CN112746132B

CN112746132B - 用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112746132B
Application number: CN202110096393.0A
Authority: CN
Inventors: 李建东; 杜珊珊; 李阿茜; 梁米芳; 李德新; 王世文; 黄晓霞; 李川; 王芹; 孙丽娜; 芜为
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2041-01-25
Also published as: CN112746132A

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。本发明提供用于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的分别或同时实时荧光定量RT‑PCR检测的引物探针组合，其含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑9所示。本发明提供的引物探针组合和检测方法具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测简便、快速具有实际应用价值。在新的人兽共患病不断出现的形势下，本发明在疾病的早发现、早诊断方面尤显重要意义。

Description

用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。

背景技术

目前汉坦病毒在全世界分布广泛，在人类中可以引起两种疾病。一种是肾综合征出血热(HFRS)，主要由汉坦病毒(HTNV)和亚洲相关病毒引起，欧洲的普乌拉病毒(PUUV)和多布拉病毒(DOVB)，以及世界范围的汉城病毒(SEOV)；另一种则是汉坦病毒肺综合征(HCPS)，由辛诺姆布雷病毒(SNV)和北美相关病毒引起，以及安第斯病毒(ANDV)和拉丁美洲相关病毒，引起全球广泛关注。

希望山病毒(Prospect Hill virus，PHV)、穆勒舒病毒(Muleshoe virus，MULEV)和里约塞贡多病毒(Rio Segundo virus，RIOSV)都属于属于布尼亚病毒目汉坦病毒科，是一种有包膜的单股负链RNA病毒，其基因组包括L、M、S三个节段，来源于S、L和M片段的多核苷酸分别编码病毒核衣壳蛋白、核糖核酸依赖性核糖核酸聚合酶和糖蛋白前体。

希望山病毒最初是在美国马里兰州弗雷德里克捕获的草地田鼠肺组织中分离出来的，但是感染并不局限于田鼠，而是在美国本土野生啮齿类动物中广泛存在，其3′端核苷酸序列类似于汉坦病毒和普马拉维病毒，表明希望山病毒和普马拉维病毒的结构蛋白(Gl、G2和N)相似。穆勒舒病毒(Muleshoe virus，MULEV)是由Rawlings等人在1996年德克萨斯州北部的鼠类动物中发现。里约塞贡多病毒最初是Hjelle等人在1995年哥斯达黎加中部的动物中被描述的，相关文献报道来自啮齿类动物的汉坦病毒可能比其他汉坦病毒更易于宿主转换，极有可能造成来自一个主要宿主的外溢而在多个物种中传播。它们都属于新世界汉坦病毒，某些新世界汉坦病毒可引起汉坦病毒肺综合征(HPS)，HPS引起的汉坦病毒被美国研究所列为A类病原体，全球每年发生超过50，000例病例，死亡率40％(HPS)，虽然目前并没有发现这三种病毒感染人，但是啮齿类动物传播迅速，并不能排除感染人的可能性。

病毒病实验室检测主要依靠于病毒分离、血清学检测和病毒核酸检测。病毒核酸检测主要是基于PCR技术，实时荧光定量RT-PCR有着快速、高灵敏度和特异度的优点，是目前运用较多的实验室检测方法。该方法基于荧光共振能量迁移的原理，通过对荧光强度变化监测产物量的变化，随着反应时间的进行，将监测到的荧光信号的变化绘制一条曲线。该方法全程闭管操作，降低了污染的风险；对PCR产物除了可以进行定性分析，也可通过绘制标准曲线进行定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏、特异，可分别或同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的实时荧光定量RT-PCR引物探针组合、试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)中检索下载希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的基因组序列，选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类。根据序列比对分析结果，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析，筛选确定在各病毒基因型中高度保守的靶序列，根据靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列分别如SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.7-9所示的分别针对希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的三对特异性引物和三条特异性探针，获得同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒检测的三重实时荧光定量RT-PCR的引物探针组合，并基于此开发了同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒检测的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。

具体地，本发明的技术方案如下：

本发明提供用于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的单独或多重实时荧光定量RT-PCR检测的靶序列组合，其含有三条靶序列，所述靶序列具有如SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸序列。

上述靶序列组合中，希望山病毒的靶序列如SEQ ID NO.10所示，穆勒舒病毒的靶序列如SEQ ID NO.11所示，里约塞贡多病毒的靶序列如SEQ ID NO.12所示。上述序列在各病毒的不同基因型中具有高度的保守性且易于进行PCR扩增，可适用于各病毒不同基因型的高效检测。

本发明提供用于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的分别或同时实时荧光定量RT-PCR检测的引物探针组合，其含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

上述特异性引物和特异性探针中，针对希望山病毒的特异性引物的序列如SEQ IDNO.1-2所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.7所示；针对穆勒舒病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.8所示；针对里约塞贡多病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.5-6所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.9所示。

作为优选，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团，所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

进一步优选地，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记TexasRed荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。采用上述荧光组合能够更好地避免希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒检测的相互干扰，保证希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒同时检测的准确性。

本发明还提供所述引物探针组合在制备用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的试剂盒中的应用。

本发明还提供所述引物探针组合在检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒中的应用。

本发明还提供一种用于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒检测的试剂盒，其包含序列分别如SEQ ID NO.1-9所示的引物探针组合。

作为优选，所述试剂盒还包含希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的阳性对照标准品。

所述希望山病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或者希望山病毒RNA。所述穆勒舒病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者穆勒舒病毒RNA；所述里约塞贡多病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或者里约塞贡多病毒RNA。

进一步优选地，所述试剂盒还包含其它为实现实时荧光定量RT-PCR检测的试剂，包括但不限于反应缓冲液、酶和水等。

本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行分别或同时实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序可根据所使用的逆转录酶和聚合酶的特性确定。

作为优选，所述引物探针组合或所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。采用上述反应程序，能够更好地保证希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的高效扩增检测。

本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行分别或同时实时荧光定量RT-PCR检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2∶2∶1。更优选地，在分别或同时进行实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL。

本发明提供的引物探针组合可在不同的反应体系中分别进行希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的检测，也可在同一反应体系中同时进行上述三种病毒的检测。

当在不同的反应体系中分别进行希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的检测时，以上所述的上游引物为SEQ ID NO.1、3、5所示引物中的任一条，下游引物为SEQ IDNO.2、4、6所示引物中的任一条，探针为SEQ ID NO.7-9所示的探针中的任一条。

当在同一反应体系中同时进行希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的检测时(三重实时荧光定量RT-PCR)，以上所述的25μL反应体系中，SEQ ID NO.1、3、5所示的上游引物各0.5μL，SEQ ID NO.2、4、6所示的下游引物各0.5μL，SEQ ID NO.7-9所示的探针各0.25μL。

本发明还提供所述的引物探针组合或所述的试剂盒在检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒中的应用。

比如，在一些实施方案中，可以通过检测人或动物的离体样本，来判断其是否感染希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒。在一些实施方案中，还可以检测食品(尤其是动物源性食品)或其他可能感染上述病毒的样本，以利于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的监测工作及流行病学研究。

本发明还提供一种利用实时荧光定量RT-PCR分别或同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的方法，其为以待测样品的RNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒。

上述提取病毒总RNA的方法可采用本领域常规方法，如离心柱提取法。

作为优选，所述实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。。

作为优选，在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2∶2∶1。更优选的，所述实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL。

作为优选，上述根据扩增曲线判断待测样品中是否含有希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的方法如下：

有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值＞38；

若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct＜35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct＞38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35＜Ct＜38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct＜38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性；

无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。

上述结果判定中，希望山病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.10所示的DNA序列对应的RNA或者希望山病毒RNA。所述穆勒舒病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者穆勒舒病毒RNA；所述里约塞贡多病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或者里约塞贡多病毒RNA。

本发明所述的希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的实时荧光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有的实时荧光定量PCR仪。

本发明的有益效果在于：

本发明结合相关病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，形成以希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒为检测靶标的新的组合检测方案。

本发明通过大量序列比对分析确定了希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒各基因型之间高度保守的靶序列，针对确定的靶序列通过大量筛选和优化，分别获得了适用于实时荧光定量RT-PCR检测的特异性引物和探针，该引物和探针在希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的各个基因型中具有很好的普适性。

本发明建立了同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的单独或多重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在一个实时荧光定量RT-PCR反应体系内，同时引入分别针对希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的三对特异性引物和不同标记的探针，通过实时荧光信号的动态变化，对未知样本进行定性分析；也可通过标准参考品的检测，绘制标准曲线，实现对未知模板的定量分析。与其它检测方法相比，本发明提供的检测方法具有高灵敏性和特异性、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染等优点，可直接对未知样本里提取的RNA进行检测，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。在人兽共患病发生率不断提高的形势下，本发明在疾病的早发现、早诊断方面具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例3中多重实时荧光定量RT-PCR检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的特异性分析结果。

图2为本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的希望山病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图3为本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的穆勒舒病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图4本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的里约塞贡多病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图5为本发明实施例4中多重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的希望山病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图6为本发明实施例4中多重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的穆勒舒病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图7为本发明实施例4中多重实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的里约塞贡多病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。

图8中由上至下分别为本发明实施例5中多重实时荧光定量RT-PCR检测希望山病毒低，中，高三个浓度的可重复性分析结果图。

图9中由上至下分别为本发明实施例5中多重实时荧光定量RT-PCR检测穆勒舒病毒低，中，高三个浓度的可重复性分析结果图。

图10中由上至下分别为本发明实施例5中多重实时荧光定量RT-PCR检测里约塞贡多病毒低，中，高三个浓度的可重复性分析结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的特异性引物和探针的设计

1、引物和探针的设计和筛选

在NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等中检索下载希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的基因组序列。选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类，根据序列比对分析结果筛选确定在希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的各个基因型中高度保守的靶序列。

针对上述靶序列设计特异性引物和探针，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析进行特异性引物和探针的设计和筛选。本发明经过大量设计、筛选和对比实验发现，并非单单满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现高效特异灵敏的三重实时荧光定量RT-PCR同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒。本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选，最终得到如下分别针对希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的特异性引物对和特异性探针。

希望山病毒：

特异性引物：

PHV-F：5’-CAGGAAGAGATCACTCGCCAT-3’(SEQ ID NO.1)

PHV-R：5’-CAATGTTGACACTGCTGACCG-3’(SEQ ID NO.2)

特异性探针：

PHV-P：5’-TCCACCTCCACYGTCCTTTCAGCTTCCTT-3’(SEQ ID NO.7)

穆勒舒病毒：

特异性引物：

MULEV-F：5’-GGTAATGTGCTTGATGTTAA-3’(SEQ ID NO.3)

MULEV-R：5’-CCTTCCTCTAGTTGACAGCA-3’(SEQ ID NO.4)

特异性探针：

MULEV-P：5’-AGGGGTTTATGTCCTCAGCTTTGTACTCCC-3’(SEQ ID NO.8)

里约塞贡多病毒：

特异性引物：

RIOSV-F：5’-GGTCAATCGGAATGTATATC-3’(SEQ ID NO.5)

RIOSV-R：5’-TAAACCTAATTCGCGTTCCC-3’(SEQ ID NO.6)

特异性探针：

RIOSV-P：5’-AGCTTCACACTGCCCATCGTCCTTAAAGC-3’(SEQ ID NO.9)。

2、引物和探针的合成

上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成，其中，希望山病毒探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；里约塞贡多病毒探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；穆勒舒病毒探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团。

实施例2三重实时荧光定量RT-PCR同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的检测方法的建立

1、病毒核酸的提取收集待测病毒的细胞培养上清，采用QIAamp Viral RNA MiniKit提取病毒核酸。

2、阳性标准品的制备

对于三种病毒，通过合成三种病毒基因的保守区(如SEQ ID NO.10-12所示)作为阳性标准品，将合成的目的基因克隆至pET-22b载体中，酶切位点为NdeⅠ和XhoⅠ，基因合成与质粒克隆由北京天一辉远生物公司完成。用thermo公司2×PCR Mix试剂对克隆质粒中含有的目的基因进行普通PCR扩增，扩增引物用通用引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ IDNO.13)和T7t(ACATCCACTTTGCCTTTCTC，SEQ ID NO.14)。体外转录为负链RNA，纯化回收定量而获得。采用QiAgen公司Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化PCR产物，Nanodrop紫外可见分光光度计对回收的DNA模板定量。采用Promega公司Ribomaxtm large scale RNAproduction system-sf6 and T7试剂盒进行目的基因的RNA体外转录，Qian公司RNeasymini kit对RNA体外转录产物回收。琼脂糖凝胶电泳分析体外转录获得的RNA模板(SFTSV-NP)的纯度后，使用DEPC处理水进行稀释后，采用Nanodrop分光光度计进行3次测量，保证测量的值在100-300ng/μL之间，取测量的平均值计算各纯化后RNA产物的质量浓度后，采用下列公式，计算各自的拷贝数浓度：

Y(copies/μL)＝[X(g/μL)/核苷酸的转录长度×340]×6.02×10²³。

上述操作均按照试剂盒说明进行。

3、实时荧光定量RT-PCR检测

采用AgPath-ID One Step RT-PCR Kit(Ambion)试剂盒进行单重和三重实时荧光定量RT-PCR反应，利用实施例1最终获得的特异性引物(序列如SEQ ID NO.1-6所示)和探针(序列如SEQ ID NO.7-9所示)进行实时荧光定量RT-PCR检测。

本发明通过优化实施例1获得的用于三种病毒检测的特异性引物和探针的反应条件，使其能够实现高效的组合检测，具体反应条件如下：

25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL；

反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。

4、结果分析和判断

检测结果需根据反应体系中所设置的阳性对照(或检测管内标)、用无RNA水解酶的去离子水作为阴性对照的扩增结果和扩增曲线进行判断。

有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值＞38。

若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct＜35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct＞38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35＜Ct＜38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct＜38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性。

实施例3三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性分析

以希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒体外转录合成的RNA标准品作为阳性对照，将登革病毒Ⅰ～Ⅳ型、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、黄热病毒疫苗株、SFTS病毒、汉滩病毒、汉城病毒、乙型脑炎病毒、塔西那病毒、盖塔病毒、科萨努尔森林病病毒、甲型流感病毒1型及3型、乙型流感病毒BY型及BV型RNA作为对照病毒，对实施例2提供的检测方法进行特异性分析。

采用实施例2的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，具体处理组设计如下：以希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒体外转录合成的RNA标准品(浓度为1×10⁸copies/uL)为阳性对照；以登革病毒Ⅰ～Ⅳ型、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、黄热病毒疫苗株、SFTS病毒、汉滩病毒、汉城病毒、乙型脑炎病毒、塔西那病毒、盖塔病毒、科萨努尔森林病病毒、甲型流感病毒1型及3型、乙型流感病毒BY型及BV型RNA组成的模拟其他病毒感染样品，江西省省疾控捕获20只家鼠和野鼠的肺组织研磨液提取的RNA和健康人体检血清标本100份进行特异性验证。

结果如图1以及表1所示，登革病毒Ⅰ～Ⅳ型、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、黄热病毒疫苗株、SFTS病毒、汉滩病毒、汉城病毒、乙型脑炎病毒、塔西那病毒、盖塔病毒、科萨努尔森林病病毒、甲型流感病毒1型及3型、乙型流感病毒BY型及BV型RNA，江西省省疾控捕获20只家鼠和野鼠的肺组织研磨液提取的RNA和100份健康人血清RNA提取物无非特异性扩增，表明实施例2的检测方法具有高度特异性。

表1.三种汉坦病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性分析

实施例4三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度(检测限)分析

对上述提取获得的希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒体外转录的RNA进行定量，根据如下公式计算RNA拷贝数：Y(copies/μl)＝X(g/μl)×6.02×10²³/Transcriptlength in nucleotides×340，其中Y为RNA拷贝数，X为RNA的浓度。对上述已知浓度的RNA进行10倍系列稀释，对体外转录的希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒标准品RNA稀释成1×10⁸copies/μL至1×10¹copies/μL共8个浓度梯度。

以上述梯度稀释的不同浓度的RNA为模板，采用实施例2中的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，对每个反应设立三组平行实验，确定实施例2的检测方法的检测限。

以不同浓度样本的拷贝数为横坐标，循环阈值(CT)为纵坐标，制作标准曲线，通过所得标准曲线对三种病毒各自的单重实时荧光RT-PCR与三重实时荧光定量RT-PCR的灵敏性进行比较，通过单重实时荧光RT-PCR(如图2、3、4所示)与三重实时荧光定量RT-PCR(如图5、6、7所示)比较可知，希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的最低检出限之间无明显差异(结果见表2)，说明实施例2的检测方法具有良好的灵敏度。

表2希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的单重和三重实时荧光定量RT-PCR结果

实施例5三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的可重复性分析

分别选取稀释度为1×10⁶copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10²copies/μL的三个不同浓度梯度的希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒体外转录RNA标准品为模板，分别进行20次平行重复实验验证实施例2提供的检测方法的稳定重复性。

结果如图8-10所示，希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒各次检测实验的标准差均控制在1.5以内，变异系数在4％以下(结果见表3)，说明实施例2的检测方法具有较好的稳定性和可重复性。

表3希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的稳定性评价

上文中用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法

<130> KHP211110060.2

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggaagaga tcactcgcca t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatgttgac actgctgacc g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaatgtgc ttgatgttaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttcctcta gttgacagca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtcaatcgg aatgtatatc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaacctaat tcgcgttccc 20

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccacctcca cygtcctttc agcttcctt 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggggtttat gtcctcagct ttgtactccc 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcttcacac tgcccatcgt ccttaaagc 29

<210> 10

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgagccaac tcagggaaac acaggaagag atcactcgcc atgagcagca gcttgtcatt 60

gcccggcaga agctcaagga agctgaacgg acggtggagg tggacccaga tgacgttaac 120

aaaagtacac tgcaaagcag gcggtcagca gtgtcaacat tggaggacaa attggcagag 180

ttcaagaggc agcttgcaga tgtcatctca cgtcagaaga tggatgagaa acctgtggat 240

ccaactggta ttgagcttga cgaccatctt aaggagaggt caagcctcca atatggaaat 300

gtccttgatg tgaattccat tgatatagaa gaacctagtg gccagacagc tgattggctt 360

aagattggca gctacatcat agaatttgca ctacctatca tcttgaaagc cttgcatatg 420

ttgtcaacta gagggaggca aactgtaaaa gagaataagg ggacaaggat caggttcaaa 480

gatgatagtt cctatgaaga tgtgaatggc attagacgcc caaagcacct ttatgtgtct 540

atgccaacag cccagtcaac aatgaaagct gaggaattaa caccagggag attcaggaca 600

attgtttgtg gactatttcc tgcacagatc atggcaagaa atatcatcag tcctgtaatg 660

ggtgtgatcg gatttgcatt ttttgtaaag gattgggctg acaaagtaaa ggcatttctt 720

gaccagaaat gtccattcct aaaggctgag ccacgtcctg gacagcctgc cggtgaagca 780

gaatttctca gtagtattag ggcctacctc atgaaccggc aagcagtcct agatgaaaca 840

catctgccag acatagatgc actagttgaa cttgctgcct caggggatcc aacactgcca 900

gactcacttg aaaatccaca tgcagcttgg gtctttgcat gtgctcctga ccgatgtcca 960

ccaacatgca tctatattgc agggatggca gaacttggcg cattttttgc aatcctacag 1020

gatatgcgaa ataccatcat ggcatctaaa accgtaggaa cagctgaaga aaagcttaaa 1080

aagaagtctg cattttatca gtcgtaccta cgaagaacac aatctatggg gatccagcta 1140

gaccagagga ttatcctcat gtacatgatt gagtggggaa atgaggtcgt taaccacttc 1200

cacctgggtg atgatatgga tcccgagcta aggcagttag ctcaagctct cattgaccaa 1260

aaggtcaaag agatatctaa ccaagagcca ctaaagatat ag 1302

<210> 11

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgagcaacc tcaaagaagt acaagagaac ataacagttc atgagcagca gctggtggca 60

gctaaacaaa agctcaaaga tgccgaacga acaatggaag tggaccccga tgatgttaac 120

aaaagcacat tacagagcag acgggcagct gtgtctgcac tggagaccaa acttggtgaa 180

ctcaagagac aactggcaga tcttgttgca gctcagaaac tggctgcaaa acctgttgat 240

ccaacagggc ttgagcctga tgaccatttg aaggagaaat catctttgag atatggtaat 300

gtgcttgatg ttaattctat agatttggaa gaaccaagtg ggcaaactgc agactggaag 360

gctatagggg tttatgtcct cagctttgta ctccctattg tcttaaaggc tctttacatg 420

ctgtcaacta gaggaaggca gacagtcaaa gagaacaaag ggacaagaat caggtttaaa 480

gatgattcat catttgaaga tgtcaacggg atacggaagc caaaacattt atacatctcc 540

ttgccaacag cacaatctac aatgaaggca gacgaaataa cacctggccg ttttaggaca 600

attgtttgtg gattattccc ggcacagatt aaggcaagaa acatcattag tcctgtcatg 660

ggtgtgattg gattttcatt ttttgtcaaa gactgggtgg ataaaattga ggattttttc 720

agagaagaat gtccatttct atcaaaacct aagggacaaa ccggtcagcc tacttccacg 780

aatggggtgt acttcatgaa taggcaagca caagttgatg aatcaaaggt accagacatt 840

gttgacctga ttgacacagc ggcagctgag ggtgccacac tatttgatga gatatccagc 900

cctcatgcag catgggtttt ctcatgtgcc cctgaccgtt gcccaccgac tgcactttat 960

gttgctggtg ttcctgagtt aggtgcattc ttttcaatac ttcaagacat gagaaatact 1020

attatggcat caaagtctgt gggcactgct gaagaaaagc tgaagaagaa gtccgctttc 1080

taccaatctt acttgcgtag gacacagtca atgggaattc aacttgacca aaaaataatt 1140

atcttataca tgcttcagtg gggaaaggat gccgtcaacc actttcacct tggtgatgat 1200

atggatccag aactaagaca acttgcacag actttggtgg acacaaaggt taaagagata 1260

tcaaaccaag aaccactaaa gatctag 1287

<210> 12

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgagcaacc tcaaagaact tcaggacaac atcacagccc atgaacagca gctcgtgtct 60

gctcgtcaaa agctaaagga tgccgagaaa gcagttgagg tggaccccga tgatgttaac 120

aaaagtacat tacaaagcag acgggctgca gtgtcagcat tggagaccaa actgggagaa 180

ctcaagagac agctggcaga ttttgttaca tctcagaagc tggctactaa acctgtagac 240

ccaacaggga ttgaaccaga tgatcatctc aaggaaaagt catcacttag gtatggcaat 300

gtccttgatg tcaattctgt ggaccttgaa gagccaagtg gccaaacagc tgactggagg 360

tcaatcggaa tgtatatctt aagcttcaca ctgcccatcg tccttaaagc attatacatg 420

ctttctacaa ggggtcgaca aacagtaaaa gaaaataagg gaacgcgaat taggtttaaa 480

gatgatacat cttttgaaga agtgaatggg atccgtagac ctcgtcatct ctatgtgtca 540

atgcctactg ctcagtcaac aatgagagct gatgaaataa cacctgggag atataggact 600

ataacctgtg gccttttccc tgctcaagta aaagctagaa acattgtcag tccagtcatg 660

ggggtcatcg gtttcagttt ctttgtaaaa gattgggcag agaaaattga tgaattcctt 720

gctgctgagt gcccatttct ccctaaagct caaggcagtg cagacaagtt actgtctacc 780

atcagggcat atttcataac ccgacaggac caagtcatgc agtccatgct tccagagctg 840

tctgacttaa ttgctgaagc tcaggcccaa ggggcaacat tattcaatga cattacatct 900

cctcattctg tgtgggtatt tgcatgtgca cctgatcgtt gtcctcctac agcattatat 960

gttgcagggt taccagaatt gggagcattt ttttccatac tacaggacat gagaaacaca 1020

attatggctt caaaagctgt tggaacagct gaggaaaaaa tgaaaaagaa gtctgctttc 1080

taccaatcat atctgaggag aacacagtca atgggcatcc agcttgacca aaggattatc 1140

atcatgtata tgtcacattg gggtaaagac attgtaaatc atttccatct tggagatgac 1200

atggatcctg aacttcgtgc catggctcag tcattggttg attcaaaggt gaaagagatt 1260

tctaatcagg agccactcaa aatttaa 1287

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactataggg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acatccactt tgcctttctc 20

Claims

1.用于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的多重实时荧光定量RT-PCR检测的引物探针的组合物，其特征在于，由三对特异性引物和三条特异性探针组成，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针的组合物，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团为荧光报告基团和荧光猝灭基团；所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针的组合物，其特征在于，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ IDNO.8所示的特异性探针的5’端标记Texas Red荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。

4.权利要求1～3中任一项所述的引物探针的组合物在制备用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的试剂盒中的应用。

5.用于希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针的组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。

8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，用无RNA水解酶的纯净水补足至25μL。

9.一种利用实时荧光定量RT-PCR同时检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的方法，其特征在于，所述方法为非诊断治疗目的，以待测样品的RNA为检测模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环；和/或，所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，RNase Free Water补足至25μL。