CN112708701B - 用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法 - Google Patents

用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112708701B
CN112708701B CN202110096381.8A CN202110096381A CN112708701B CN 112708701 B CN112708701 B CN 112708701B CN 202110096381 A CN202110096381 A CN 202110096381A CN 112708701 B CN112708701 B CN 112708701B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
seq
primer
real
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110096381.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112708701A (zh
Inventor
李建东
杜珊珊
李阿茜
梁米芳
李德新
王世文
黄晓霞
李川
王芹
孙丽娜
芜为
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention filed Critical National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority to CN202110096381.8A priority Critical patent/CN112708701B/zh
Publication of CN112708701A publication Critical patent/CN112708701A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112708701B publication Critical patent/CN112708701B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法。本发明提供用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒分别或同时实时荧光定量RT‑PCR检测的引物探针组合，其含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑10所示。本发明提供的引物探针组合和检测方法具有高灵敏性和特异性、可重复性好、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染，节约成本等优点，可直接对未知样本里提取的RNA进行检测，可与传统检测方案互补，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。

Description

用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探 针组合、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法。
背景技术
沙粒病毒由外膜和核衣壳组成，呈圆形，含有脂质(外)胞膜，直径约为50-300nm(平均110-130nm)。外膜表面覆盖有一种蛋白组成的、长度约10nm的纤突，内部可见不同数量的来自宿主细胞的核糖体，在电镜下形如沙粒样，沙粒病毒因此而得名。病毒基因组由双向分节段的单股负义链RNA组成，较大的为L片段，长度约7400个核苷酸，编码RNA依赖的RNA聚合酶L蛋白和具有转录复制调节功能的Z蛋白；较小的为S片段，长度约3400个核苷酸，编码核蛋白NP和糖蛋白GP。L和S片段在病毒粒子中并非等量，而是以2：1的摩尔比存在。每个片段上的基因分别被含有发卡结构的非编码区隔开，5’端无帽状结构，3’端序列保守。由于S片段较L片段更为保守，因此常用S片段进行病毒进化研究和分类鉴定。
根据国际病毒学分类委员会(ICTV)2018年最新颁布病毒分类(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)，沙粒病毒科分为4个属：Antennavirus、Hartmanivirus、Mammarenavirus和Reptarenavirus，包含43个种。哺乳动物沙粒病毒属(Mammarenavirus)中35个种可分为旧世界沙粒病毒和新世界沙粒病毒，旧世界沙粒病毒中，代表病毒是淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒简称LCMV病毒。新世界沙粒病毒主要包括有4个clade，clade A有Pirital，Pichinde，Flexal，Parana和Alloahuayo virus五种病毒；cladeB有Junin,Machupo,Guanarito,Amapari,Tacaribe,Sabia,Cupixi和Chapare viruses八种病毒；clade C有Oliveros和Latino两种病毒；clade A/Rec包括有Whitewater Arroyo,Tamiami和Bear Canyo三种病毒；Lujo virus属于新世界沙粒病毒，但不在四个clade中。其中，拉沙病毒(Lassa virus)引起拉沙热，胡宁病毒(Junin virus)引起阿根廷出血热，马秋波病毒(Machupo virus)和查帕雷病毒(Chapare virus)引起玻利维亚出血热，卢约病毒(Lujo virus)引起卢约出血热，瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)引起委内瑞拉出血热，萨比亚病毒(Sabid virus)引起巴西出血热，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)引起淋巴细胞脉络丛脑膜炎。
奥利华斯病毒(Oliveros virus)于1996年在阿根廷雷鼠(Bolomys obscuris)中首次被发现，该病毒主要局限于阿根廷的啮齿类动物中传播；帕腊南病毒(Panara virus)于1970年在巴拉圭米鼠(Oryzomys spp)中首次被发现,病毒主要局限在巴拉圭啮齿类动物中传播；皮钦德病毒(Pichinde virus)于1971年在哥伦比亚白喉稻鼠(Oryzomysalbigularis)中首次被发现，病毒主要局限在哥伦比亚啮齿类动物中传播，已有实验室工作者通过接触实验室气溶胶感染而致病。
病毒病实验室检测主要依靠于病毒分离、血清学特异性抗体检测、抗原检测和病毒核酸检测。病毒核酸检测主要是基于PCR技术，实时荧光定量RT-PCR有着快速、高灵敏度和特异度的优点，是目前运用较多的实验室检测方法。该方法基于荧光共振能量迁移的原理，通过对荧光强度变化监测产物量的变化，随着反应时间的进行，将监测到的荧光信号的变化绘制一条曲线。该方法全程闭管操作，降低了污染的风险；对PCR产物除了可以进行定性分析，也可通过绘制标准曲线进行定量分析。目前尚未有奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏、特异，可检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物探针组合、试剂盒和检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等国际公开数据库中检索下载奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的基因组序列，选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。分别进行整体和局部比对分析，确定各基因序列的分类。根据序列比对分析结果，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析，筛选确定在各病毒基因型中高度保守的靶序列，根据靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列分别如SEQ ID NO.1-6、SEQ ID NO.7-10所示的分别针对奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的三对特异性引物和三条特异性探针，获得检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的实时荧光定量RT-PCR的引物探针组合。
具体本发明的技术方案如下：
本发明提供用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的靶序列组合，其含有三条靶序列，所述靶序列具有如SEQ ID NO.11-13所示的核苷酸序列。
上述靶标序列组合中，奥利华斯病毒的靶序列如SEQ ID NO.11所示，帕腊南病毒的靶序列如SEQ ID NO.12所示，皮钦德病毒的靶序列如SEQ ID NO.13所示。上述序列在各病毒的不同基因型中具有高度的保守性且易于进行PCR扩增，可适用于各病毒不同基因型的高效检测。
本发明提供用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合，其含有三对特异性引物和四条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-10所示。
上述特异性引物和特异性探针中，针对奥利华斯病毒的特异性引物的序列如SEQID NO.1-2所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.7所示；针对帕腊南病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.8所示；针对皮钦德病毒的特异性引物的序列如SEQ ID NO.5-6所示，特异性探针序列如SEQ ID NO.9和10所示。
本发明通过对多种奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的基因组序列进行比对和分析，发现了奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒基因组中的保守序列，针对该保守序列设计的引物和探针在奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的各个基因型中具有很好的普适性，同时还具有较高的特异性和灵敏度。
作为优选，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LC RED640、LC RED705中的任一种；所述荧光淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。
进一步优选地，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.9和10所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。
本发明还提供所述靶序列组合或所述引物探针组合在制备用于检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的试剂盒中的应用。
本发明提供用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的试剂盒，其包含所述引物探针组合。
作为优选，所述试剂盒还包含奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的阳性对照标准品。
所述奥利华斯病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者奥利华斯病毒RNA。所述帕腊南病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或者帕腊南病毒RNA；所述皮钦德病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.13所示的DNA序列对应的RNA或者皮钦德病毒RNA。
进一步优选地，所述试剂盒还包含其它为实现实时荧光定量RT-PCR检测的试剂，包括但不限于反应缓冲液、酶和水等。
本发明所述引物探针组合或所述试剂盒在进行分别实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。采用上述反应程序，能够更好地保证奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的高效扩增检测。
本发明所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。
优选地，所述引物探针组合或所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，水补足至25μL。
本发明提供的引物探针组合可在不同的反应体系中分别进行奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测，也可在同一反应体系中同时进行上述三种病毒的检测。
当在不同的反应体系中分别进行奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测时，以上所述的上游引物为SEQ ID NO.1、3或5所示引物，下游引物为SEQ ID NO.2、4或6所示引物，探针为SEQ ID NO.7或8，或者为SEQ ID NO.9和10所示的探针。
当在同一反应体系中同时进行奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测(三重实时荧光定量RT-PCR)时，以上所述的25μL反应体系中，SEQ ID NO.1、3、5所示的上游引物各0.5μL，SEQ ID NO.2、4、6所示的下游引物各0.5μL，SEQ ID NO.7-10所示的探针各0.25μL。
本发明还提供一种利用实时荧光定量RT-PCR检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒方法，其为以待测样品的RNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-10所示的特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR检测，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒。
以上所述的方法中，待测样品的RNA可采用本领域常规方法提取获得，如离心柱提取法等。
作为优选，所述实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。
作为优选，所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。
进一步优选地，所述实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，水补足至25μL。
作为优选，上述根据扩增曲线判断待测样品中是否含有奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的方法如下：
有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38；
若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<Ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性；
无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。
上述结果判定中，奥利华斯病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.11所示的DNA序列对应的RNA或者奥利华斯病毒RNA。所述帕腊南病毒的阳性对照优选为如SEQ ID NO.12所示的DNA序列对应的RNA或者帕腊南病毒RNA；所述皮钦德病毒的阳性对照标准品优选为如SEQ ID NO.13所示的DNA序列对应的RNA或者皮钦德病毒RNA。
本发明所述的奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的实时荧光定量RT-PCR检测反应体系适用于所有的实时荧光定量PCR仪。
本发明的有益效果在于：
本发明结合相关病原体出现的几率、流行的风险和实验室检测过程的可操作性，形成以奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒为检测靶标的新的组合检测方案。
本发明通过大量序列比对分析确定了奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒高度保守的靶序列，针对确定的靶序列通过大量筛选和优化，分别获得了适用于实时荧光定量RT-PCR检测的特异性引物和探针，该引物和探针在奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的各个基因型中具有很好的普适性，同时具有较高的特异性和灵敏度。
本发明建立了检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的单独实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法可在一个实时荧光定量RT-PCR反应体系内，引入分别或同时针对奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的三对特异性引物和不同标记的探针，通过实时荧光信号的动态变化，对未知样本进行定性分析；也可通过标准参考品的检测，绘制标准曲线，实现对未知模板的定量分析。与其它检测方法相比，本发明提供的检测方法具有高灵敏性和特异性、可重复性好、操作简便、检测时间短、所需样本量少、低污染、节约成本等优点，可直接对未知样本里提取的RNA进行检测，可与传统检测方案互补，在病毒的快速检测中具有较高的应用价值。在奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的早发现、早诊断方面具有重要意义，可用于疑似病例、啮齿类动物、媒介生物筛查检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒。
附图说明
图1为本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的奥利华斯病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。
图2为本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的帕腊南病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。
图3本发明实施例4中实时荧光定量RT-PCR检测不同浓度的皮钦德病毒体外转录RNA模板的扩增曲线图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的特异性引物和探针的设计
1、引物和探针的设计和筛选
在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)等数据库中检索下载奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的基因组序列。选择具有较明确分离日期和地区的较完整病毒基因组序列、标明标准株的基因组序列的病毒基因组序列。评估病毒基因组序列的方向是否需要矫正，去除个别质量差的N碱基序列，查阅相关条目信息资料，确定序列纳入标准为有清楚的病毒分离年代、地区等资料。将序列文件保存成FASTA格式，使用软件嵌入的Clustal W分析模块进行整体比对分析，确定各基因序列的分类，根据序列比对分析结果筛选确定在奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的各个基因型中高度保守的靶序列。
针对上述靶序列设计特异性引物和探针，同时结合病毒基因组序列中DNA聚合酶优先结合位点和最优变性温度的分析进行特异性引物和探针的设计和筛选。本发明经过大量设计、筛选和对比实验发现，并非仅满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现高效特异灵敏的实时荧光定量RT-PCR检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒。本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选，最终得到如下分别针对奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的特异性引物对和特异性探针(序列方向为5’-3’)：
奥利华斯病毒：
特异性引物：
OLIVEROS-F：5’-TGGGTCAAGTCATTGGGTT-3’(SEQ ID NO.1)；
OLIVEROS-R：5’-TTAATGCCACACAGATGAGG-3’(SEQ ID NO.2)；
特异性探针：
OLIVEROS-P：5’-TTCCAATCYTTACCYAACATCATTAATGAGGC-3’(SEQ ID NO.7)；
帕腊南病毒：
特异性引物：
PARANA-F：5’-AGCCTTTAGATCCTTTAGAAGC-3’(SEQ ID NO.3)；
PARANA-R：5’-CTTGACCAGTGCAGTGTT-3’(SEQ ID NO.4)；
特异性探针：
PARANA-P：5’-AGCCATGTGARTACCTACTTTGGTCTTTGAATG-3’(SEQ ID NO.8)；
皮钦德病毒：
特异性引物：
PICHINDE-F：5’-AGGCATTCTTTACCGCAGTG-3’(SEQ ID NO.5)；
PICHINDE-R：5’-CTCTCCCACAACCAATCATTCT-3’(SEQ ID NO.6)；
特异性探针：
PICHINDE-P1：5’-TTGGCTGGTTCACAATGGCTCGTACCTC-3’(SEQ ID NO.10)；
PICHINDE-P2：5’-TGGTTAGTTCACAATGGCTCGTACCTC-3’(SEQ ID NO.9)。
2、引物和探针的合成
上述引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例2实时荧光定量RT-PCR检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测方法的建立
1、病毒核酸的提取收集待测病毒的细胞培养上清，采用QIAamp Viral RNA MiniKit提取病毒核酸。
2、阳性标准品的制备
对于三种病毒，通过合成三种病毒基因的保守区(奥利华斯病毒的保守区序列如SEQ ID NO.10所示，帕腊南病毒的保守区序列如SEQ ID NO.11所示，皮钦德病毒的保守区序列如SEQ ID NO.12所示)作为阳性标准品，将合成的目的基因克隆至pET-28a(+)载体中(酶切位点：NdeⅠ和XhoⅠ)，基因合成与质粒克隆由北京天一辉远生物公司完成。用thermo公司2×PCR Mix试剂对克隆质粒中含有的目的基因进行普通PCR扩增，扩增引物用通用引物T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)和T7t(5’-ACATCCACTTTGCCTTTCTC-3’)。体外转录为RNA，纯化回收定量而获得。采用Qian公司Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化PCR产物，Nanodrop紫外可见分光光度计对回收的DNA模板定量。采用Promega公司Ribomaxtm largescale RNA production system-sf6and T7试剂盒进行目的基因的RNA体外转录，Qian公司RNeasy mini kit对RNA体外转录产物回收。上述操作均按照试剂盒说明进行。
3、实时荧光定量RT-PCR检测
采用AgPath-ID One Step RT-PCR Kit(Ambion)试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR反应，利用实施例1最终获得的特异性引物(序列如SEQ ID NO.1-6所示)和探针(序列如SEQID NO.7-10所示)进行实时荧光定量RT-PCR检测。
本发明通过优化实施例1获得的用于三种病毒检测的特异性引物和探针的反应条件，使其能够实现高效的组合检测，具体反应条件如下：
25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，无RNA水解酶的去离子水补足至25μL；
本发明提供的引物探针组合可在不同的反应体系中分别进行奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测，也可在同一反应体系中同时进行奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测。
当在不同的反应体系中分别进行奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测时，以上所述的上游引物为SEQ ID NO.1、3或5所示引物，下游引物为SEQ ID NO.2、4或6所示引物，探针为SEQ ID NO.7或8所示的探针，或者为SEQ ID NO.9和10所示的探针。
当在同一反应体系中同时进行奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的检测(三重实时荧光定量RT-PCR)时，以上所述的25μL反应体系中，SEQ ID NO.1、3、5所示的上游引物各0.5μL，SEQ ID NO.2、4、6所示的下游引物各0.5μL，SEQ ID NO.7-10所示的探针各0.25μL。
反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min，95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。
4、结果分析和判断
检测结果需根据反应体系中所设置的阳性对照(或检测管内标)、用无RNA水解酶的去离子水作为阴性对照的扩增结果和扩增曲线进行判断。
有效结果判定：阳性对照(或检测管内标)Ct≤35且有扩增曲线，阴性对照管无扩增曲线或CT值>38。
若检测样品管中所测病原体对应荧光通道有扩增曲线且Ct<35，则可判断对应的该病原体检测阳性；若检测样品在检测通道无扩增曲线或Ct>38，可判样品为该病毒检测阴性；若检测样品在检测通道35<Ct<38，为可疑，建议复检，若复检结果Ct<38则可判样品为阳性，若复检结果无扩增曲线或Ct≥38，可判样品为阴性。
无效结果的判定：若检测样品为阴性，则反应体系的阳性对照(或检测管内标)必须为阳性，否则该检验管结果无效，需进行复检。
实施例3实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性分析
以奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒体外转录合成的RNA标准品作为阳性对照，将汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、登革病毒1～4型病毒，鸠宁病毒、Sabia病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒共8种沙粒病毒RNA，和100份健康人血清RNA提取物作为对照病毒，对实施例2提供的检测方法进行特异性分析。
采用实施例2的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，具体处理组设计如下：以奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒体外转录合成的RNA标准品(浓度为1×108copies/uL)为阳性对照；以汉城病毒、汉滩病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、登革病毒1～4型病毒，鸠宁病毒、Sabia病毒、拉沙热病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、查帕雷病毒、卢约病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒共8种沙粒病毒RNA，和100份健康人血清RNA提取物进行特异性验证，结果如表1所示。
表1三种沙粒病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性分析
Figure BDA0002914443790000131
Figure BDA0002914443790000141
实施例4实时荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度(检测限)分析
对实施例2制备的奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒体外转录的RNA(阳性标准品)进行定量，根据如下公式计算RNA拷贝数：Y(copies/μl)＝X(g/μl)×6.02×1023/Transcript length in nucleotides×340，其中Y为RNA拷贝数，X为RNA的浓度。对上述已知浓度的RNA进行10倍系列稀释，对体外转录的奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒标准品RNA稀释成1×108copies/μL至1×101copies/μL共8个浓度梯度。
以上述梯度稀释的不同浓度的RNA为模板，采用实施例2中的检测方法进行实时荧光定量RT-PCR检测，确定实施例2的检测方法的检测限。
各病毒各浓度的扩增曲线如图1、图2和图3所示。以不同浓度样本的拷贝数为横坐标，循环阈值(CT)为纵坐标，制作标准曲线，通过所得标准曲线获得三种病毒各自的单重实时荧光RT-PCR的检出限(表2)，结果表明，本发明的引物探针组合和检测方法具有良好的灵敏度。
表2奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的单重实时荧光定量RT-PCR结果
Figure BDA0002914443790000142
实施例5实时荧光定量RT-PCR检测方法的可重复性分析
分别选取稀释度为1×106copies/μL、1×104copies/μL、1×102copies/μL的三个不同浓度梯度的奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒体外转录RNA标准品为模板，分别进行5次平行重复实验验证实施例2提供的检测方法的稳定重复性。
循环阈值(CT)、变异系数(CV)和标准差(SD)的结果如表3所示，奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒各次检测实验的标准差均控制在0.5以内，变异系数2％以下，说明本发明的检测方法具有较好的稳定性和可重复性
表3奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的稳定性评价
Figure BDA0002914443790000151
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> 用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法
<130> KHP211110052.3
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggtcaagt cattgggtt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaatgccac acagatgagg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctttaga tcctttagaa gc 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttgaccagt gcagtgtt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggcattctt taccgcagtg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctctcccaca accaatcatt ct 22
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttccaatcyt taccyaacat cattaatgag gc 32
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agccatgtga rtacctactt tggtctttga atg 33
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggttagttc acaatggctc gtacctc 27
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggctggtt cacaatggct cgtacctc 28
<210> 11
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agttgtcaac cccctttttg acaaccatta tgggtcaagt cattgggttc ttccaatcct 60
tacccaacat cattaatgag gcactaaaca ttgccctcat ctgtgtggca ttaattgcca 120
tattgaaagg tattgttaac atatggaaat caggtctgat 160
<210> 12
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggtagtgcc tttataattg cacttattaa accaggtctg gcagccttta gatcctttag 60
aagcaagcca tgtgaatacc tactttggtc tttgaatgca ctttcattat gaggtgctct 120
ataacagtgt aagtagttcc cgctttcagg ttggtaaatg gcaagttcca caggatctcc 180
tgctggcccc tctatgtcaa 200
<210> 13
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aactacacaa aattttggta catcaatgac actatcacag gaaggcattc tttaccgcag 60
tgttggctgg ttcacaatgg ctcgtacctc aatgaaacgc atttcaagaa tgattggttg 120
tgggagagcc aaaatctata caatgagatg ctgatgaaag agtatgagga aagacaagga 180
aaaacccctt tggcactgac 200
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
taatacgact cactataggg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acatccactt tgcctttctc 20

Claims (11)

1.用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合，其特征在于，含有三对特异性引物和四条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7-10所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针分别标记产生不同荧光色的荧光基团，所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团；
所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LCRED640、LC RED705中的任一种；所述荧光淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.7所示的特异性探针的5’端标记CY5荧光报告基团，3’端标记BHQ2荧光淬灭基团；序列如SEQ ID NO.8所示的特异性探针的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团；序列如SEQID NO.9和10所示的特异性探针的5’端标记HEX荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。
4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合在制备用于检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的试剂盒中的应用。
5.用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在进行实时荧光定量RT-PCR检测时的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，水补足至25μL。
9.一种利用实时荧光定量RT-PCR检测奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，以待测样品的RNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物和如SEQ ID NO.7-10所示的特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s、60℃退火60s运行40个循环；
和/或，所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系中，上游引物、下游引物和探针的摩尔比为2:2:1。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR的25μL反应体系为：2×缓冲液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.25μL，酶1μL，模板5μL，水补足至25μL。
CN202110096381.8A 2021-01-25 2021-01-25 用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法 Active CN112708701B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110096381.8A CN112708701B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110096381.8A CN112708701B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112708701A CN112708701A (zh) 2021-04-27
CN112708701B true CN112708701B (zh) 2022-10-04

Family

ID=75549534

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110096381.8A Active CN112708701B (zh) 2021-01-25 2021-01-25 用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112708701B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480730B (zh) * 2021-12-16 2023-12-01 山东博思源生物技术有限公司 一种检测鸠宁病毒的raa引物探针及检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305985A (zh) * 2019-06-21 2019-10-08 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种利用三重实时荧光定量rt-pcr检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011011416A1 (en) * 2009-07-21 2011-01-27 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of arenaviruses

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305985A (zh) * 2019-06-21 2019-10-08 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种利用三重实时荧光定量rt-pcr检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
沙粒病毒属四步法一致-简并杂合寡核苷酸引物实时荧光PCR检测体系的建立;胡群等;《中国媒介生物学及控制杂志》;20160630;第27卷(第3期);248-252 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112708701A (zh) 2021-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021174984A1 (zh) 一种新型冠状病毒rt-pcr检测方法及试剂盒
WO2020259210A1 (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒的方法和试剂盒
CN108676920B (zh) 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法
CN110305985B (zh) 一种利用三重实时荧光定量rt-pcr检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和马雅罗病毒的方法
CN116555497B (zh) 用于检测新型冠状病毒的试剂盒和方法
CN110846438A (zh) 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测
CN112538550B (zh) 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用
CN112063764A (zh) 一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光rt-pcr引物探针组合物及试剂盒
CN111534637A (zh) 肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒
CN115852052A (zh) 一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法
CN112708701B (zh) 用于奥利华斯病毒、帕腊南病毒和皮钦德病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法
CN112662816B (zh) 用于阿马帕里病毒、库皮科斯病毒和伊派病毒检测的引物探针组合、试剂盒和方法
CN113718045A (zh) 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用
CN111676316B (zh) 一种快速区分非洲猪瘟病毒基因ii型与其它基因型的引物、探针及其检测方法
CN105838826B (zh) 一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的双色荧光pcr引物、探针及方法
CN112725534B (zh) 用于检测喀山病毒、哈扎拉病毒和伊塞克库尔病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法
CN111235321A (zh) 一种番鸭呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒
CN113481324B (zh) 检测新型冠状病毒及其d614g突变株的方法和试剂盒
CN112662815B (zh) 用于检测塔卡里伯病毒和太米阿米病毒的引物探针组合、试剂盒及方法
CN112662817B (zh) 用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法
CN111826473B (zh) 一种鹅2型星状病毒荧光定量pcr检测的引物对及其应用
CN113913557A (zh) 一种快速检测汉坦病毒seov-s4亚型的试剂盒及其检测方法
CN112746132B (zh) 用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法
CN106521026B (zh) 鉴别isav的双重实时荧光rt-pcr方法及试剂盒
CN115717176A (zh) 一种新型鸭源腺相关病毒实时荧光定量pcr检测的引物、探针及其试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant