CN113652505A - 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 - Google Patents

检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了检测新型冠状病毒及其VOC‑202012/01突变株的方法和试剂盒，具体的地，本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针集合中获得了灵敏度高、特异性强、稳定性好、对野生型新型冠状病毒无交叉反应，并且能够进行多重检测的引物探针集合，可以用于检测鉴定新型冠状病毒及其VOC‑202012/01突变株。

Description

检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株的方法和试 剂盒
技术领域
本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种高灵敏度、强特异性的2019-nCoV新型冠状病毒N基因和VOC-202012/01突变株S基因中 21991-21993deletion(Y144 deletion)及A230637T(N501Y)PCR检测体系和检测方法。
背景技术
新型冠状病毒是一种单股正链RNA病毒，属冠状病毒科，β冠状病毒属中的Sarbecovirus亚属。新型冠状病毒由于为单链RNA病毒，容易发生突变。病毒的突变与重组对病毒的侵染能力、繁殖能力和病毒的检测、抗体有效性均密切相关，所以对病毒的突变和重组的监视是研究病毒至关重要的一环。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。该病毒主要传播途径为呼吸道飞沫传播和接触传播，潜伏期1-14天，多为3-7天。潜伏期具有传染性，所致疾病没有特异治疗方法。
VOC-202012/01突变株是一种变异新冠病毒，主要出现在伦敦以及英格兰东南部，最早于2020年9月份在患者身上被发现。
基于此，目前需要一种灵敏、精确、快速的方法，用于检测新型冠状病毒肺炎疑似病例、聚集性病例，或用于判断患者呼吸道样本中新型冠状病毒(2019-nCoV) 及VOC-202012/01突变株感染所引起肺炎的治疗疗效。
发明内容
本发明针对新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株开发了检测的方法和试剂盒，以便能够高效率、高特异性、低成本的对感染患者进行检测，并且需要保证检测结果的可靠性。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其 VOC-202012/01突变株的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.8所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.9所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.11所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.12所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种用于用于检测新型冠状病毒及其 VOC-202012/01突变株的探针集，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针；优选地，所述探针集还包括SEQ ID NO.7所示的封闭探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的第三探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的内标探针。
在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的 3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01 突变株的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重成分：热启动Taq酶、逆转录酶、UDG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、dNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。
在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:3所示探针的浓度为4pmol。
在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:6所示探针的浓度为8pmol，SEQ IDNO.:7所示封闭探针的浓度为10pmol。
在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:8和SEQ ID NO.:8所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:10所示探针的浓度为3pmol。
在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示引物浓度为6pmol，SEQ ID NO.:13所示探针的浓度为4pmol。
本发明的第四方面，提供了一种检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：
其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶系。
在另一优选例中，步骤(2)中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:1 和SEQ IDNO.:2所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:3所示探针的浓度为 4pmol。
在另一优选例中，步骤(2)中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:4 和SEQ IDNO.:5所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:6所示探针的浓度为 8pmol，SEQ ID NO.:7所示封闭探针的浓度为10pmol。
在另一优选例中，步骤(2)中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:8 和SEQ IDNO.:9所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:10所示探针的浓度为 3pmol。
在另一优选例中，步骤(2)中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:11 和SEQ IDNO.:12所示引物浓度为6pmol，SEQ ID NO.:13所示探针的浓度为 4pmol。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株。
在另一优选例中，所述PCR为RT-PCR。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了最优体系各通道扩增曲线。
图2为FAM通道检测结果。
图3为TEXAS RED通道检测结果。
图4为VIC通道检测结果。
图5为内标通道检测结果。
图6为FAM通道重复性检测结果。
图7为VIC通道重复性检测结果。
图8为TEXAS RED通道重复性检测结果。
图9为内标通道检测结果。
图10显示了特异性检测结果。
图11显示了13例新型冠状病毒2019-nCoV核酸阳性临床样本。
图12显示了2例VOC-202012/01突变株核酸阳性临床样本。
图13显示了5例阴性临床样本。
图14显示了nCOV-N-F2和nCOV-N-R2检测结果。
图15显示了nCOV-N-F3和nCOV-N-R3检测结果。
图16显示了Y144-F2和Y144-R2检测结果。
图17显示了Y144-F3和Y144-R2检测结果。
图18显示了S-F2和S-R2检测结果。
图19显示了S-F3和S-R3的检测结果。
具体实施方式
实时荧光RT-PCR是冠状病毒核酸检测常用方法之一，在医学和分子生物学领域已经得到了广泛应用。本发明针对新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株，选取野生型新型冠状病毒N基因和VOC-202012/01突变株S基因中 21991-21993deletion(Y144 deletion)及A230637T(N501Y)两个突变位点开发诊断试剂，目的在于提供一种新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株的三重检测试剂盒，以便能够高效率、高特异性、高稳定性、低成本的对新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株感染患者进行检测。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
实时荧光PCR是基于荧光共振能量转移(FRET)原理的技术。其中，以TaqMan 荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术利用热稳定DNA聚合酶Taq酶在具有 5`-3`方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5`-3`方向的核酸外切酶活性。TaqMan荧光探针在5`和3` 端分别标记荧光发射基团和淬灭基团，探针的3`末端被磷酸化以防止探针在 PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用即被解除，荧光发射基团发射波长处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动至探针位置时，Taq DNA 多聚酶的5′核酸外切酶活性能降解特异性荧光标记探针，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光发射出来。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是 DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
本发明的有益效果在于：
(1)使用本发明的试剂盒及检测方法，可以用于检测鉴定新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株。
(2)本发明的检测试剂盒，检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株的灵敏度高、特异性强，并且具有显著提高的抗干扰能力。
(3)本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针集合中获得了对野生型毒株无交叉反应的引物探针组合，并且能够进行多重检测，显著提高了 VOC-202012/01突变株的检测准确率。
本发明适用于对新型冠状病毒的检测，为病毒鉴定分型和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。例如，本发明实施例中涉及的热启动Taq酶、UDG酶、C-MMLV酶、RNasin可购自Invitrogen公司。
实施例1试剂盒及检测方法
根据新型冠状病毒序列，分析其基因组的保守区域，遵循引物和探针的设计原则，在这些保守区域中设计出针对2019新型冠状病毒N基因检测的特异性引物和探针序列。根据VOC-202012/01突变株S基因中21991-21993deletion (Y144 deletion)及A230637T(N501Y)两个突变位点进行引物探针的设计。为了对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控，还设计了内源性内标引物和探针。通过多轮筛选和优化，最终确定一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合。序列如表1所示：
表1引物序列
序列名称 序列 SEQ ID NO.:
nCoV-N-F1 GCGCATTGGCATGGAAGT 1
nCoV-N-R1 TGGATCTTTGTCATCCAATTTG 2
nCoV-N-P1 GAACGTGGTTGACCTACACAGGTGC 3
Y144-F1 ACTTTTGTTGTTTTTGTGGTAAACA 4
Y144-R1 TAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTC 5
Y144-P1 CCCAAAAATGGATCATTACAAAATTGAA 6
Y144-S1 GTTGTTTTTGTGGTAATAAACACCCAA 7
S-F1 TCATATGGTTTCCAACCCTCTT 8
S-R1 TGCTGGTGCATGTAGAAGTTCA 9
S-P1 GGTTACCAACCATACAGAGTAGTA 10
globin-F GTGCACCTGACTCCTGAGGAG 11
globin-R CCTTGATACCAACCTGCCCAG 12
globin-P AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG 13
其中，nCoV-N-P1的5’端荧光发射基团为FAM，3’淬灭基团为BHQ1； Y144-P1的5’端荧光发射基团为VIC，3’淬灭基团为BHQ1；S-P1的5’端荧光发射基团为TEXAS RED，3’淬灭基团为BHQ2；globin-P的5’端荧光发射基团为CY5，3’淬灭基团为BHQ2。
2)检测方法及体系的建立
为了确定引物和探针的检测体系，分别尝试了不同浓度的引物和探针对荧光PCR反应的影响。结果显示，当nCoV-N-F1、nCoV-N-R1引物浓度为10pmol， nCoV-N-P1探针的浓度为3pmol；Y144-F1、Y144-R1引物浓度为10pmol， Y144-S1封闭探针浓度为10pmol，Y144-P1探针的浓度为8pmol；S-F1、S-R1 引物浓度为10pmol，S-P1探针浓度为3pmol；globin-F、globin-R引物浓度为6pmol，globin-P探针浓度为4pmol时扩增曲线最好。
最终，采用的荧光PCR反应体系(25μL)如下：
Figure BDA0003210848570000061
Figure BDA0003210848570000071
在ABI7500荧光PCR仪上进行扩增，扩增程序为：
Figure BDA0003210848570000072
图1显示了最优体系各通道扩增曲线。
实施例2灵敏度的检测
将N基因及VOC-202012/01突变株S突变基因扩增片段分别连接到构建好的pET28a-MS2载体中并转化表达宿主菌BL21感受态细胞，挑取单克隆并测序验证后进行诱导表达,将破碎完全的表达产物以RNaseA和DNaseⅠ消化处理后即为含有目的片段的病毒样颗粒。将测定浓度后的假病毒稀释到合适浓度后再进行10倍倍比稀释，浓度分别为1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03、 1.00E+02copies/ml。用上述确定的检测体系和循环参数对上述质粒进行检测。结果显示，此种检测方法具有较高的灵敏度，见图2-5。结果表明，针对各靶标的灵敏度能够达到1.00E+02copies/ml
图2为FAM通道检测结果；
图3为TEXAS RED通道检测结果；
图4为VIC通道检测结果；
图5为内标通道检测结果。
实施例3、稳定性和特异性的检测
大量临床检测表明，临床样本中存在的干扰物质对检测结果会产生影响，导致检测结果出现波动，灵敏度降低甚至出现假阴性的情况。例如，临床检测普遍使用的咽拭子样本，有时会存在血液污染。因此，需要验证试剂盒检测试剂在干扰物质存在的情况下的检测稳定性。
选取浓度为1.00E+04copies/mL、1.00E+03copies/mL的两个靶标(N基因及突变型S基因)假病毒进行检测，样本中分别加入5％含量的全血，重复10 次。结果表明，本发明试剂盒的检测重复性较好，见图6-9。
图6为FAM通道重复性检测结果；
图7为VIC通道重复性检测结果；
图8为TEXAS RED通道重复性检测结果；
图9为内标通道检测结果。
特异性检测
选取冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒样本进行检测，结果表明本体系具有较高的特异性，见图10。
图10显示了特异性检测结果。
实施例4临床样本检测
采集20例疑似咽拭子临床样本，提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(货号：DA0623)，得到核酸样本(阳性质控品和阴性质控品同步参与提取)；取5μL核酸样本配制PCR 反应体系，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、VIC、 TEXAS RED、CY5，PCR扩增程序如下：
Figure BDA0003210848570000081
PCR扩增结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性。
在所检测的20例疑似临床样本中，共检出13例新型冠状病毒2019-nCoV 核酸阳性临床样本，2例VOC-202012/01突变株核酸阳性临床样本，5例阴性临床样本。典型检测结果如图11-图13所示。
图11显示了13例新型冠状病毒2019-nCoV核酸阳性临床样本；
图12显示了2例VOC-202012/01突变株核酸阳性临床样本；
图13显示了5例阴性临床样本。
对比例1
本发明人在研究过程中，针对新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株目标核酸序列筛选了数十组PCR引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。
由于新型冠状病毒和其突变株的基因序列差异极小，因此开发能够准确识别新型冠状病毒突变株的检测试剂难度较大，很容易出现对野生型新型冠状病毒的交叉反应。例如，针对野生型和VOC-202012/01突变株检测靶标，本发明人经过了大量的筛选、组合，设计的部分典型引物序列如下：
nCOV-N-F2：TGCTGCAATCGTGCTACAAC(SEQ ID NO.:14)
nCOV-N-R2：TGAACTGTTGCGACTACGTGAT(SEQ ID NO.:15)
nCOV-N-F3：GAGGGAGCCTTGAATACACC(SEQ ID NO.:16)
nCOV-N-R3：CTGCCTGGAGTTGAATTTCTT(SEQ ID NO.:17)
Y144-F2：TGATCCATTTTTGGGTGTTTAC(SEQ ID NO.:18)
Y144-R2：CAAGGTCCATAAGAAAAGGCT(SEQ ID NO.:19)
Y144-F3：TCCATTTTTGGGTGTTTACC(SEQ ID NO.:20)
Y144-R3：CAAGGTCCATAAGAAAAGGC(SEQ ID NO.:21)
S-F2：TCATATGGTTTCCAACCCACTT(SEQ ID NO.:22)
S-R2：GGTGCATGTAGAAGTTCAAAAGA(SEQ ID NO.:23)
S-F3：TCATATGGTTTCCAACCCGCTT(SEQ ID NO.:24)
S-R1：TGCTGGTGCATGTAGAAGTTCA(SEQ ID NO.:9)
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行PCR检测测试。
使用nCOV-N-F2和nCOV-N-R2检测新型冠状病毒野生型毒株检测结果如图 14所示(扩增曲线由左至右分别为1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、 1.00E+03copies/ml)，单一检测结果表明该引物对针对野生型新型冠状病毒检测的灵敏度仅为1.00E+03copies/ml。
使用nCOV-N-F3和nCOV-N-R3的检测结果表明该引物对对N基因靶核酸的特异性和灵敏度较佳，但是当样本中存在全血干扰物时，N基因靶核酸扩增受到明显抑制，且扩增曲线不太好，检测结果如图15所示(扩增曲线由左至右分别为1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03、1.00E+02copies/ml)。表明对照引物对NCOV-N-F3和NCOV-N-R3应用于临床时，容易出现假阴性风险。
多重体系中使用Y144-F2和Y144-R2检测新型冠状病毒VOC-202012/01突变株检测结果如图16所示(扩增曲线由左至右分别为1.00E+06、1.00E+05、 1.00E+04、1.00E+03copies/ml)，检测结果表明该引物对的灵敏度仅为 1.00E+03copies/ml。Y144-F3和Y144-R3引物对在常规多重体系中检测 VOC-202012/01突变株的灵敏度较佳，但是当样本中存在全血干扰物时靶核酸扩增受到明显抑制，检测结果如图17所示(扩增曲线由左至右分别为1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03copies/ml)。
使用S-F2和S-R2在单一体系中检测新型冠状病毒VOC-202012/01突变株检测结果如图18所示，检测结果表明该引物对的灵敏度仅为1.00E+03 copies/ml(扩增曲线由左至右分别为1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、 1.00E+03copies/ml)。
使用S-F3和S-R3检测新型冠状病毒VOC-202012/01突变株，检测结果表明该引物对在单一检测体系中对N基因靶核酸的特异性和灵敏度较佳。多重检测结果如图19所示(扩增曲线由左至右分别为1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、 1.00E+03copies/ml)，检测结果表明该引物对在多重检测体系中的灵敏度仅为1.00E+03copies/ml。表明该引物对在多重检测体系中，容易被抑制，灵敏度有所降低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株的方法和试剂盒
<130> 020090
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gcgcattggc atggaagt 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tggatctttg tcatccaatt tg 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gaacgtggtt gacctacaca ggtgc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
acttttgttg tttttgtggt aaaca 25
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
taacgctact aatgttgtta ttaaagtc 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cccaaaaatg gatcattaca aaattgaa 28
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gttgtttttg tggtaataaa cacccaa 27
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tcatatggtt tccaaccctc tt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tgctggtgca tgtagaagtt ca 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ggttaccaac catacagagt agta 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
gtgcacctga ctcctgagga g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ccttgatacc aacctgccca g 21
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
aggtgaacgt ggatgaagtt ggtgg 25
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
tgctgcaatc gtgctacaac 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
tgaactgttg cgactacgtg at 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
gagggagcct tgaatacacc 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ctgcctggag ttgaatttct t 21
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgatccattt ttgggtgttt ac 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
caaggtccat aagaaaaggc t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tccatttttg ggtgtttacc 20
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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caaggtccat aagaaaaggc 20
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<212> DNA
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tcatatggtt tccaacccac tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggtgcatgta gaagttcaaa aga 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
tcatatggtt tccaacccgc tt 22

Claims (10)

1.一种用于检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针集；其中，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；和
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.8所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.9所示的反向引物；
所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针、核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的第二探针、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的第三探针和核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的封闭探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对集还包括：
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.11所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.12所示的反向引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示的内标探针。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重成分：热启动Taq酶、逆转录酶、UDG酶和dNTPs。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，使用所述试剂盒过程中：
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示引物浓度为10pmol，SEQ IDNO.:3所示探针的浓度为4pmol；
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示引物浓度为10pmol，SEQ IDNO.:6所示探针的浓度为8pmol，SEQ ID NO.:7所示封闭探针的浓度为10pmol；
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:8和SEQ ID NO.:8所示引物浓度为10pmol，SEQ IDNO.:10所示探针的浓度为3pmol；和/或
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示引物浓度为6pmol，SEQID NO.:13所示探针的浓度为4pmol。
6.一种非诊断目的的检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：
其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、引物对集和探针集，其中，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.8所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.9所示的反向引物；和
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.11所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.12所示的反向引物；
所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针、核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的第二探针、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的第三探针、核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的封闭探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的内标探针。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核酸样本来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述核酸样本来自环境样本。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中：
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示引物浓度为10pmol，SEQ IDNO.:3所示探针的浓度为4pmol；
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示引物浓度为10pmol，SEQ IDNO.:6所示探针的浓度为8pmol，SEQ ID NO.:7所示封闭探针的浓度为10pmol；
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:8和SEQ ID NO.:8所示引物浓度为10pmol，SEQ IDNO.:10所示探针的浓度为3pmol；和/或
配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:11和SEQ ID NO.:12所示引物浓度为6pmol，SEQID NO.:13所示探针的浓度为4pmol。
10.引物对集和探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒及其VOC-202012/01突变株；其中，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
第三引物对，所述第三引物对包括：
如SEQ ID NO.8所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.9所示的反向引物；和
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.11所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.12所示的反向引物；
所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针、核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的第二探针、核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的第三探针、核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的封闭探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的内标探针。
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