CN116064954A - 一种基于mb-rt-pcr检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于mb-rt-pcr检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒检测试剂盒的技术领域，具体涉及一种基于MB‑RT‑PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括针对N基因的第一引物对和第一分子信标探针，针对N501Y基因的第二引物对和第二分子信标探针，针对E484K基因的第三引物对和第三分子信标探针，针对K417N基因的第四引物对和第四分子信标探针；相比传统技术，克服了传统试剂盒敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同时对现有的检测试剂盒技术进行改进，使得所制备的试剂盒能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性；检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。

Description

一种基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病毒检测试剂盒的技术领域，具体涉及一种基于 MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)主要通过呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感；该病毒感染具有潜伏期(1-14天)，感染潜伏期的病人一般无症状，但已经具备很强的传染性。相比新冠病毒原始株，奥密克戎变异株表面的刺突蛋白(spike protein，又称S蛋白)发生了30多种变化，S蛋白通过识别并结合宿主细胞上的受体入侵细胞，S蛋白也是免疫反应中被抗体攻击的主要目标。其中N501Y，E484K，以及K417N 突变在奥密克戎株上为多发突变，可以作为判断的标志。针对新冠病毒检测阳性的病例，确认是否属于新冠病毒奥密克戎突变株，对于病毒监测具有重要意义。目前，新型冠状病毒实验室检测最主要的方法是实时荧光RT-PCR方法，主要针对新型冠状病毒基因组中开放阅读框1ab(ORF1ab)和核壳蛋白区(N)区保守基因，来判断待检标本是否含有新冠病毒基因。但是，这种real-time RT-PCR试剂盒只可判断待检标本是否为新冠病毒感染，而不能对病毒型别进行分型检测，进而判断是否为奥密克戎突变株。目前对新型冠状病毒的型别鉴定，主要通过对病毒进行全基因组测序和分析来完成。但全基因组测序要求具备基因测序仪等相关设备，加上对人员要求高，不能满足基层工作需要。
多重PCR是在一个反应体系里加入多对特异性引物，针对多个模板或同个模板的不同区域扩增出多个目的片段的PCR技术。一个理想的多重PCR体系，并非是单一PCR的简单混合，而是需要选择各个高度特异性的目的片段和不互相影响各引物对，能够利用同样的扩增条件和试剂达到同时扩增出目的片段的PCR技术，引物对的序列选择、目的片段的选择、PCR扩增条件和试剂的调试优化都是多重PCR技术的难点。
分子信标(molecular beacon，MB)是1996年Tyagi等发明的一种有茎环结构的荧光探针。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光。在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，还可以进行实时检测。综上所述，基于碱基互补配对原则来识别特定核酸序列是特异性检测的一种有效方法，急需开发出利用分子信标探针在不同温度下发出荧光强度的差异对PCR扩增产物进行检测方法，进而进行分型的方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒及其应用，相比传统技术，克服了传统试剂盒敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，所述试剂盒包括针对N基因的第一引物对和第一分子信标探针，针对N501Y基因的第二引物对和第二分子信标探针，针对 E484K基因的第三引物对和第三分子信标探针，针对K417N基因的第四引物对和第四分子信标探针；
所述第一引物对的核酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述第一分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.3；
所述第二引物对的核酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，所述第二分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.6；
所述第三引物对的核酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，所述第三分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.9；
所述第四引物对的核酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，所述第四分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.12；
所述第一分子信标探针、第一分子信标探针、第一分子信标探针、第一分子信标探针的5’端连接有荧光发光基团，且3’端连接有荧光猝灭基团；
所述荧光发光基团包括FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、 Lluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green514、Texas Red、 TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、ROX的一种以上；
所述荧光猝灭基团包括DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、 BHQ-2、BHQ-3的一种以上；
所述试剂盒还包括高保真性Taq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、逆转录酶、PCR增强剂以及MB-RT-PCR Buffer，优选为尿嘧啶-N- 糖基化酶，其能够大大降低试剂被环境污染的风险，操作非常安全，结果可信度也大大增加；
所述高保真性Taq聚合酶能够保证扩增产物的碱基错配率在测序允许的标准范围内；
所述尿嘧啶-N-糖基化酶能在25℃下将前期不小心引入的扩增产物中尿嘧啶切断，使其不能成为扩增模板，尿嘧啶-N-糖基化酶在95℃下失活，不影响接下来人DNA作为模板的扩增，从而有效预防由PCR 产物的污染导致的假阳性结果；
所述试剂盒还包括MB-RT-PCR反应液和酶混合物；
所述酶混合物包括Taq DNA聚合酶、高热稳定性的M-MLV逆转录酶和RNA酶抑制剂；
所述MB-RT-qPCR反应液包括RT-PCR缓冲液、PCR增强剂、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；
所述PCR缓冲液包括Tris-HCl(pH8.0)、硫酸铵、氯化钾和Triton X-100；
所述PCR增强剂选自四甲基氯化铵、肉碱、海藻糖和非离子去污剂NP-40中的至少一种。
本发明还提供了一种基于上述试剂盒鉴别新型冠状病毒型号的方法，包括如下步骤：
1)采集鼻咽拭子或口腔拭子样本；
2)提取待测核酸，可采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集RNA溶液，直接进行检测或保存于 -20℃。并提取病毒核酸RNA；
3)将所述样本DNA与上述试剂盒中的试剂体系进行混合(包括：MB-RT-qPCR反应液、PCR增强剂、酶混合物、引物对组、分子探针组)，进行多重荧光定量PCR扩增；
所述MB-RT-qPCR扩增程序如下：50℃，30min；95℃，3min； (95℃，5s；60℃，20s)×45个循环；
4)根据荧光信号和ct值，判断所述样本是否有新冠病毒以及是否存在奥密克戎变异株。
本发明还提供了上述试剂盒在检测新型冠状病毒及其分型方面的应用，其分型包括奥密克戎分型。
本发明的有益效果如下：
本发明的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，实现一管内进行新型冠状病毒检测及奥密克戎分型，所述试剂盒中SEQ ID NO：3探针检测包括新冠病毒N基因，SEQ ID NO：5探针检测奥密克戎N501Y突变，SEQ ID NO：7探针检测奥密克戎E484K 突变，以及SEQ ID NO：9探针检测奥密克戎K417N突变，经PCR 扩增后，可通过报告荧光信号和ct值来判断所述样本是否有新冠病毒以及是否存在奥密克戎变异株；
本发明的基于以上试剂盒的检测方法，通过用多重PCR技术，利用试剂盒中设计的互不影响的多组引物和多组分子信标探针，经过多次调试序列和引物探针浓度比例，优化PCR扩增条件，克服了各个困难，最终成功研发了只需一管试剂便能同时检测奥密克戎不同突变的方法，大大增加了检测的通量和节约了成本；
本发明相比传统技术，克服了传统试剂盒敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同时对现有的检测试剂盒技术进行改进，使得所制备的试剂盒能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性；检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。
附图说明
图1为分子信标探针示意图；
图2为本发明试剂盒对奥密克戎新冠变异株的在N基因及3个特征变异位的检测准确性结果：
图3为本发明试剂盒对奥密克戎新冠变异株的在N基因的假病毒模拟样本的灵敏度检测结果；
图4为本发明试剂盒对奥密克戎新冠变异株的在N501Y基因的假病毒模拟样本的灵敏度检测结果；
图5为本发明试剂盒对奥密克戎新冠变异株的在E484K基因的假病毒模拟样本的灵敏度检测结果；
图6为本发明试剂盒对奥密克戎新冠变异株的在K417N基因的假病毒模拟样本的灵敏度检测结果；
图7为本发明试剂盒对不同病毒检测的特异性结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒
MB-RT-PCR Buffer(MgCl2、dNTP、(NH4)2SO4、Tri-HCl、dNTP、 PCR增强剂、PCR级别纯净水以及N基因的上下游引物探针，N501Y 位点的上下游引物探针，E484K位点的上下游引物探针，K417N位点的上下游引物探针及2μL的酶混合液(热启动Taq酶(5U/μL)、逆转录酶(10U/μL)、尿嘧啶-N-糖基化酶(0.01U/μL)、RNA酶抑制剂(2U/μL)，阳性对照品；阴性对照。
实施例2
检测方法
1.标本类型：口咽拭子、鼻咽拭子；
2.核酸提取
采用商品化RNA提取试剂盒，如基于硅胶膜离心柱法的核酸提取试剂或基于磁珠法核酸提取的试剂或核酸释放剂，并按试剂盒说明书进行操作，最后收集到80μL核酸溶液，直接进行检测；或保存于 -80℃，阴性质控品、阳性质控品均需进行提取；
3.体系配置
根据检测所需总反应数N，每管PCR加入13μL RT-PCR扩增液 (MgCl2、dNTP，(NH4)2SO4，Tri-HCl、dNTP、PCR级别纯净水以及引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11以及探针SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12，以及2μL 的酶混合液(热启动Taq酶、逆转录酶、尿嘧啶-N-糖基化酶)。计算所需的总量，混匀后再分装到特制的PCR反应管中；
如图1所示为分子信标探针的构建示意图；
4.加样
向已分装有试剂的PCR反应管中分别加入阴性质控品，样本 RNA溶液，阳性质控品，加样量均为5μL，盖紧管盖，混匀，离心收集溶液置管底；
5.上机扩增检测
MB-RT-PCR扩增程序分析程序的设定如表1所示：
表1
Figure BDA0003875813770000091
6.结果分析
对新型冠状病毒及奥密克戎分型进行检测，结果表2、表3、表 4、表5所示：
表2
Figure BDA0003875813770000092
表3
Figure BDA0003875813770000093
Figure BDA0003875813770000101
表4
Figure BDA0003875813770000102
表5
Figure BDA0003875813770000103
试验例1
本发明试剂盒的检测结果准确性：
采用实施例1所述的试剂盒，按照实施例2的方法对奥密克戎的假病毒进行检测，实验结果如图2所示，结果表明，各通道均能正常进行检测，该MB-RT-PCR体系能够检测对应靶标的情况，并对新冠变异株进行分型，以鉴定奥密克戎变异株：N(+)，N501Y(+)， E484K(-)，K417N(-)。
试验例2
本发明试剂盒的检测灵敏度：
用病毒保存液阴性样本稀释新冠质控品浓度至500copies/mL，以验证本发明实施例1和实施例2所述检测方法的灵敏度。检测结果图3、图4、图5、图6所示，奥密克戎新冠变异株的在N基因及3 个特征变异位点在500copies/mL的假病毒模拟样本均能准确检出，表明该检测方法具较高的灵敏度。
试验例3
本发明试剂盒的检测特异性：
将副流感1型病毒核糖核酸(PIV 1RNA)、呼吸道合胞病毒A型核糖核酸、呼吸道合胞病毒B型核糖核酸、腺病毒脱氧核糖核酸(ADV DNA)、登革热病毒I型核糖核酸、人冠状病毒HCoV-OC43核糖核酸、人冠状病毒HCoV-HKU1核糖核酸、人冠状病毒HCoV-229E核糖核酸、人冠状病毒HCoV-NL63核糖核酸、严重急性呼吸综合征冠状病毒核糖核酸(SARS-CoV RNA)、新型冠状病毒核糖核酸 (2019-nCoV RNA)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)核糖核酸、寨卡病毒核糖核酸、嗜肺军团菌脱氧核糖核酸、金黄色葡萄球菌脱氧核糖核酸(SA DNA)、白色念珠菌脱氧核糖核酸、肺炎链球菌脱氧核糖核酸、化脓性链球菌脱氧核糖核酸、流感嗜血杆菌脱氧核糖核酸、大肠杆菌脱氧核糖核酸、沙门氏菌脱氧核糖核酸、乙型肝炎病毒DNA 核酸、丙型肝炎病毒RNA核酸、人类免疫缺陷病毒-1型核酸 (HIV-1RNA)核酸、人乳头瘤病毒16型脱氧核糖核酸(HPV16 DNA) 核酸、EB病毒脱氧核糖核酸(EBV DNA)核酸、人巨细胞病毒脱氧核糖核酸(HCMV DNA)核酸)作为特异性检测样本，采用本发明实施例1及实施例2所述检测方法进行检测，检测结果如图7所示，结果发现均未出现特异性扩增。

Claims (10)

1.一种基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对N基因的第一引物对和第一分子信标探针，针对N501Y基因的第二引物对和第二分子信标探针，针对E484K基因的第三引物对和第三分子信标探针，针对K417N基因的第四引物对和第四分子信标探针。
2.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第一引物对的核酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述第一分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.3。
3.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第二引物对的核酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，所述第二分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.6。
4.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第三引物对的核酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，所述第三分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.9。
5.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第四引物对的核酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，所述第四分子信标探针的核酸序列为SEQ ID NO.12。
6.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述第一分子信标探针、第一分子信标探针、第一分子信标探针、第一分子信标探针的5’端连接有荧光发光基团，且3’端连接有荧光猝灭基团。
7.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述荧光发光基团包括FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Lluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、ROX的一种以上。
8.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述荧光猝灭基团包括DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3的一种以上。
9.根据权利要求1所述的基于MB-RT-PCR检测新型冠状病毒及分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括高保真性Taq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、逆转录酶、PCR增强剂以及MB-RT-PCRBuffer。
10.一种权利要求1～9任一项所述的试剂盒在检测新型冠状病毒及其分型方面的应用。
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