CN111826473B - 一种鹅2型星状病毒荧光定量pcr检测的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用，所述引物对的核苷酸序列如下：上游引物：HJ009：5’‑AAACTCAAAATGCTCACCGATG‑3’；下游引物：HJ010：5’‑GACTTGATAAAACTCGCCCCT‑3’。本发明得到引物对的特异性强，对其他常见感染水禽的病毒均无非特异性扩增，灵敏度高，且该引物对具有良好扩增效率，检测范围可达9个数量级，重复性好，批间批内变异系数为0.27％‑0.41％。并将引物对应用在试剂盒中，检测鹅2型星状病毒，能实现定量检测，能帮助了解病毒组织嗜性以及致病性机理，有助于疫苗的研制；另外，本发明中的PCR检测的成本较低，适用于临床大样本检测与监测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用。
背景技术
星状病毒为无囊膜，单股正链RNA病毒，基因组全长约为6.8-7.9 kb。5’非编码区（5’UTR）开始紧接着3个开放阅读框（ORF1a,ORF1b,ORF2）、3’非编码区(3’UTR)以及多聚腺苷酸尾巴，其中ORF1a与ORF1b编码非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白。国际分类学委员会根据感染宿主的不同将星状病毒科划分为两个不同的病毒属：哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属。鹅2型星状病毒作为禽星状病毒的一个新发现的种类，其流行规律尚不明确，高效灵敏的检测方法的建立有利于疾病的诊断与防治及流行规律的探索。目前对鹅2型星状病毒的检测方法主要有传统电镜观察、普通PCR、TaqMan探针荧光定量PCR等。但电镜检测对病毒样本浓度与纯度要求均较高且步骤繁琐成本高昂，不适用临床大样本的检测与监测。普通的PCR检测高效但灵敏度较低，也会导致无法定量。采用TaqMan探针荧光定量PCR具有高效灵敏的特征且可定量，但同样成本高昂不适用于临床大样本的检测与监测。
综上，在鹅2型星状病毒的检测领域，仍然存在亟待解决的上述问题。
发明内容
基于此，为了解决现有技术中普通PCR检测灵敏度低、成本昂贵，不适用于临床大样本检测与监测的问题，本发明提供了一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对及其应用，具体技术方案如下：
一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：
上游引物：HJ009：5’- AAACTCAAAATGCTCACCGATG-3’
下游引物：HJ010：5’- GACTTGATAAAACTCGCCCCT-3’。
进一步地，将所述鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对在制备检测鹅2型星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供一种荧光定量PCR检测的试剂盒，所述荧光定量PCR检测的试剂盒含有所述的引物对。
进一步地，所述荧光定量PCR检测的试剂盒中还包括：标准质粒和荧光定量PCR反应试剂。
进一步地，所述标准质粒的制备如下：
以鹅2型星状病毒cDNA为模板，运用HJ009、HJ010所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与PMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到重组质粒作为标准质粒。
进一步地，所述荧光定量PCR反应试剂包括SYBR Green I Master Mix和ddH2O。
进一步地，所述重组质粒需要在-20℃下保存。
另外，本发明还提供一种利用荧光定量PCR检测的试剂盒检测鹅2型星状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；
S2.将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；
S3.构建荧光定量PCR反应体系进行扩增反应，收集待测样品的荧光信号；
S4.对步骤S3中收集的荧光信号进行数据处理，得到Ct值和扩增曲线，若待检样品的Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，判断为阳性；若待测样品无扩增曲线或无规则扩增曲线，无Ct值，判断为阴性。
进一步地，所述反转录体系20μL，其包括反转录酶1μL、dNTP 1μL、Oligo (dT) 1μL、5X Buffer 4μL、ddH2O 8μL。
进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为20μL，包括SYBR Green I Master Mix 10μL、HJ009 1μL、HJ010 1μL、ddH2O 7μL、cDNA template 1μL。
进一步地，所述扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min；后设置为：温度条件95℃下扩增10s 、温度条件为59℃的下扩增20s、温度条件为72℃下扩增20s、并以此条件以及顺序进行40个循环。
上述方案中采用设计特异性荧光定量PCR扩增引物并建立了检测方法，该方法特异性强，对其他常见感染水禽的病毒均无非特异性扩增，灵敏度高，且该引物对具有良好扩增效率，检测范围可达9个数量级，重复性好，批间批内变异系数均小于2.5%。将该引物对应用于鹅2型星状病毒的检测中，能实现定量检测，能帮助了解病毒组织嗜性以及致病性机理，有助于疫苗的研制；另外，本发明中的PCR检测的成本较低，适用于临床大样本检测与监测。
附图说明
图1是本发明实施例2中的标准质粒的扩增曲线图；
图2是本发明实施例2中荧光定量PCR标准曲线图；
图3是本发明实施例2中荧光定量PCR方法的特异性试验。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“ 及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件。
本发明一实施例中的一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：
上游引物：HJ009：5’- AAACTCAAAATGCTCACCGATG-3’(SEQ ID NO：1),
下游引物：HJ010：5’- GACTTGATAAAACTCGCCCCT-3’(SEQ ID NO：2)。
在其中一实施例中，本发明还提供所述鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对在制备检测鹅2型星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
由于星状病毒核酸有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性上存在一定的差异，在遗传进化时，容易发生变异。本发明中需要检测的是鹅2型星状病毒，为禽星状病毒属的一个新的种，具有变异性大，因此，其检测难度较其它种的星状病毒大。
另外，对于荧光定量PCR检测而言，如何设计引物和探针序列是保证检测有效性的关键。虽然现有技术中有诸多引物设计的软件和引物设计原则等，但要设计得到特异性强、灵敏度高的引物组合，并非是通过引物设计软件就可以简单获得的，这需要技术人员利用其专业知识不断的选择优化靶标区域，再根据优化的靶标区域进行引物设计，以及对设计的引物进行反复筛选，优化，再设计。如何特异性地检测本发明中的鹅2型星状病毒，而避免与其它禽星状病毒发生交叉反应，是本申请引物设计的难点所在，对于星状病毒的检测而言，如何选择靶标区域进行引物和探针设计目前尚无统一的认知。本发明在试验过程中对引物设计的靶标区域进行了优化，得到了本申请中的引物对，可以实现对鹅2型星状病毒的特异性检测。
另外，在其中一实施例中，本发明提供一种荧光定量PCR检测的试剂盒，所述荧光定量PCR检测的试剂盒含有所述的引物对。
在其中一实施例中，所述荧光定量PCR检测的试剂盒中还包括：标准质粒和荧光定量PCR反应试剂。
在其中一实施例中，所述标准质粒的制备如下：
以鹅2型星状病毒cDNA为模板，运用HJ009、HJ010所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与PMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到重组质粒作为标准质粒。
在其中一实施例中，所述荧光定量PCR反应试剂包括SYBR Green I Master Mix和无菌双蒸水。
在其中一实施例中，所述重组质粒需要在-20℃下保存。
在其中一实施例中，所述重组质粒采用紫外分光光度计进行浓度检测，并通过计算公式进行换算。具体为：紫外分光光度计中测定的重组质粒的浓度单位为ng/μL，标准质粒全长为2941 nt 故标准质粒相对分子质量MW为1.94×106（g/mol）；Copy=(m/MW)×6.02×1023，将系列浓度梯度标准质粒在上述荧光定量PCR反应体系中进行扩增，根据标准质粒浓度与Ct值绘制荧光定量线性标准曲线，根据标准曲线计算待检样品中鹅2型星状病毒cDNA浓度。在本发明中能根据RNA提取体系、反转录体系以及荧光定量PCR扩增体系可知待检样品中鹅2型星状病毒病毒粒子浓度（copy/mL）= 400×C（cDNA）(copy/μL)。
另外，在其中一实施例中，本发明还提供一种利用荧光定量PCR检测的试剂盒检测鹅2型星状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；
S2. 将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；
S3.构建荧光定量PCR反应体系进行扩增反应，收集待测样品的荧光信号；
S4.对步骤S3中收集的荧光信号进行数据处理，得到Ct值和扩增曲线，若待检样品的Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，判断为阳性；若待测样品无扩增曲线或无规则扩增曲线，无Ct值，判断为阴性。
在其中一个实施例中，所述反转录体系20μL，其包括反转录酶1μL、dNTP 1μL、Oligo (dT) 1μL、5X Buffer 4μL、ddH2O 8μL。
在其中一实施例中，所述荧光定量PCR反应体系为20μL，包括SYBR Green IMaster Mix 10μL、HJ009 1μL、HJ010 1μL、ddH2O 7μL、cDNA template 1μL。
在其中一实施例中，所述扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min后；设置为：95℃下扩增10s 、59℃的下扩增20s、72℃下扩增20s、并以此条件以及顺序进行40个循环。
为了将引物组适用于临床应用的大样本检测与监测，本发明中优化了荧光定量PCR条件，减少操作，既保证灵敏度，又最大限度降低各种污染，确保结果的科学、精确。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
1）引物的设计与合成：对Genbank数据库中已有的鹅2型星状病毒毒株各个开放阅读框核苷酸序列进行特异性及保守性分析结果显示ORF1b最为保守，ORF2相对变异较大，而ORF1a相对于ORF1b以及ORF2特异且保守，故选取ORF1b保守区域进行荧光定量PCR扩增引物的设计，具体如表1所示：
表1：
将上述制备的引物对经qPCR反应后分别分析其扩增效率、相关系数及其特异性，但结果发现，采用本发明的引物对进行鹅2型星状病毒毒株的检测效果佳，其它的引物均不能有效区分鹅2型星状病毒。
实施例2：
1）试剂盒的制备
本实施例中制备一种荧光定量PCR试剂盒，用于检测鹅2型星状病毒，所述试剂盒中包含：标准质粒、SYBR Green I Master Mix 10μL、HJ009 1μL、HJ010 1μL、ddH2O 7μL、cDNA template 1μL。
标准质粒的制备如下：
以鹅2型星状病毒cDNA为模板，运用HJ009、HJ010所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与PMD18-T载体连接，反应体系为：cDNA片段4μL，pMD18-T载体1μL，SolutionI5μL。反应条件为16℃连接过夜，获得连接产物；将连接产物转化至DH5α感受态细胞，按照常规操作步骤将转化后的感受态细胞均匀涂布于LB-Amp+平板，37℃过夜培养。挑取形态、大小均匀的单个菌落进行培养。通过质粒提取试剂盒按照操作步骤提取质粒，使用pMD18-T通用引物M13F/R进行PCR检测，选取阳性重组质粒，得到实时荧光定量PCR的标准质粒。
2）检测鹅2型星状病毒的方法，包括以下步骤：
S1.运用Trizol法提取待检样品总RNA并洗脱至无酶水中，备用；
S2.将备用的总RNA添加至反转录体系中得到待检测样品的cDNA，作为模板；
S3.构建荧光定量PCR反应体系进行扩增反应，收集待测样品的荧光信号；
S4.对步骤S3中收集的荧光信号进行数据处理，得到Ct值和扩增曲线。
在本实施例中，所述反转录体系20μL，其包括反转录酶1μL、dNTP 1μL、Oligo (dT)1μL、5X Buffer 4μL、ddH2O 8μL
在本实施例中，扩增反应设置的反应程序为：在90-98℃的条件下进行预变性5min后；设置为：95℃下扩增10s 、59℃的下扩增20s、72℃下扩增20s、并以此条件以及顺序进行40个循环。
3）荧光定量PCR标准曲线的绘制：提取标准质粒测量其浓度，并根据公式计算其拷贝数，原始浓度质粒用ddH2O调整至1×10ncopies/μL （n为整数）后再用ddH2O进行10倍梯度稀释。在本实施例中优选为，选取1×109—1×102copies/μL 7个稀释度，以各稀释度质粒标准质粒作为模板，且每个稀释度设置3个重复进行荧光定量PCR扩增。以生成的Ct值作为横坐标，标准质粒浓度的对数作为纵坐标构建标准曲线。结果显示qRT-PCR反应在1×109copies/μL–1×102copies/μL 模板范围内取得良好扩增并具有良好线性关系，标准曲线相关系数(R2)为0.9987斜率为-0.2627，具体可参照附图1以及附图2所示。其中附图1中曲线从左往右为1×109—1×102copies/μL 7个递减稀释度相对于的结果。
4）荧光定量PCR灵敏性：用ddH2O对调整后的标准质粒进行稀释，从1×103copies/μL稀释至1copies/μL，然后以稀释的质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，观察不同拷贝数的扩增效率。灵敏度结果显示当标准质粒稀释至1×101方时仍具有良好扩增效率。
4）荧光定量PCR特异性：向上述制备的荧光定量PCR反应体系中加入鸭肝炎I型病毒（DHV-1）、鸭坦布苏病毒（TUMV）、禽流感病毒H9N2、新城疫病毒（NDV）、鹅细小病毒（GPV）等水禽常见病毒cDNA或DNA为模板分别进行扩增反应，观察有无特异性扩增。特异性结果显示除了鹅2型星状病毒于101copies/μL时仍有良好特异性扩增而鸭肝炎I型病毒（DHV-1）、鸭坦布苏病毒（TUMV）、禽流感病毒H9N2、新城疫病毒（NDV）、鹅细小病毒（GPV）均未出现有特异性扩增。具体可参照图3所示，仅有鹅2型星状病毒在本发明反应体系中出现扩增曲线，其他对照病毒无特异性扩增。本试剂盒具有较强的特异性，与其他鹅源病毒都没有交叉反应。:
应用该试剂盒，进行该试剂盒的特异性试验，结果如上述表2中示，试剂盒对除鹅2型星状病毒外的病毒无反应信号，不能进行有效扩增。
5）荧光定量PCR稳定性：选取1×107、1×106、1×105copies/μL三个已知浓度的标准质粒进行荧光定量PCR扩增反应，每个浓度设置4个重复，比较批内重复值，将3个已知浓度质粒分4次进行荧光定量PCR扩增，比较批间重复值，计算批内、批间重复的变异系数。结果显示批内重复变异系数（CV）为 0.27%-0.41%，批间重复变异系数（CV）为0.36%-0.43% ，批内批间变异系数均小于2.5% 表明构建的荧光定量PCR具有良好的重复性。荧光定量PCR批内重复结果如下表2所示，批间重复结果如表3所示。
表2：
表3：
应用该试剂盒，结果也具有显著的重复性，批间重复变异系数（CV）低于5%，说明本发明的试剂盒具有极高的重复性，即稳定性佳。
实施例3：
临床应用实验
取临床疑似鹅2型星状病毒感染的病鹅肝、肾组织，匀浆，采用Trizol法提取组织总RNA，按照试剂盒操作步骤将RNA反转录成cDNA，放于-20℃保存备用。
在荧光定量PCR管中加入SYBR Green I Master Mix10μL，HJ009 1μL、HJ010 1μL，cDNA模板1μL，双蒸水7μL，反应体系共计20μL。在荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件：95℃预变性5min，扩增40个循环（95℃，10s；59℃，20s；72℃，20s）。
使用实施例1的方法制备标准质粒和制作标准曲线。
结果判定：若待检样品的Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，判断为阳性；若待测样品无扩增曲线或无规则扩增曲线，无Ct值，判断为阴性。
临床实验采用100份试验，结果发现，显示扩增曲线的样品有97份，阳性率为97.00%。对相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带进行胶回收。将目的条带回收产物连接在Pmd18-T载体上，然后转化在DH5a克隆感受态细胞后涂布平板过夜，随机挑取10份单菌落，摇菌3h后，进行菌液PCR，将筛选的阳性菌液进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鹅2型星状病毒片段，说明本申请的检测准确率高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下：
上游引物：HJ009：5’- AAACTCAAAATGCTCACCGATG-3’；
下游引物：HJ010：5’- GACTTGATAAAACTCGCCCCT-3’。
2.权利要求1所述的鹅2型星状病毒荧光定量PCR检测的引物对在制备检测鹅2型星状病毒的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的试剂盒含有权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的试剂盒中还包括：标准质粒和荧光定量PCR反应试剂。
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述标准质粒的制备如下：
以鹅2型星状病毒cDNA为模板，运用HJ009、HJ010所示的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化；将纯化后的扩增产物与PMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆菌株过夜摇菌扩大培养后，得到重组质粒作为标准质粒。
6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应试剂包括SYBR Green I Master Mix和ddH2O。
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