CN111235321A

CN111235321A - 一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒

Info

Publication number: CN111235321A
Application number: CN202010295428.9A
Authority: CN
Inventors: 郑敏; 陈少莺; 王劭; 林峰强; 陈秀琴; 陈仕龙; 黄梅清; 程晓霞
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2020-06-05

Abstract

本发明提供一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括2对引物和2条探针，具体序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明通过所述试剂盒建立能够同时对鸭群中番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒鉴别诊断的一步法检测方法，程序快速、简便、特异性强。目前，还没有基于TaqMan‑MGB的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法可以同时鉴别检测MDRV和NDRV的发明专利，本研究可以填补这方面的空白。

Description

一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于预防兽医学领域，涉及番鸭呼肠孤病毒（MDRV）和新型番鸭呼肠孤病毒（NDRV）双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针，具体涉及用于同时检测MDRV和NDRV多重TaqMan 实时荧光定量RT-PCR方法的试剂盒。

背景技术

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck Reovirus, MDRV)，是引起7 -45日龄雏番鸭软脚、水性腹泻、急性死亡和发育迟缓的急性传染病，剖检以引起肝脏和脾脏肿大，并有大量白色针头样坏死灶为典型特征。MDRV最早于1972年法国学者分离鉴定，1997年开始该病在我国的福建、浙江、广东、江苏和江西等番鸭饲养区暴发流行，由于其感染的高发病率(30～90%)和死亡率(18 ～72%)。

2005年以来在福建、广东和浙江等地番鸭、半番鸭和麻鸭群中暴发一种以肝脏、脾脏不规则斑块出血和坏死、多器官出血为主要特征的“鸭出血性坏死性肝炎”。由陈少莺课题组首次分离并鉴定出该病的病原是一种有别于番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒(AvainReovirus，ARV) 的新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck Reovirus ，NDRV)。与之前所述的所有DRV感染相比，NDRV感染表现出明显的生物学特征，其具有更高的毒力和更广泛的宿主种类，该病的发病日龄为6～25日龄，发病率为5％～20％，死亡率为3％～16％，且日龄越小，发病率、病死率越高。

MDRV和NDRV之间生物学特征差异较大，抗原相关性低。由于禽呼肠孤病毒是一种分节段病毒，不同毒株同一节段内核苷酸序列具有不同的相似性。禽源呼肠孤病毒S3基因编码的σB蛋白，是病毒外衣壳主要成分，能诱导机体产生群特异性中和抗体。研究表明，MDRV和NDRV的S3基因处在不同的进化分支，具有不同的分子特征，核苷酸和氨基酸的同源性仅为58.2%～62.7%和63%～70.4%。虽然MDRV和NDRV临床诊断上可通过病鸭肝脏不同的剖检情况进行初步判断区分，只凭临床诊断剖检不能确定是否存在二者混合感染的可能，必须通过分析分离病毒对易感细胞与实验室禽类的致病性进行鉴别判断。同时水禽呼肠孤病毒属于免疫抑制性病毒，与其他病原体的共感染增强了禽源呼肠孤病毒的致病性，同时也会造成疫苗免疫后免疫效果不佳的情况，使禽源呼肠孤病毒的诊断和控制变得复杂。因此，对MDRV和NDRV两种疾病的早期诊断和种鸭感染状况筛查显得尤为重要，建立一种快速、敏感、特异的检测方法是防控这两种疾病的前提。

目前MDRV和NDRV的常用诊断技术主要有病毒分离与鉴定、常规RT-PCR检测技术、免疫荧光实验、RT-LAMP、常规RT-PCR检测方法等。然而这些方法都存在费时费力，容易交叉污染出现假阳性等问题，且只可对特定基因进行扩增，但不能进行定量分析。而实时荧光定量 PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。MGB探针技术是近几年研发的一种新型探针技术，它是将MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针模板提高杂交稳定性，使短至15个碱基的探针获得高错配区分辩别能力。MGB探针包括一个不发荧光的淬灭基团（NFQ），极大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，增加Tm值，提高信噪比，从而提高检验灵敏性等优点。TaqMan-MGB 实时荧光定量PCR技术不仅准确检测出样品中的基因数目，具有灵敏度高、特异性强的优势，有效地避免了实验室交叉污染，可在较短的时间内得到结果，有效解决PCR污染问题。

但到目前为止，未见到有关MDRV和NDRV的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的报道，未实现对MDRV和NDRV的同时定量检测。本发明首次将TaqMan-MGB实时定量RT-PCR技术应用于同时检测番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒检测领域，提供了针对MDRV和NDRV的特异性引物、探针序列、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供同时检测番鸭呼肠孤病毒（MDRV）和新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的双重TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测引物和探针。同时提供一种快速、准确、简便的一步法同时检测检测番鸭呼肠孤病毒（MDRV）和新型番鸭呼肠孤病毒（NDRV）的双重TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了检测番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测两对引物和探针，具体如下：

1、通过序列比较，根据MDRV的S3基因，在其保守区设计一对引物和探针，序列如下：

上游引物：（MDRV-F）5′-CCACCACCGCATATGATGTTG-3′；

下游引物：（MDRV-R）5′- CATAACTGCTACCAACGGTGAAA-3′；

探针序列：（MDRV- probe）5’- FAM-CTTAGCAGGCTTTCCC-3′-MGBNFQ -3’，

该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，淬灭基团为NFQ。

2、通过序列比较，根据NDRV的S3基因，在其保守区设计一对引物和探针，序列如下：

上游引物：（NDRV-F）5′- CGATGTTAGTAACCATGCCAACTC -3′；

下游引物：（NDRV-R）5′- CTCGACATCATGATCCAAGTTACCT -3′；

探针序列：（NDRV- probe）5’- VIC- CCACAGCACCATCTCC -3′-MGBNFQ -3’.

该探针的5’端标记报告荧光基团VIC，淬灭基团为NFQ。

根据所述引物和探针建立的番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测试剂盒，番鸭呼肠孤病毒探针的5’端标记报告荧光基团FAM、新型鸭呼肠孤病毒的探针5’端标记报告荧光基团VIC；MDRV和NDRV的3′端均标记为不发光的淬灭基团MGBNFQ。采用不发光的MGBNFQ淬灭基团，其本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，可极大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，进一步保证了结果的特异性和敏感性，MGB技术的优势在双重或者多重荧光定量PCR试验中得到更好的体现。

所述的双重实时荧光定量RT-PCR扩增条件为：4×TaqPath^tm 1-step MultiplexMaster Mix 5µL、上下游各引物（0.2μM ）0.5µL和探针 0.5 µL，模板2µL，RT-qPCR GradeWater 12µL。优化出的最佳反应条件为：UNG incubation 25℃ 2min; 反转录 53℃10mins; 95℃ 2mins ; 95℃3sec60℃ 30 sec 40 个循环。本发明采用一步法步法荧光定量RT-PCR程序较两步法荧光定量RT-PCR更快速、简便、高效。

本发明的优点在于：

1、本发明能同时检测番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒两种病毒。

2、定量准确，灵敏度高，最低能检测出28.3拷贝番鸭呼肠孤病毒和432拷贝的新型鸭呼肠孤病毒。

3、特异性强：和水禽常见传染病（如禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎、禽流感病毒、番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒）均无反应信号，仅对番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒检测出特异性荧光信号。

4、本发明一步法荧光定量RT-PCR检测较两步法荧光定量RT-PCR更快速，简便，减少污染机会，同时减少了RNA二级结构和PCR反应的错配率，实现快速、高效、准确，为MDRV和NDRV二种病毒的临床快速诊断、鉴别检测、疫苗效果监测和流行病学调查提供技术支撑。

附图说明

图1 荧光定量RT-PCR法对10倍梯度稀释MDRV的RNA标准品的检测结果，1:2.83×10⁸；2:2.83×10⁷；3:2.83×10⁶；4:2.83×10⁵；5:2.83×10⁴ ；6:2.83×10³；7:2.83×10²；8:2.83×10¹；9:2.83×10⁰拷贝/µL；0：阴性对照。

图2荧光定量RT-PCR法对10倍梯度稀释NDRV的RNA标准品的检测结果，1: 4.32×10⁸；2:4.32×10⁷；3:4.32×10⁶；4:4.32×10⁵；5:4.32×10⁴ ；6:4.32×10³；7:4.32×10²；8:4.32×10¹；0：阴性对照。

图3 MDRV和NDRV双重荧光定量RT-PCR FAM通道检测结果，对照组：禽呼肠孤病毒（ARV），番鸭细小病毒（MDPV）,鹅细小病毒（MDGPV）,禽流感病毒（AIV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、正常番鸭成纤维细胞、正常尿囊液。

图4 MDRV和NDRV双重荧光定量RT-PCR VIC通道检测结果，对照组：禽呼肠孤病毒（ARV），番鸭细小病毒（MDPV）,鹅细小病毒（MDGPV）,禽流感病毒（AIV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、正常番鸭成纤维细胞、正常尿囊液。

具体实施方式

实施例1

1 材料与方法

1.1病毒株和细胞

番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、禽呼肠孤病毒（ARV），番鸭细小病毒（MDPV）、鹅细小病毒（MDGPV）、禽流感病毒（AIV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、正常番鸭成纤维细胞、正常尿囊液均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所病毒室保存。

1.2主要试剂

TaqPath^tm 1-step Multiplex Master Mix购自美国ABI生物公司；克隆载体pMD18-T连接试剂盒，购于宝生物（大连）工程有限公司；T7 RNA聚合酶为Promega公司产品； DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均为OMEGA公司产品，大肠杆菌（Escherichia Coli）DH5α由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒室提供。RNA提取试剂盒QIAamp viral RNAmini kit 为QIAGEN公司产品。

1.3双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立

1.3.1 1.2.1探针和引物的设计

分别以MDRV(S14株)以及NDRV（NP03株）的S3基因保守片段作为靶区段，按照荧光定量PCR引物和探针设计的原则应用primer 5．0软件设计引物和探针，采用BLAST工具进行检索，验证设计的引物特异性、无交叉干扰。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选试验，探针采用TaqMan-MGB探针技术，将番鸭呼肠孤病毒5’端标记FAM作为报告发光基团，3’端标记NFQ为淬灭基团，扩增目的片段长度为68bp；新型鸭呼肠孤病毒5’端荧光标记选择VIC作为报告发光基团，3’端标记NFQ为淬灭基团，扩增目的片段长度为77bp。引物和探针均送至美国ABI生物公司合成，引物和探针序列见表1：

表1 MDRV和NDRV双重荧光定量PCR引物与探针

1.2 标准阳性质控品的制备

根据本实验团队已建立的方法，分别扩增出包含本实验设计的MDRV和NDRV引物和探针序列的基因片段，再将这两种病毒包含荧光定量PCR引物和探针的扩增片段纯化后分别连接到 PMD-18T载体，并进行克隆，构建出重组质粒，阳性cDNA阳性克隆经酶切和测序进行鉴定。以阳性cDNA作为模板，去除RNase后加入T7 RNA聚合酶（购自TAKARA，大连）进行体外转录，以获得转录的阳性RNA标准品模板 MD1和 NDP2。用核酸蛋白分析仪测定质粒RNA的浓度分别计算标准品的拷贝数，于-20℃保存备用。

1.3.3 双重荧光定量PCR反应体系和反应条件的建立

本研究在建立单重荧光定量RT-PCR反应体系和条件基础上，采用矩阵法选择引物和探针的浓度，进一步优化反应体系。

1.3.4 标准曲线的建立将MDRV和NDRV的RNA标准品均按10倍系列梯度稀释（10⁷～10⁰），再将每种浓度的质粒做3个重复进行荧光定量RT-PCR；以起始模板数的对数为x轴，循环阈值（Ct值）为Y轴作回归曲线，分别建立标准品的拷贝浓度与循环阈值对应的MDRV和NDRV的定量标准曲线。

1.4 特异性、敏感性、重复性测定

1.4.1 特异性试验

同时应用设计的MDRV和NDRV荧光定量引物和探针对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、禽呼肠孤病毒（ARV），番鸭细小病毒（MDPV）、鹅细小病毒（MDGPV）、禽流感病毒（AIV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、正常番鸭成纤维细胞、正常尿囊液进行荧光定量RT-PCR检测，检测本方法的特异性。

1.4.2 敏感性试验

将MDRV和NDRV的RNA标准质控品分别作10倍梯度稀释，稀释至用荧光定量PCR仪不能检出，以此计算出荧光定量PCR仪所能检出的最低模板拷贝数，确定该方法检测每种病毒的敏感性，并同时对检测结果与常规RT-PCR检测方法进行比较。同时分别比较NDRV和MDRV 稀释浓度与荧光定量RT-PCR阳性率的相关性，进一步评价该方法的敏感性。

1.4.3 重复性试验

用所建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法对MDRV病毒RNA标准品浓度为2.83×10⁶-2.83×10¹ copies/μL和NDRV病毒RNA标准品浓度为作为4.32×10⁶-4.32×10¹ copies/μL模板进行批内试验和批间试验，结果将上述浓度的MDRV和NDRV病毒RNA作为模板在不同时间内进行3次双重TaqMan荧光RT-PCR的批间试验，将每种病毒的Tm值进行统计学分析，并计算其变异系数。变异系数(p) =标准偏差(SD)／平均数(X)，从而验证双重TaqMan荧光RT-PCR方法的稳定性。

1.5 对人工感染样品和临床样品检测用所建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法对40份人工感染样品和40份临床样品进行检测，并与常规PCR检测方法进行比较，计算二者的检测符合率。

结果

2.1 双重荧光定量PCR反应体系和反应条件的建立

经过优化和选择最终确立的荧光定量RT-PCR反应总体积为20 µL，4×TaqPath^tm 1-step Multiplex Master Mix 5µL、MDRV/NDRV上下游各引物（0.2μM ）0.5µL和探针 0.5 µL，模板2µL，RT-qPCR Grade Water 11µL；优化出的最佳反应条件为：UNG incubation 25℃2min; 反转录 53℃10min ，聚合酶激活 95℃ 2mins ; 95℃ 3s、60℃30s ，共40 个循环。

2.1 标准曲线的建立

以阳性质控品起始模板数的对数为x轴，循环阈值（Ct值）为Y轴作回归曲线，建立MDRV和NDRV的标准曲线分别如图1和图2所示；图1为MDRV的动力学曲线和标准曲线图，MDRV的最低检测限LOD为浓度为2.83×10¹拷贝/µL；直线方程为：y= -3.396x + 35.92；扩增效率为0.97，相关系数为0.995；图2为NDRV的动力学曲线图和标准曲线图，相对应的最低检测限的RNA模板浓度为4.32×10²拷贝/µL；NDRV的直线方程为：y=-3.512x+40.92，扩增效率为0.99，相关系数为0.997。提示所建立的双重荧光RT-PCR检测体系检测不同浓度的病毒核酸均具有良好的线性相关和理想的检测效果。根据以上MDRV和NDRV的标准曲线方程，将待检样品的Ct值代入方程，即可计算出病毒核酸样品的初始拷贝数。

2.3 特异性试验应用设计的MDRV和NDRV双重荧光定量RT-PCR对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、禽呼肠孤病毒（ARV），番鸭细小病毒（MDPV）、鹅细小病毒（MDGPV）、禽流感病毒（AIV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、正常番鸭成纤维细胞、正常尿囊液进行检测，结果显示FAM通道只有MDRV检测到荧光信号，VIC通道只有NDRV检测到荧光信号，其他病毒核酸均为阴性，表明对MDRV和NDRV的检测具有较好的特异性（如图3、图4）

2.4 敏感性试验将MDRV和NDRV的RNA标准质控品分别作10倍梯度稀释，MDRV的稀释浓度为2.83×10⁸~2.83×10⁰拷贝/μL；NDRV的稀释浓度为4.32×10⁸~4.32×10⁰拷贝/μL，同时平行普通RT-PCR检测，结果表明双重荧光定量RT-PCR检测方法能检测的MDRV最低浓度达2.83×10¹拷贝/μL， NDRV的最低浓度达4.32×10² 拷贝/μL，二者均比普通PCR检出率高100倍（如表2，表3）。

表2 双重荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR方法检测MDRV灵敏度比较

表3双重荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR方法检测NDRV灵敏度比较

2.5 重复性试验

用所建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法对MDRV病毒RNA标准品浓度为2.83×10⁶-2.83×10¹ copies/μL和NDRV病毒RNA标准品浓度为作为4.32×10⁷-4.32×10² copies/μL模板进行批内试验和批间试验。结果如表4和表5所示，其中MDRV的批内试验变异系数为0.07 ~ 1.12%，批间试验变异系数为0.80 ~1.4%；NDRV的批内试验变异系数为0.75%~1.39%，批间试验变异系数为1.05~1.66；表明所建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的重复性好。

表4 不同浓度MDRV阳性标准品进行重复性检测结果

表5不同浓度NDRV阳性标准品进行重复性检测结果

2.6 对人工感染样品和临床样品检测

用所建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法对20份MDRV和20份NDRV人工感染样品以及40份临床样品进行检测，并与常规PCR检测方法进行比较。结果显示（如表6），人工感染MDRV的20份样品中，所建立的荧光定量RT-PCR检出率为100%，而普通RT-PCR的检出19份，检出率为95%；人工感染NDRV的20份样品中荧光定量RT-PCR检出率为100%，普通RT-PCR的检出18份，检出率为90%。对40份临床样品检测中，所建立的双重荧光定量PCR检测的结果为MDRV 16/40 阳性，检出率为40%；NDRV 20/40 阳性，检出率为50%，其中4份为MDRV和NDRV共感染；普通RT-PCR的MDRV和NDRV临床检出率分别为37%和45%，从临床检测结果看出所建立的双重荧光定量RT-PCR检出率高于普通PCR。

表6 两种检测方法对80份病料检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测试

剂盒

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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cataactgct accaacggtg aaa 23

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<212> DNA

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<400> 3

cttagcaggc tttccc 16

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<212> DNA

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<400> 4

cgatgttagt aaccatgcca actc 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccacagcacc atctcc 16

Claims

1.一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括两对引物和两条探针，具体序列如下：

MDRV-F：5′-CCACCACCGCATATGATGTTG-3′，

MDRV-R：5′- CATAACTGCTACCAACGGTGAAA-3′，

MDRV- probe：5’- FAM-CTTAGCAGGCTTTCCC-3′-MGBNFQ -3’ ，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，淬灭基团为NFQ；及

NDRV-F：5′- CGATGTTAGTAACCATGCCAACTC -3′，

NDRV-R：5′- CTCGACATCATGATCCAAGTTACCT -3′，

NDRV- probe；5’- VIC- CCACAGCACCATCTCC -3′-MGBNFQ -3’，该探针的5’端标记报告荧光基团VIC，淬灭基团为NFQ。