該反應混合物中包括如請求項1或2所述的引子組；以及

檢測該核酸擴增反應是否產生一擴增產物。
如請求項3所述的方法，其中該生物樣品是選自由下列所組成的群組：一血液樣品、一血清樣品、一上呼吸道檢體、一下呼吸道檢體、一糞便樣品及一尿液樣品，以及該核酸是總RNA。
如請求項3所述的方法，其中該核酸擴增反應是藉由使用下列方法之至少一者而被進行：聚合酶鏈反應(PCR)、定量聚合酶鏈反應(qPCR)、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、反轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)、巢式聚合酶鏈反應、熱啟動聚合酶鏈反應、多重聚合酶鏈反應、原位PCR、單細胞PCR、遞減PCR、連接酶鏈反應(LCR)、缺口連接酶鏈反應(gLCR)以及等溫擴增反應。
如請求項3所述的方法，其中該反應混合物還包含一反轉錄酶以及一DNA聚合酶。
如請求項3所述的方法，其中該核酸擴增反應是一環媒介等溫擴增反應(LAMP)。
如請求項3所述的方法，其中檢測是否產生該擴增產物是藉由使用下列方法之至少一者而被進行：一混濁性測量、一螢光偵測、一生物冷光偵測、一凝膠電泳、一比色偵測、一免疫酵素偵測以及一電化學偵測。
如請求項3所述的方法，其中該引子組中的至少一引子被標記一可偵測的標記。
一種用於檢測或鑑別嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)的套組，其包含如請求項1或2所述的引子組，以用於擴增該SARS-CoV-2的至少一目標核酸。